鄧芳靜 朱杰夫 吳雄飛

腎臟缺血再灌注損傷(renal ischemic reperfusion injury,RIRI)是指腎臟血流中斷后,血流恢復(fù)反而引起腎功能不全和組織損傷加重的現(xiàn)象,是導(dǎo)致急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)的主要原因之一。 組織損傷的程度與血流減少的程度和缺血的持續(xù)時間有關(guān)。 RIRI 是器官移植、休克、膿毒癥、燒傷、心血管疾病和創(chuàng)傷患者常見的并發(fā)癥之一[1～3]。 目前認(rèn)為,組織缺血和隨后的再灌注導(dǎo)致受影響組織的各種代謝改變,包括細(xì)胞三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)水平的降低,細(xì)胞內(nèi)和線粒體鈣水平的增加,活性氧的產(chǎn)生,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,炎癥損傷作用,細(xì)胞凋亡和壞死等[2～5]。 近年來研究發(fā)現(xiàn),自噬和表觀遺傳學(xué)也參與了腎臟缺血再灌注損傷。

自噬由一系列高度保守的細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白(autophagy-related proteins,ATGs)參與并受多種信號通路調(diào)控的過程。 自噬可以通過降解錯誤折疊或聚集的蛋白質(zhì),清除受損的細(xì)胞器(如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和過氧化物酶體)以及消除細(xì)胞內(nèi)病原體,維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境平衡。 自噬包括巨自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬,所有這些都促進(jìn)溶酶體中胞質(zhì)組分的蛋白水解降解[6,7]。 自噬是一個復(fù)雜的過程和調(diào)控機(jī)制,在生理和病理條件下都具有重要意義。 隨著研究的不斷深入,自噬功能障礙與多種疾病發(fā)生、發(fā)展都有關(guān),如衰老、惡性腫瘤、神經(jīng)病變、腦卒中等[8～11]。研究發(fā)現(xiàn),腎臟基礎(chǔ)自噬對于維持腎臟穩(wěn)態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要。 自噬在腎臟疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用,激活自噬可減輕腎臟損傷[12,13]。

表觀遺傳學(xué)是指在不改變DNA 序列的前提下,通過某些機(jī)制引起可遺傳的基因表達(dá)或細(xì)胞表型的變化,其中包括乙?；?、甲基化、磷酸化、磺?；?、泛素化、羰基化和糖基化。 組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferases,HATs)和組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases, HDACs) 介導(dǎo)乙?；腿ヒ阴；痆15]。 HDAC6 是組蛋白去乙?；讣易宄蓡T之一,含有兩個N 端去乙?；Y(jié)構(gòu)域、1 個C 端泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域、1 個強(qiáng)核輸出信號、8 個連續(xù)重復(fù)的十四肽[16]。HDAC6 可以使組蛋白和非組蛋白去乙酰化。 微管具有從維持細(xì)胞形態(tài)到亞細(xì)胞轉(zhuǎn)運,細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo),細(xì)胞遷移和細(xì)胞極性形成的重要功能。 微管對于各種生物過程至關(guān)重要,如炎癥、免疫反應(yīng)、學(xué)習(xí)和記憶等。 微管參與了自噬體的形成、自噬體在細(xì)胞質(zhì)中的運輸以及自溶體的形成。 微管是由α-微管蛋白和β-微管蛋白組成的異二聚體。 α-微管蛋白在自噬中起重要作用。 α-微管蛋白受到各種共價修飾,其中一種修飾是微管蛋白乙?；?它與穩(wěn)定微管結(jié)構(gòu)相關(guān)。 在哺乳動物中,其乙?；街饕搔?微管蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶1 和HDAC6 控制[6,14]。 HDAC6 能與微管結(jié)合,除去α-微管蛋白中的乙?；鶜埢?介導(dǎo)α-微管蛋白乙酰化,從而調(diào)節(jié)微管結(jié)構(gòu)并保持微管完整性[7]。 HDACs 功能異常與腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、炎性反應(yīng)性疾病、腎臟疾病等諸多疾病發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[6,15,17,18]。 目前,HDAC6 參與腎臟缺血再灌注損傷作用的潛在機(jī)制尚不清楚。 本研究中筆者試圖驗證HDAC6 調(diào)控自噬參與了腎臟缺血再灌注損傷,為治療缺血再灌注損傷提供參考依據(jù)。

材料與方法

1.主要材料：小鼠腎小管細(xì)胞BUMPT 購自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院;胎牛血清購自中國四季青公司;高糖培養(yǎng)基購自美國Hyclone 公司;TRIzol 試劑購自美國Invitrogen 公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自中國Servicebio公司;GAPDH 抗體(貨號：10494-1-AP)購自中國Proteintech 公司;acetylated tubulin(Lys40) Monoclonal antibody(貨號：66200-1-lg) 購自中國Proteintech公司;HDAC6 抗體(貨號：ab207612)購自英國Abcam公司;ATG7 抗體(貨號：DF6130)購自中國Affinity 公司;Beclin-1 抗體(貨號：T55092) 抗體購自中國Abmart 公司;LC3 抗體(貨號：3868)抗體購自美國CST 公司;CCK-8 溶液購自中國Servicebio 公司;PE AnnexinⅤ雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自中國安特捷公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng)：將BUMPT 細(xì)胞分為4 組：正常對照組、正常加TA 組、缺氧復(fù)氧組、缺氧復(fù)氧加TA組。 BUMPT 細(xì)胞用含有10% FBS,1% 青霉素和鏈霉素的高糖培養(yǎng)基,在37℃含5% CO2和95% 的空氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 用ATP 耗竭方法制作細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型。

3.動物：體質(zhì)量為20 ～25g 的雄性C57BL/6 小鼠(購自三峽大學(xué))喂養(yǎng)在提供食物和水的12h∶12h的光/暗循環(huán)環(huán)境中。 12 只小鼠隨機(jī)分為對照組(n=6)和缺血再灌注組(n=6)。 缺血再灌注組采用雙側(cè)腎動脈夾閉28min 再灌注24h 的方法建立腎IRI小鼠模型,即戊巴比妥鈉(60mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠,開腹暴露腎臟,夾閉雙側(cè)腎蒂,當(dāng)腎臟由鮮紅色變?yōu)樽虾谏珵槿毖晒?28min 后恢復(fù)血流,由紫黑色變?yōu)轷r紅色為再灌注成功。 本實驗已通過筆者醫(yī)院動物倫理審批[倫理號：WDRM 動(福)第202110707號]。

4.組織學(xué)檢查：將腎臟固定在4%的多聚甲醛溶液中,在一系列不同濃度的乙醇中脫水,石蠟包埋。將石蠟塊切成4μm 切片,HE 染色,光鏡下放大200倍進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。

5.RNA 提取和RT-qPCR 法：按照TRIzol 試劑使用說明書從腎臟中提取總RNA,并使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將1000ng 總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。 根據(jù)試劑盒使用說明書操作,使用UltraSYBR 混合物進(jìn)行PCR檢測。 采用兩步法PCR,程序設(shè)定：95℃變性15s、60℃延伸1min,共40 個循環(huán)。 以GAPDH 基因作為內(nèi)參,通過2-△△Ct法計算目的基因相對表達(dá)量。HDAC6 引物序列：上游引物：5'-TTATGCCCACCTCACCCACCTAC-3',下游引物：5'-GCGATGGACTTGGATGACCTCAC-3'。 GAPDH 引物序列：上游引物：5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3',下游引物：5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'。 實驗獨立重復(fù)3 次。

6.蛋白提取和Western blot 法檢測：將細(xì)胞裂解,提取總蛋白。 采用BCA 法測定蛋白質(zhì)濃度。 通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,然后經(jīng)電泳將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,封閉后將膜與一抗GAPDH 抗體(1 ∶20000)、HDAC6 抗體(1 ∶1000)、acetylated tubulin(Lys40) Monoclonal antibody抗體(1 ∶1000)、ATG7 抗體(1 ∶1000)、LC3 抗體(1 ∶1000)、Beclin-1 抗體(1 ∶1000)在4℃下孵育過夜,洗膜后加入二抗溶液在室溫下孵育60min,使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影。 采用Image J 軟件對蛋白條帶進(jìn)行灰度分析并對蛋白進(jìn)行半定量計算。

7.CCK-8 法檢測細(xì)胞增殖：將對數(shù)期BUMPT細(xì)胞接種在96 孔板中,每組設(shè)置6 個復(fù)孔。 在貼壁生長1 天后,細(xì)胞缺氧復(fù)氧后加入CCK-8 溶液,繼續(xù)孵育2h,用酶標(biāo)儀檢測各孔在450nm 波長處的吸光度值,以吸光度值代表細(xì)胞增殖水平。

8.流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率：將各組BUMPT細(xì)胞接種于6 孔板內(nèi),培養(yǎng)過夜后給予各組相應(yīng)處理后,嚴(yán)格按照PE AnnexinⅤ雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒操作,在流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞凋亡率。 位于右下象限的早期凋亡細(xì)胞和位于右上象限的晚期凋亡細(xì)胞之和記錄為凋亡細(xì)胞。

9.統(tǒng)計學(xué)方法：使用GraphPad Prism 9.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析與繪圖;兩組比較采用t檢驗;多組采用多因素方差分析,以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.HDAC6 在小鼠腎缺血再灌注損傷后高表達(dá)：如圖1 中A、B 所示,與假手術(shù)組比較,缺血再灌注組的血清肌酐、尿素氮顯著升高。 與正常組比較,缺血再灌注組的腎臟組織病理學(xué)改變包括近端小管細(xì)胞壞死和脫落、刷狀邊緣消失、細(xì)胞碎片積累、腎小管擴(kuò)張和蛋白管型形成(圖1C)。 通過RT-qPCR 法和Western blot 法檢測HDAC6 的表達(dá)水平。 結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比較,缺血再灌注組中HDAC6 蛋白(圖1D)和HDAC6mRNA(圖1E)表達(dá)均顯著升高(P＜0.05)。

圖1 HDAC6 在缺血再灌注組呈高表達(dá)(n =6)

2.TA 可以減輕缺氧復(fù)氧導(dǎo)致的細(xì)胞損傷,增加細(xì)胞活力：用CCK-8 檢測正常+ DMSO 組、正常+TA 組、缺氧復(fù)氧+ DMSO 組、缺氧復(fù)氧+ TA 組增殖情況,結(jié)果顯示,缺氧復(fù)氧組相對正常組吸光度值降低,表示細(xì)胞增殖活力降低;而缺氧復(fù)氧+ TA 組,吸光度值相對于缺氧復(fù)氧+DMSO 組增高,表示細(xì)胞增殖活力增強(qiáng)(圖2A)。 利用流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡,結(jié)果顯示, 缺氧復(fù)氧組相對正常組細(xì)胞凋亡增多;而缺氧復(fù)氧+ TA 組細(xì)胞凋亡減少(圖2 中B、C,P＜0.05)。

圖2 不同組細(xì)胞活力及凋亡情況

3.HDAC6 抑制劑促進(jìn)α-微管蛋白乙?；篧estern blot 法檢測4 組細(xì)胞中α-微管蛋白乙酰化表達(dá)水平。 結(jié)果顯示,與正常組比較,在缺氧復(fù)氧組細(xì)胞中α-微管蛋白乙?；磉_(dá)降低,表明HDAC6表達(dá)增加,可以抑制α-微管蛋白乙酰化水平;而缺氧復(fù)氧+TA 組,α-微管蛋白乙?；皆龈?表明HDAC6 抑制劑可促進(jìn)α-微管蛋白乙酰化(圖3,P＜0.05)。

圖3 各組細(xì)胞α-微管蛋白乙?；磉_(dá)水平

4.HDAC6 抑制劑增強(qiáng)自噬：通過Western blot 法檢測4 組細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果顯示,與正常組比較,在缺氧復(fù)氧組細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin-1、ATG7 表達(dá)增加,表明在缺氧復(fù)氧時細(xì)胞自噬激活;而缺氧復(fù)氧并加入抑制劑TA 組,自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin-1、ATG7 表達(dá)水平相對于單純?nèi)毖鯊?fù)氧組增強(qiáng),表明HDAC6 抑制劑可增強(qiáng)自噬(P＜0.05,圖4)。

圖4 不同組織細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平

討 論

HDAC6 是Ⅱb 類組蛋白去乙酰酶,調(diào)節(jié)許多重要的生物過程,HDAC6 的異常表達(dá)也與各種疾病的發(fā)展有關(guān),例如癌癥、神經(jīng)退行性疾病、炎癥性疾病以及腎臟疾病[19～21]。 有研究指出,HDAC6 與組蛋白和非組蛋白底物相互作用,參與基因轉(zhuǎn)錄、DNA 損傷修復(fù)和細(xì)胞運動。 HDAC6 的表達(dá)增加或活性增強(qiáng),導(dǎo)致致癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和有絲分裂。 使用HDAC6 抑制劑可用抑制腫瘤的發(fā)展。 另有研究認(rèn)為,HDAC6 抑制劑能保護(hù)和營養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞,誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞分化,對多種神經(jīng)退行性疾病都有潛在治療效果[19]。

有研究表明,選擇性HDAC6 抑制劑可以抑制炎癥信號通路和減輕內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肺炎[20]。 Shi等[21]研究顯示,在甘油注射誘導(dǎo)橫紋肌溶解小鼠中,HDAC6 表達(dá)增加,使用HDAC6 選擇性抑制劑TA 可顯著降低血清肌酐和血尿素氮水平,減輕腎小管損傷,表明HDAC6 可能促進(jìn)橫紋肌溶解誘導(dǎo)的AKI,而HDAC6 抑制劑對AKI 具有治療潛力。 本研究通過Western blot 法和RT-qPCR 法檢測發(fā)現(xiàn),在缺血再灌注組小鼠腎臟中HDAC6 表達(dá)增加。 通過CCK-8及流式細(xì)胞術(shù)可以發(fā)現(xiàn)缺氧復(fù)氧組細(xì)胞活力降低及凋亡增加,而使用HDAC6 抑制劑可以增加細(xì)胞活力減少細(xì)胞凋亡。 α-微管蛋白是細(xì)胞分裂、形成、運動和細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運所必需的蛋白。 α-微管蛋白乙?；脚c疾病密切相關(guān)。 在Zhang 等[22]研究中,證明了HDAC6 抑制劑能增加α-微管蛋白乙?；?減輕腦缺血再灌注損傷。 Western blot 法檢測發(fā)現(xiàn),在缺氧復(fù)氧組α-微管蛋白乙酰化水平降低,而使用HDAC6 抑制劑可以增加α-微管蛋白乙?；?。

腎臟細(xì)胞的基礎(chǔ)自噬對于維持腎臟穩(wěn)態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要。 自噬失調(diào)能促進(jìn)急性腎損傷和急性腎損傷后腎臟不完全修復(fù),以及各種各樣的慢性腎臟疾病,包括糖尿病腎病、局灶節(jié)段性腎小球硬化癥和多囊性腎病變[23～25]。 有研究提出,自噬受損,增加腎細(xì)胞對糖尿病相關(guān)損傷的易感性,會促進(jìn)糖尿病的進(jìn)展[25]。 本研究發(fā)現(xiàn),缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)了腎小管上皮細(xì)胞自噬,增加了LC3、Beclin-1、ATG7 表達(dá)。 使用HDAC6 選擇性抑制劑TA,可進(jìn)一步增強(qiáng)缺氧復(fù)氧組細(xì)胞LC3、Beclin-1、ATG7 表達(dá),這表明抑制HDAC6可增強(qiáng)自噬,促進(jìn)腎小管細(xì)胞存活。 α-微管蛋白參與了自噬體的形成、自噬體在細(xì)胞質(zhì)中的運輸以及自溶體的形成。 有研究報道,HDAC6 可抑制α-微管蛋白乙?；?影響自噬形成,導(dǎo)致心肌損傷[26]。因此在缺血再灌注損傷中,阻斷HDAC6,減輕腎功能損傷可能與增加α-微管蛋白乙?；健⒃鰪?qiáng)自噬有關(guān)。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn),在缺血再灌注損傷的腎臟組織和缺氧復(fù)氧的腎小管上皮細(xì)胞中HDAC6表達(dá)上調(diào),使用抑制HDAC6 選擇性抑制劑TA,可促進(jìn)缺氧復(fù)氧細(xì)胞中α-微管蛋白乙酰化和自噬相關(guān)蛋白表達(dá),減少細(xì)胞損傷。 因此,HDAC6 抑制劑可能具有治療腎臟缺血再灌注損傷的潛在臨床意義。