何 帥，劉昱辰，韓秋陽，汪壽騰，謝克難，謝 璐，鄧 怡，楊為中

(1. 四川大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，成都 610065； 2. 中國人民解放軍63820部隊醫(yī)院，四川 綿陽 621051；3. 四川大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，成都 610065； 4. 四川大學(xué) 華西口腔醫(yī)院，成都 610041)

0 引 言

生物陶瓷β-磷酸三鈣(β-TCP)憑借其優(yōu)越的骨誘導(dǎo)性、優(yōu)異的生物相容性、耐腐蝕性能以及與人體骨骼具有相似的結(jié)構(gòu)和性能等諸多優(yōu)點，逐漸成為骨組織修復(fù)領(lǐng)域的首選植入材料之一[1-4]。但是，由于β-TCP本身缺乏殺菌能力，在植入手術(shù)過程中易引起植入體周圍感染(IAI)從而導(dǎo)致植入手術(shù)失敗[5]。細菌感染，尤其是IAI已成為全球人類面臨的嚴重健康威脅[6-8]。用于骨科修復(fù)或受損骨骼重建的合成植入物容易受到細菌入侵，因為在植入物和骨腔之間存在著一個界面，這為細菌滋生提供了空間，繼而引發(fā)骨植入體相關(guān)感染[9-10]。植入過程中β-TCP植入物周圍的病原菌感染則會造成患者繼發(fā)性損傷、植入手術(shù)失敗從而延長患者的治療周期。目前，主流療法是通過使用抗生素用于對抗細菌入侵[11-13]。然而，抗生素的濫用則可能會導(dǎo)致患者體內(nèi)耐藥菌的出現(xiàn)，從而增加治療難度和治療成本[14-17]。因此，現(xiàn)急需一種創(chuàng)新、高效、安全的抗菌方法取代抗生素以對抗IAI。

由于抗菌和成骨是骨缺損再生過程中兩個密切相關(guān)的過程，因此在設(shè)計性能更好的β-TCP植入物過程中，最關(guān)鍵且最具挑戰(zhàn)性的工作是如何平衡兩者之間的關(guān)系[18-19]。植入物的主要修飾方法可分為兩種，其一是通過生物活性金屬對植入體表面進行修飾，另一種是將植入物與功能化材料相結(jié)合[20-23]。近年來，主流的抗菌劑一般是具有殺菌作用的金屬離子(Fe、Ag、Mn、Cu離子等)，其通過破壞細菌膜進入細菌內(nèi)部以殺死細菌[24-25]。同時，輸送到病原菌中的金屬離子會致使細菌內(nèi)蛋白質(zhì)變性和滲漏，干擾其代謝過程并致其失活。其中，具有優(yōu)異抗菌性能的銀納米顆粒(AgNPs)基于以下原因引起了研究人員的廣泛關(guān)注：(1)AgNPs具有較強的滲透性和較大的比表面積；(2)AgNPs具有廣譜抗菌特性，能消滅大部分病原菌；(3)在體液環(huán)境下AgNPs釋放的Ag+可持續(xù)性地殺死細菌；(4)細菌膜與銀離子(Ag+)之間的靜電吸附有助于提高Ag+的殺菌能力；(5)病原體不會對AgNPs產(chǎn)生任何耐藥性。然而，考慮到體內(nèi)環(huán)境的復(fù)雜性，多余的Ag+會帶來嚴重的全身性毒副作用。因此，如何降低Ag+的生物毒性同時不影響其抗菌效果是應(yīng)用AgNPs進行抗菌治療的關(guān)鍵所在。由于仿貽貝聚多巴胺(PDA)具有出色的生物相容性和粘附性，AgNPs可以通過PDA的螯合作用緊密均勻地附著在植入物表面，以減少Ag+的浸出，從而降低其生物毒性[10]。因此，可通過PDA輔助將AgNPs接枝在植入體表面以增強材料抗菌能力。

除了殺菌能力，良好的促組織生長能力對于骨植入材料來說也是極其重要的。因為組織生長的能力將直接影響植入物的成骨效果和長期固定能力[6]。近年來，許多研究結(jié)果表明，一些過渡金屬離子(Cr、Sr、Co、Ni、Fe、Cu離子等)可在細胞內(nèi)通過創(chuàng)造類缺氧微環(huán)境來刺激血管生成和促進組織再生[18]。其中，鈷(Co)元素是人體生理功能中的關(guān)鍵微量元素。鈷離子可以替代血液中的鐵離子穩(wěn)定缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)并促進紅細胞的生成，此外鈷離子還具有強大的抗菌能力。基于Co的這些特性，在本研究中開發(fā)了一種同時具有抗菌和促骨再生能力的Co摻雜材料。

首先，通過壓制成型和煅燒制備了鈷摻雜的β-TCP(Co/β-TCP)，再通過PDA的螯合反應(yīng)將AgNPs接枝在Co/β-TCP表面(Ag@Co/β-TCP)。通過掃描電子顯微鏡(SEM)、能量色散光譜(EDS)、X射線衍射儀(XRD)、傅里葉紅外光譜儀(FT-IR)、接觸角測試儀和X射線光電子能譜(XPS)對材料的組成和表面性質(zhì)進行了表征。以革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌(S.aureus)和革蘭氏陰性菌大腸桿菌(E.coli)為代表菌，測試了Ag@Co/β-TCP植入體的廣譜抗菌能力。與此同時，本研究還探究了該材料的生物相容性和生物毒性。

1 材料和方法

1.1 實驗試劑

四水合硝酸鈣(Ca(NO3)2·4H2O, AR)、六水合硝酸鈷(Co(NO3)2·6H2O, AR)、磷酸氫二銨((NH4)2HPO4, AR)、鹽酸(HCl, AR)、硝酸銀(AgNO3, AR)，氯化鈉(NaCl, AR)和瓊脂(AR)購自成都科隆試劑(中國)；蛋白胨和牛肉提取物購自北京澳寶生物技術(shù)公司(中國)；Tris-HCl緩沖溶液購自北京太陽生物科技公司(中國)；CCK-8試劑盒購自北京博泰生物科技有限公司(中國)。

1.2 樣品制備

鈷摻雜β-TCP(Co/β-TCP)是通過壓制成型和煅燒制備的[22]。簡而言之，將Ca(NO3)2·4H2O(0.1 mol/L)和Co(NO3)2·4H2O(0,0.002,0.005 mol/L)添加到去離子水中并在室溫下攪拌確保Ca(NO3)2·4H2O和Co(NO3)2·4H2O充分溶解。隨后，將7.926 g (NH4)2HPO4快速加入到上述混合溶液中并快速攪拌1 h，使用氨水將混合物的pH值調(diào)至10左右。將所得產(chǎn)品抽濾并用去離子水沖洗，重復(fù)3次。將所得樣品放入60 ℃烘箱中干燥24 h以去除殘留水分。在產(chǎn)品中添加硬脂酸鈉(質(zhì)量比為20%)作為造孔劑，然后將得到的粉末放入直徑為5 mm的模具中，在油壓壓片機中以10 MPa的壓力壓制3 min。最后，將成型的樣品放入馬弗爐中在800 ℃高溫下燒制2 h。

為在植入體表面接枝AgNPs，在37 ℃下將Co/β-TCP浸入到PDA濃度為2 mg/mL的Tris-HCl緩沖液(10 mmol/L, pH = 8.5)中浸泡12 h以得到PDA修飾的Co/β-TCP。用去離子水沖洗上述樣品并干燥后，將PDA修飾的Co/β-TCP在37 ℃下浸入AgNO3溶液(1 mmol/L)中6 h。然后使用去離子水將負載有Ag的Co/β-TCP沖洗3次去除未負載的AgNPs，在空氣中干燥。同時，在本研究中采用與對照組相同的方法制備了不含Co的Ag修飾β-TCP。

1.3 表 征

1.4 體外抗菌試驗

S.aureus和E.coli分別是典型的革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。因此，在本項研究中通過抑菌圈實驗測試了不同樣品(β-TCP, Co/β-TCP, Ag/β-TCP, Ag@Co/β-TCP)對E.coli和S.aureus的抑菌能力。將經(jīng)過紫外線照射滅菌后的樣品固定在涂有200 μL細菌懸浮液(1×106CFU/mL)的Luria-Bertani(LB)固體瓊脂培養(yǎng)基中，在37 ℃下培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈直徑。

1.5 體外細胞實驗

1.5.1 細胞培養(yǎng)

在溫度為37 ℃，含5% CO2的孵育箱中，人骨肉瘤細胞(MG63)在含10%胎牛血清(FBS，Gibco，美國)和1%鏈霉素-青霉素(南京凱基生物技術(shù)公司,中國)的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM，南京凱基生物技術(shù)公司，中國)中培養(yǎng)，每隔一天更換一次細胞培養(yǎng)基。

1.5.2 細胞毒性評估

CCK-8試劑盒測定用于評估MG63的存活率。將培養(yǎng)的細胞以每孔2×104個細胞的密度接種在含有材料的48孔板中。培養(yǎng)1，3，5 d后，用含有10% CCK-8試劑和90%細胞培養(yǎng)基的混合物代替細胞培養(yǎng)基。培養(yǎng)2 h后，從每個孔中提取上述100 μL混合物并添加到酶標板中，使用酶標儀測量混合溶液在λ = 450 nm處的吸光度，以評估細胞的相對存活率。

1.5.3 細胞形態(tài)評價

在該研究中，通過SEM來觀察材料對細胞形貌的影響以評估材料的生物相容性。將細胞以每孔1×104個細胞的初始密度接種在含不同樣品的48孔板中。培養(yǎng)3 d后取出樣品并用磷酸緩沖溶液清洗，在300 μL戊二醛(2.5%)溶液中固定4 h。然后，使用不同濃度的乙醇(30%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%)對細胞進行梯度脫水。隨后，將樣品真空干燥，噴金，并通過SEM觀察細胞的形貌。

2 結(jié)果與討論

2.1 材料的設(shè)計、制造和表征

在這里，為了解決由植入體引起的相關(guān)感染問題和促進骨缺損再生，開發(fā)了一種新型多功能材料(Ag@Co/β-TCP)。如圖1(a)所示，純β-TCP和Co摻雜β-TCP最初是通過壓制成型和煅燒制備的。在pH值為9～10的條件下，PDA可以通過自聚合錨定在大部分固體表面(包括β-TCP)。此外，由于PDA的兒茶酚基團對金屬具有強大的螯合能力，因此AgNPs可以與PDA結(jié)合組裝形成Ag@Co/β-TCP表面的抗菌涂層，以提高Co/β-TCP的抗菌性能，解決IAI問題(圖1(b))。

全站儀作為能夠自動測量距離、角度，自動進行數(shù)據(jù)存儲及處理的測繪儀器，從20世紀70年代初發(fā)明至今，已成為測繪生產(chǎn)單位的最基本儀器，在各種測繪生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用。與傳統(tǒng)測繪儀器一樣，全站儀作為測量距離、角度及坐標的工具，在使用前必須進行檢定，以確認全站儀的精度能否達到出廠標準。

圖1 (a) β-TCP,Co/β-TCP和 (b) Ag@Co/β-TCP的制備流程示意圖Fig.1 Schematic description of the manufacturing of (a) the β-TCP, Co/β-TCP, and (b) Ag@Co/β-TCP

圖2(a)、(b)顯示了由β-TCP粉末經(jīng)過壓制成型和煅燒產(chǎn)生的Co摻雜β-TCP塊狀固體的微觀結(jié)構(gòu)。這些固體由聚集的微晶堆疊在一起，具有微孔結(jié)構(gòu)的陶瓷狀團聚微晶均勻地分散在Co/β-TCP表面(Co含量為2%)(圖2(a))。在Co含量增加后，β-TCP表面(Co含量為5%)上分布著更多的類陶瓷微晶，晶體顆粒的邊界變得模糊，這種多孔結(jié)構(gòu)和粗糙的表面更有利于細胞的粘附和生長[21]。然后，使用EDS光譜用于確定其表面元素組成。圖2(c)顯示β-TCP表面的這些陶瓷狀微晶富含Ca、P和Co元素。此外，2% Co/β-TCP表面和5% Co/β-TCP表面除Co的含量有區(qū)別外，峰并沒有顯著差異。

圖2 2% Co/β-TCP和5% Co/β-TCP的微孔和元素表征：(a) 2% Co/β-TCP表面形貌的SEM；(b) 5% Co/β-TCP表面形貌的SEM；(c) 2% Co/β-TCP和5% Co/β-TCP表面元素的能譜分析Fig.2 Micro-structure and element characterization of 2% Co/β-TCP and 5% Co/β-TCP: (a) SEM for surface morphology of 2% Co/β-TCP; (b) EDS for surface morphology of 5% Co/β-TCP; (c) EDS for the surface element of 2% Co/β-TCP and 5% Co/β-TCP

圖3(a)顯示了β-TCP和Co/β-TCP的XRD圖譜。β-TCP的圖譜與Ca3(PO4)2(PDF#17-0320)的標準卡片非常一致。其衍射峰分別位于27.70°，30.98°和34.29°，可以很好地對應(yīng)于β-TCP的(214)、(0210)和(220)晶面，表明β-TCP的成功制備。摻雜Co后，Co/β-TCP的峰發(fā)生明顯變化。在25.91°，28.00°，31.23°和34.64°附近的主峰指向Co的(1010)、(214)、(0210)和(220)晶面 (JCPDS#49-1081)，明顯的峰移表明加入Co的加入使得β-TCP晶格發(fā)生了膨脹或收縮。

圖3 (a) 對于β-TCP和Co-doped β-TCP的相表征的XRD譜圖；(b) β-TCP和Co-doped β-TCP的FT-IR譜圖；(c)β-TCP和Co-doped β-TCP的WCAFig.3 (a) XRD patterns for phase characterization of β-TCP and Co-doped β-TCP; (b) FT-IR pattern; (c) The water contact angle of β-TCP and Co-doped β-TCP

圖3(b)顯示了不同β-TCP的FT-IR譜圖。β-TCP在557和604 cm-1處的特征峰對應(yīng)于PO43-的面內(nèi)彎曲振動。943 cm-1處的峰與PO43-的對稱伸縮振動有關(guān)，971.96～1 123.28 cm-1與PO43-的不對稱伸縮振動相匹配[25]。值得注意的是，加入Co后PO43-的不對稱伸縮振動發(fā)生了明顯變化，這可能源于β-TCP晶格的膨脹和收縮。此外，在3 443 cm-1處的吸收帶是因為樣品中的殘留水的存在。

β-TCP和Co/β-TCP的表面親水性通過測量WCA來表征，以證明樣品改性對材料表面親水性的影響(圖3(c))。純β-TCP的WCA為46°，而2% Co/β-TCP和5% Co/β-TCP的WCA分別為18°和16°，表明Co的加入對材料表面親水性有正向促進作用。研究表明，親水性的表面有助于細胞粘附和增殖[6,21]，因此可假設(shè)Co的摻入可以促進細胞粘附以提高骨修復(fù)的效率。

2.2 Ag@Co/β-TCP的表征

2.3 體外抗菌能力

正如引言中所假設(shè)的， Ag@Co/β-TCP可以在體液環(huán)境中釋放Ag+和Co2+，破壞細菌內(nèi)蛋白質(zhì)，從而消滅細菌。為了研究Ag@Co/β-TCP的殺菌能力，在本研究中以S.aureus和E.coli作為代表性病原菌，將不同β-TCP材料固定在LB瓊脂板上培養(yǎng)24 h后，細菌抑菌圈結(jié)果如圖5所示。觀察到在Ag@Co/β-TCP與病原菌(S.aureus和E.coli)之間存在著較大的抑菌區(qū)域。相反，在β-TCP周圍沒有明顯的抑制區(qū)。而與β-TCP相比，Co/β-TCP的抗菌能力略有提高。由此可知：(1)β-TCP表面釋放的Ag+和Co2+促進了β-TCP底物的抗菌活性；(2)Co/β-TCP顯示出微小的抑菌圈，表明Co2+不能獨立抑制病原菌；(3)AgNPs的接枝和Co的摻入使β-TCP具有顯著的抗菌活性。此外，對E.coli和S.aureus的抑菌結(jié)果表明Ag@Co/β-TCP具有廣譜殺菌作用。因此，Ag@Co/β-TCP具有在骨缺損修復(fù)的植入過程中建立無菌微環(huán)境的潛力。

圖5 不同β-TCP樣品對E. coli和S. aureus的抗菌性能(虛線圓圈代表材料的抑菌區(qū)域)Fig.5 The different β-TCP-based samples against E. coli and S. aureus (the dotted circles represent the inhibition area)

2.4 Ag@Co/β-TCP的細胞毒性

除了殺菌性能以外，生物相容性也是骨植入材料一個關(guān)鍵性指標。在本研究中通過CCK-8試劑盒來評估各種樣品對MG63細胞的影響。由圖6可知，各組中的細胞數(shù)量隨著時間的增加而增加。相比于β-TCP，由于銀本身具有一定的毒性，在各組中Ag/β-TCP中的細胞增殖性能最弱。與Ag/β-TCP組相反，由于Co2+具有促進組織生長的能力，在Co/β-TCP和Ag@Co/β-TCP組中的細胞表現(xiàn)出更優(yōu)的活性。

圖6 MG63細胞在β-TCP、Co/β-TCP、Ag/β-TCP以及Ag@Co/培養(yǎng)1，3和5天后的細胞活性Fig.6 CCK-8 kits assay of the MG63 cell proliferation on β-TCP, Co/β-TCP, Ag/β-TCP, as well as Ag@Co/β-TCP after culturing for 1, 3 and 5 d

在本研究中通過SEM進一步觀察了各種樣品上的MG63細胞形態(tài)。如圖7所示，在β-TCP上培養(yǎng)的細胞顯示出紡錘狀形狀，細胞邊緣周圍有絲狀偽足。然而，在Ag/β-TCP上培養(yǎng)的細胞表現(xiàn)出極差的細胞形態(tài)。值得注意的是，Ag@Co/β-TCP表面的細胞擴散和形態(tài)比Ag/β-TCP更好，這表明Co的摻入會促進細胞增殖，提升細胞的生物相容性。因此，Ag@Co/β-TCP的殺菌能力并不會影響細胞增殖，具有一定的生物安全性。

圖7 MG63細胞在不同樣品上培養(yǎng)5 d后的SEM形貌圖Fig.7 Morphologies of MG63 detected by FE-SEM after 5 d of culture on different samples

3 結(jié) 論

通過壓制成形和PDA輔助改性成功構(gòu)建了Ag@Co/β-TCP植入物。通過SEM、EDS、XRD、FT-IR、接觸角測試儀和XPS對材料進行了表征，以S.aureus和E.coli作為代表病原菌測試了Ag@Co/β-TCP的抗菌性能，并評估了其生物相容性，結(jié)果表明：

(1)通過SEM、EDS、XRD、FT-IR、接觸角測試儀和XPS等一系列表征結(jié)果表明Ag@Co/β-TCP的成功制備，同時Ag@Co/β-TCP具有促細胞粘附和增殖的潛力。

(2)由于Ag+和Co2+的顯著抗菌特性，在植入過程中Ag@Co/β-TCP可以持續(xù)釋放出Ag+和Co2+從而達到有效抑制病原菌的目的。細菌抑制區(qū)測試表明，在無抗生素的環(huán)境下Ag@Co/β-TCP具有對E.coli和S.aureus持續(xù)性的殺菌活性。

(3)體外細胞實驗證明Ag@Co/β-TCP具有良好的生物相容性，在骨缺損的治療中具有出強大的應(yīng)用潛力。