蘭曉霞 葛寶健 李瑞欣 錢曉明 曾原

艾是菊科多年生草本植物，主要包括揮發(fā)油類、黃酮類、桉葉烷類、三萜類、多糖類和微量元素等多種活性成分[1-2]。據(jù)報道，艾葉精油具有鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜、抗氧化、抗真菌、抗炎、抑菌、抗過敏等藥理作用[3-5]。就不同種類艾草中的精油含量而言，蘄艾中精油含量要比湖南產(chǎn)艾葉精油含量高25%左右[6-7]。臨床用于艾灸的艾條或艾絨在使用過程中會產(chǎn)生和排放大量煙霧，不僅存在燙灼傷、呼吸道刺激、火災(zāi)等安全隱患，大量煙塵亦使治療環(huán)境被污染[8-9]。因此，本研究將蘄艾精油通過低溫3D 打印法制備成凝膠緩釋系統(tǒng)，既可使艾草精油在制備過程中減少揮發(fā)，以最大程度避免損失并保持其活性，又能充分利用艾草精油具有抗菌性、促進創(chuàng)面愈合的優(yōu)點，并且可以克服傳統(tǒng)艾灸存在的安全隱患及污染治療環(huán)境等問題。本研究旨在評價不同時間和溫度下，艾草精油凝膠緩釋系統(tǒng)的透皮吸收效果。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

氣相色譜儀（型號：7890B，美國安捷倫科技公司），火焰離子化檢測器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）（型號：7890A，美國安捷倫科技公司），進樣針（型號：10 μL，美國安捷倫科技公司），色譜柱（柱型號：HP-FFAP，30 mm×0.32 mm×0.25 μm），藥物透皮擴散試驗儀（型號：RYJ-6B，上海黃海藥檢儀器有限公司）。

桉葉油醇（95.0%，分析對照品，CAS：470-82-6，C10H18O，密度0.9225%，上海麥克林生化科技有限公司），無水乙醇（99.5%，藥用級，上海麥克林生化科技有限公司），0.9%氯化鈉生理鹽水（國藥準字：H42020475，規(guī)格：0.9%，武漢濱湖雙鶴藥業(yè)有限公司），超純水。課題組研制的“一種通過低溫3D 打印法制備的艾草精油凝膠緩釋系統(tǒng)”（已申報發(fā)明專利）。

SPF 級12 周SD 雄性大鼠[SCKX（京）2019-0008，北京華阜康生物科技股份有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 低溫3D 打印蘄艾精油凝膠緩釋系統(tǒng)的制備

將聚乙烯醇溶解于90 ～100℃的水中，配制成聚乙烯醇水溶液，于乳化劑水溶液中混入艾草精油制作成乳化配制混合液，然后將降至常溫的聚乙烯醇水溶液加入上述混合液攪拌均勻，再裝入低溫3D 打印機料筒，進行低溫3D打印，將打印制備的凝膠重復(fù)3 ～5 次冷凍和解凍循環(huán)后，獲得蘄艾精油凝膠緩釋系統(tǒng)。

1.2.2 皮膚制備

SPF 級12 周SD 雄性大鼠，體質(zhì)量200 ～260 g，10%水合氯醛腹（0.3 mL/kg）行腹腔麻醉，背部皮膚備皮，保證皮膚完整無破損，剪取腰背部皮膚組織約4 cm2，將取下的皮膚平鋪于干凈的玻璃板上，角質(zhì)層朝下，剔除多余的皮下結(jié)締組織，再用0.9%生理鹽水沖洗干凈，展平后置于低溫冰箱保存?zhèn)溆茫?25℃）。實驗前放置于常溫中，自然解凍，并用0.9%生理鹽水浸泡30 min。

1.2.3 析出實驗

將蘄艾精油凝膠緩釋系統(tǒng)分別完全浸沒在5.5 mL 的20%乙醇生理鹽水中，于32℃、35℃、37℃、40℃、42℃，分別恒溫浸泡1、2、3、4 和5 h 后，攪拌均勻后用凍存管分別收集浸泡液50 μL，置于-40℃液氮環(huán)境凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 透皮實驗

采用藥物透皮吸收擴散試驗儀（型號：RYJ-6B，上海黃海藥檢儀器有限公司）進行透皮實驗。剪取3 cm2皮膚組織，按照給藥池、蘄艾精油凝膠緩釋系統(tǒng)、離體大鼠皮膚（角質(zhì)層一側(cè)朝向給藥室）、接收池的順序依次固定。在給藥池和接收池分別加入5.5 mL 的20%乙醇生理鹽水，排空接收池空氣，使蘄艾精油凝膠緩釋系統(tǒng)直接接觸給藥池液體。實驗水浴溫度分別設(shè)定為30℃、32℃、35℃、37℃、40℃、42℃，200 r/h 恒速攪拌，每個溫度分別于不同的透皮時間點（1、2、3、4 和5 h）收集接受池液體50 μL，用凍存管封存，置于-40℃液氮中凍存待測。

1.2.5 氣相色譜分析

本實驗以桉葉油醇（95%，分析對照品，CAS：470-82-6，C10H18O）為外標物，定位蘄艾揮發(fā)油中桉葉油醇的出峰位置。具體步驟：1）取出凍存液，常溫凍融后充分搖勻進行氣相色譜分析，所有樣品凍存時間不超過48 h，防止蔪艾精油有效成分揮發(fā)。2）標準溶液配制：稱取87.5 mg 桉葉油醇標準品，超聲溶解于100 mL 的20%乙醇生理鹽水中，配置濃度為831 μg/mL 標準溶液，氣相色譜分析測定出峰位置并繪制桉葉油醇的面積-濃度標準曲線（圖1）。3）待測樣品中桉葉油醇的峰面積（圖2），根據(jù)標準曲線查得樣品中桉葉油醇的濃度（μg/mL）。4）通過對比相同實驗條件下析出浸泡液和接收液中桉葉油醇的含量，分析該條件下蘄艾精油凝膠緩釋系統(tǒng)的透皮率，透皮率=（透皮吸收液中桉油醇的含量/相同溫度相同時間浸泡析出液中桉油醇的含量）×100%。

2 結(jié)果

2.1 蘄艾精油凝膠緩釋系統(tǒng)析出實驗

以20%乙醇生理鹽水為溶劑，蘄艾精油凝膠緩釋系統(tǒng)隨著浸泡時間的延長，桉葉油醇的濃度逐漸降低。就浸泡溫度而言，浸泡作用時間相同時，35℃～40℃時蘄艾精油凝膠緩釋系統(tǒng)的桉葉油醇析出效果較佳，尤以37℃浸泡液中桉葉油醇的濃度最高。綜合溫度和浸泡時間，蘄艾精油凝膠緩釋系統(tǒng)于37℃恒溫浸泡2 h 時，浸泡液中桉葉油醇的濃度濃度最高，為18.6 μg/mL（表1、圖3）。蘄艾精油凝膠緩釋系統(tǒng)于37℃恒溫浸泡2 h 的氣相色譜圖譜見圖4。

表1 不同時間和溫度蘄艾精油凝膠緩釋系統(tǒng)浸泡析出液中桉葉油醇的濃度（μg/mL）

2.2 透皮實驗

在藥物透收擴散試驗儀（RYJ-6B）的給藥池和接收池均加入20%乙醇生理鹽水5.5 mL，于32℃、35℃、37℃、40℃、42℃時，恒速200 r/min 分別攪拌1、2、3、4、5 h，收集接收池溶液進行氣相色譜測定，氣相色譜測定結(jié)果見（表 2、圖 5）?？梢钥闯鎏I艾精油凝膠緩釋系統(tǒng)接收池中桉葉油醇的濃度在透皮實驗2 h 時濃度最高，之后隨著透皮時間的延長逐漸下降。透皮時間相同時，32 ～37℃時該緩釋系統(tǒng)的透皮接收液中桉葉油醇的濃度逐漸上升，37℃時接收液中桉葉油醇的濃度最高，而隨著溫度的上升，接收液中桉葉油醇的濃度又呈下降趨勢，呈現(xiàn)倒“U”型趨勢。綜合透皮的時間和溫度因素，蘄艾精油凝膠緩釋系統(tǒng)在37℃透皮作用2 h 時，接收液中桉葉油醇的濃度最高，為11.1 μg/mL。該緩釋系統(tǒng)于37℃透皮2 h 時接收池溶液的氣相色譜圖見（圖6）。

表2 蘄艾精油凝膠緩釋系統(tǒng)不同時間和溫度時透皮接收液中桉油醇濃度（μg/mL）

2.3 蘄艾精油凝膠緩釋系統(tǒng)的透皮率

蘄艾精油凝膠緩釋系統(tǒng)的透皮率隨溫度和作用時間的延長，均呈倒“U”型變化。即溫度相同時，隨著透皮作用時間的延長，蘄艾精油凝膠緩釋系統(tǒng)的透皮率從1 h 開始上升，至2 h 透皮率達最高，之后隨著時間的延長透皮效果穩(wěn)步下降（圖7）；而透皮作用時間相同時，從32℃開始，隨著溫度的升高，藥物透皮率穩(wěn)步升高，至37℃透皮效果最好，37 ～42℃時，透皮率逐漸下降（圖8）。綜合上述結(jié)果，在37℃透皮2 h 時，蘄艾精油凝膠緩釋系統(tǒng)的透皮率可達59.48%，透皮效果最佳（表3）。

表3 蘄艾精油凝膠緩釋系統(tǒng)不同時間和溫度的透皮率（%）

3 討論

3.1 蘄艾精油凝膠緩釋系統(tǒng)

艾是我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)常用的草本植物，其中蘄艾是具有代表性的品種之一，植株具有濃烈香氣，全草入藥，有溫經(jīng)散寒、止血安胎等傳統(tǒng)功效。有研究通過水蒸氣蒸餾法對多個不同產(chǎn)地艾葉進行揮發(fā)油提取，發(fā)現(xiàn)蘄艾葉的揮發(fā)油及桉油精的含量最高[9]。

隨著現(xiàn)代材料科學(xué)以及生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，艾草精油的提取技術(shù)不斷改進。王曼笛等[10]發(fā)現(xiàn)以纖維素納米晶為穩(wěn)定劑制備的Pickering 乳液對艾草精油有很好的緩釋作用。翟媛媛等[11]以艾草精油為芯材，以明膠、殼聚糖為芯材制備微膠囊，可以讓艾草精油具有良好的緩釋性能。

本研究采用自主研發(fā)通過低溫3D 打印法制備精油凝膠緩釋系統(tǒng)，該系統(tǒng)常溫下向空氣中緩慢釋放艾草精油，能夠減少艾草精油在制備過程中揮發(fā)造成的損失，在使用過程中消除了傳統(tǒng)艾灸造成的煙霧和的安全隱患，可通過非接觸的方式促進創(chuàng)面愈合，避免了常規(guī)水凝膠貼膏劑對創(chuàng)面的刺激。

3.2 氣相色譜的測定條件

本研究蘄艾精油析出液的氣相色譜測定條件為：柱溫60℃，保持2 min，20℃/min 升到120℃，保持3 min，進樣口200℃，檢測器250℃，氮氣流量1 mL/min，氫氣流量40 mL/min，空氣流量400 mL/min，分流比1 ∶1。為了保證測量結(jié)果的重復(fù)性，每次實驗進樣3 次，每次進樣量為1 μL，取3 次測量結(jié)果平均值為最終測定結(jié)果。根據(jù)相同的色譜條件下峰面積與桉葉油醇含量成正比的原理[12-13]，制訂桉葉油醇的峰面積-濃度標準曲線，該標準曲線的R2=0.998，說明曲線的擬合效果為優(yōu)。根據(jù)待測樣品氣相色譜圖峰面積，由標準曲線計算得出待測樣本中桉葉油醇的濃度。

3.3 蘄艾精油凝膠緩釋系統(tǒng)透皮效果

艾灸藥理主要通過藥物、溫?zé)崤c近紅外光輻射發(fā)揮作用[14-15]。本研究主要研究32℃、35℃、37℃、40℃、42℃5 個較高溫度下，蘄艾精油凝膠緩釋系統(tǒng)的精油成分透皮吸收效果。朱乃甫等[14]發(fā)現(xiàn)艾葉精油的透皮吸收效果在透皮作用時間相同時，隨著溫度的升高，艾葉精油的透皮率大大增加；而溫度固定時，透皮作用時間越長，艾葉精油的透皮率越高。其作用機制主要與分子熱運動增加、皮膚通道打開、局部血管擴張有關(guān)。本研究選擇浸泡時間和透皮作用時間分別為1、2、3、4、5 h 時間點來分析蘄艾精油凝膠緩釋系統(tǒng)的透皮效果。結(jié)果顯示，蘄艾精油凝膠緩釋系統(tǒng)的透皮率在同一溫度下隨著透皮時間的變化呈先上升后下降的趨勢，在同樣透皮時間下，隨著水浴溫度的升高也呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。這與前期研究結(jié)論存在差異[14]。這可能是因為在艾葉精油含量一定的情況下，其透皮釋放過程是存在峰值變化的，如果持續(xù)增加精油的含量來研究溫度和時間對艾葉精油透皮作用的影響，其結(jié)論是與前期研究相符的[14]。尹彬彬[15]研究艾葉精油的提取實驗發(fā)現(xiàn)，浸泡時間與艾葉精油得量呈現(xiàn)先下降后逐漸上升然后下降的趨勢，認為增加浸泡時間并不能有效提高精油含量隨著析出量的增加，艾草中的精油含量降低，這與本研究結(jié)論一致。所以，在艾葉精油含量固定的情況下，綜合透皮作用時間和溫度因素，本課題組研發(fā)的蘄艾精油凝膠緩釋系統(tǒng)在37℃、透皮2 h 時藥物透皮率最大，透皮吸收效果最佳，建議臨床應(yīng)用時，按時更換蘄艾精油凝膠緩釋系統(tǒng)，以保證艾葉精油的持續(xù)性和高透過作用。

3.4 本研究的應(yīng)用前景

現(xiàn)有研究認為，高溫促進蘄艾精油的透皮吸收主要有三種機制：1）分子的熱運動速度隨著溫度的升高而增快，利于促進精油成分的運動過程。2）皮膚通道間隙隨著溫度提高可以增加、變大，皮膚的滲透性能增強。3）局部的皮下組織血管隨著溫度升高發(fā)生擴張，血液循環(huán)有效加快，促進藥物吸收。本研究證實了溫度和時間因素對蘄艾精油凝膠緩釋系統(tǒng)透皮率的影響，表面溫度、時間與艾草精油透皮率均呈倒“U”型變化，證實蘄艾精油凝膠緩釋系統(tǒng)在臨床透皮應(yīng)用的最佳溫度是37℃，最佳作用時間是2 h。

本研究雖然事先評估了凍存液存放時間對桉葉油醇檢測量的影響，確定了凍存液的氣相色譜檢測時間不超過48 h。但由于樣品中桉葉油醇的痕量特點，建議盡可能選擇新鮮的接收液或浸泡液進行氣相色譜檢測，進一步提高結(jié)果的準確性。

本實驗通過將蘄艾精油凝膠緩釋系統(tǒng)浸泡于20%乙醇生理鹽水中，研究32℃、35℃、37℃、40℃、42℃，分別恒溫浸泡1、2、3、4、5 h 后的析出率，然后用SPF 大鼠模擬人體皮膚，研究蘄艾精油凝膠緩釋系統(tǒng)在不同溫度的透皮率，該實驗條件與臨床實用場景相近，便于將基于本緩釋系統(tǒng)的產(chǎn)品直接應(yīng)用于臨床實驗研究。本課題組研制的蘄艾精油凝膠緩釋系統(tǒng)可在常溫下向空氣中釋放艾草精油，但本研究在研究透皮率時，未評估向空氣釋放后蘄艾精油凝膠緩釋系統(tǒng)精油含量的衰減。

本研究前期實驗觀察到本緩釋系統(tǒng)可以通過非接觸促進創(chuàng)面或者感染創(chuàng)面的愈合，提示下一步可研究緩釋系統(tǒng)通過非接觸促進創(chuàng)面或者感染創(chuàng)面愈合的效果，綜合分析緩釋系統(tǒng)的最佳使用條件。