郭宇晴

（深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測研究院，廣東深圳 518000）

隨著科技的飛速發(fā)展，我國轉(zhuǎn)基因技術(shù)趨于成熟，在食品生產(chǎn)的多鏈條環(huán)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。但是，轉(zhuǎn)基因食品在滿足食品供需及經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)，也可能在食品基因改造過程中帶來安全隱患，威脅人們的身體健康?，F(xiàn)階段，我國對(duì)轉(zhuǎn)基因食品安全性評(píng)價(jià)方面有著明確的規(guī)定，其中《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)管理辦法》明確要求，我國境內(nèi)全部從業(yè)轉(zhuǎn)基因生物研究、生產(chǎn)等工作的組織都必須進(jìn)行安全評(píng)價(jià)工作。為了能夠更清楚地了解轉(zhuǎn)基因食品的安全質(zhì)量，我國對(duì)此類食品進(jìn)行特殊監(jiān)管，并運(yùn)用科學(xué)有效的方式進(jìn)行成分檢測，以保障食品安全性和規(guī)范性。其中，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是非常常見的一種。該技術(shù)可以根據(jù)對(duì)熒光信號(hào)的分析，獲取生物性狀中相關(guān)成分的含量情況。由此可見，研究熒光定量PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因食品檢測領(lǐng)域的運(yùn)用對(duì)于食品行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展以及保障人們食品安全來講尤 為重要。

1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的基本原理

1.1 實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)的產(chǎn)生

PCR技術(shù)現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用在食品成分檢測工作中，但仍存在很多問題，其主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：①難以確保數(shù)據(jù)的精準(zhǔn)度；②很容易在檢測的過程中出現(xiàn)數(shù)據(jù)不符、假陽性等狀況；③PCR技術(shù)主要使用的是轉(zhuǎn)基因技術(shù)最終的產(chǎn)品。針對(duì)以上情況，相關(guān)人員進(jìn)行了優(yōu)化與完善，實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)便應(yīng)運(yùn)而生。在PCR設(shè)備上安裝檢測裝置，可以在檢測過程中精準(zhǔn)地分析產(chǎn)品中的EB參數(shù)，為后續(xù)檢測工作提供數(shù)據(jù)支持。

定量PCR技術(shù)在傳統(tǒng)工作原理的基礎(chǔ)上，對(duì)DNA、雜交等技術(shù)進(jìn)行了融合，可以實(shí)時(shí)監(jiān)測PCR參數(shù)進(jìn)而分析熒光信號(hào)的強(qiáng)弱情況。目前，該技術(shù)在優(yōu)化與完善的過程中，已逐漸趨于成熟，不僅能夠進(jìn)行定量分析，還能夠充分發(fā)揮高靈敏度等優(yōu)勢，進(jìn)而更好地應(yīng)用在生物、食品檢測工作中。

1.2 熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理

實(shí)時(shí)熒光技術(shù)的工作原理是熒光共振能量轉(zhuǎn)移，具體指當(dāng)熒光基因與基團(tuán)之間存在一定距離時(shí)便會(huì)出現(xiàn)能量轉(zhuǎn)移，并在光的作用下呈現(xiàn)熒光反應(yīng)，若基團(tuán)與淬滅基因產(chǎn)生了分離，則不會(huì)繼續(xù)產(chǎn)生熒光。在此基礎(chǔ)上，要求工作人員在進(jìn)行檢測前選擇合理的基團(tuán)，并有針對(duì)性地應(yīng)用該技術(shù)[1]。

1.3 定量原理

1.3.1 基本原理

在PCR技術(shù)應(yīng)用過程中，DNA參數(shù)會(huì)隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)上升，技術(shù)人員不僅可以利用熒光信號(hào)原理對(duì)數(shù)據(jù)變化進(jìn)行分析，還可以對(duì)DNA模板進(jìn)行定量分析。熒光閾值是指將PCR技術(shù)應(yīng)用之前的熒光信號(hào)作為基礎(chǔ)信號(hào)，通常來講，其初始設(shè)置是5～15個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)差的倍數(shù)。在具體工作中，會(huì)將檢測出的熒光信號(hào)作為可信信號(hào)，進(jìn)而確定一個(gè)Ct參數(shù)，也就是技術(shù)應(yīng)用過程中的閾值循環(huán)。不同的Ct值參數(shù)與模板之前的拷貝對(duì)數(shù)呈反比關(guān)系。因此，在具體工作中，可根據(jù)起始拷貝情況制定出標(biāo)準(zhǔn)曲線，若是已知Ct值則也可計(jì)算出拷貝數(shù)。

1.3.2 常用方法

從化學(xué)的層面來看，PCR技術(shù)可分為探針與非探針兩種，前者指利用探針對(duì)產(chǎn)物增加情況加以體現(xiàn)，而非探針則是利用熒光染料。其中SYBB Green染料是一種有效的熒光顏料，在檢測出dsDNA時(shí)會(huì)產(chǎn)生顏色。在性狀分開的環(huán)境中，則不會(huì)出現(xiàn)熒光反應(yīng)。對(duì)于延伸情況來講，技術(shù)人員通過對(duì)反應(yīng)液的檢查分析熒光信號(hào)強(qiáng)度，但這種檢測形式很容易出現(xiàn)假陽性，因此需要對(duì)精準(zhǔn)度進(jìn)行科學(xué)管理。

CSMV探針方式則是使用熒光物質(zhì)進(jìn)行檢測，通常情況下，5端的熒光基團(tuán)會(huì)在探針使用過程中被分離，進(jìn)而產(chǎn)生熒光，通過對(duì)熒光強(qiáng)度的檢測可以清楚了解產(chǎn)物增量狀況?，F(xiàn)階段這種技術(shù)雖能滿足需要，但成本較高，且容易受其他外在因素影響。除此之外，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方式還包括分子信標(biāo)檢測等。

2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因食品檢測中的應(yīng)用

2.1 相對(duì)定量與絕對(duì)定量

PCR技術(shù)現(xiàn)已在轉(zhuǎn)基因食品檢測中被廣泛應(yīng)用，但不同國家所制定的閾值情況有一定差別。在實(shí)時(shí)熒光技術(shù)的應(yīng)用過程中，需先進(jìn)行定量處理，其中相對(duì)定量指待測樣本中靶序列相對(duì)于另一種參照數(shù)量之間的變化情況，根據(jù)定量的形式則可以更快確定Ct值。在具體工作中，可以通過比較Ct值的方式進(jìn)行定量分析，該方法是指在同一環(huán)境下進(jìn)行PCR測試，通過對(duì)比兩個(gè)PCR反應(yīng)中的Ct數(shù)據(jù)值，判斷轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中的成分含量。在測試工作中運(yùn)用比值法可減少標(biāo)準(zhǔn)曲線建立的難度，但由于這種方式是以靶基因與內(nèi)源控制物的擴(kuò)增情況為基準(zhǔn)，對(duì)拷貝數(shù)進(jìn)行合理估計(jì)，在實(shí)際工作中，所得數(shù)據(jù)通常會(huì)大于實(shí)際情況，可能存在一定的誤差[2]。

絕對(duì)定量是指根據(jù)已知曲線情況推斷樣本量情況。與相對(duì)定量不同，絕對(duì)定量需要工作人員先根據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)構(gòu)建體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，完成后根據(jù)系統(tǒng)的運(yùn)用了解拷貝數(shù)情況，以構(gòu)建曲線。此過程中標(biāo)準(zhǔn)品既可以為dsDNA，也有可能是合成DNA，能確保數(shù)據(jù)的真實(shí)性和準(zhǔn)確性。最為常見的標(biāo)準(zhǔn)品是質(zhì)粒DNA，可在對(duì)樣品進(jìn)行處理后進(jìn)行PCR反應(yīng)。將拷貝數(shù)作為X值，Ct值為Y值便可以繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在定量過程中，若無法確認(rèn)數(shù)值，則需根據(jù)樣品的Ct數(shù)值，判斷標(biāo)準(zhǔn)樣品中的拷貝數(shù)。雖然這一技術(shù)形式難度較大，但近幾年來應(yīng)用效果依舊較好。

2.2 選擇目標(biāo)序列

轉(zhuǎn)基因檢測過程中的定量分析通常是針對(duì)轉(zhuǎn)基因生物中的外源序列，包括多種數(shù)據(jù)參數(shù)，例如目的基因等。針對(duì)不同種類的生物情況，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的PCR監(jiān)測形式不同。

通用序列是指調(diào)控基因序列，包括CaMV35S等，但這種形式由于經(jīng)常被應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因食品中，且很多序列情況在自然情況下便存在，因此只是作為一種初步測試形式。而基因特異性則是指基因內(nèi)部序列的一種，是一種天然的基因序列，是最為常見的一種基因檢測方式，但不同外部基因在植物生長過程中體現(xiàn)的形式存在一定的差異，因此這種特異性的檢測方式不能在相同形狀中的轉(zhuǎn)基因植物中檢測使用。結(jié)構(gòu)特異性序列是指連接外源基因中的區(qū)域序列，具有較強(qiáng)的特異性特征，但由于相同基因的表達(dá)載體在轉(zhuǎn)化的過程中有多種拷貝形式，在植物基因檢測的過程中往往也會(huì)存在相似的轉(zhuǎn)基因品系，以至于這種形式不能應(yīng)用在具有相同性狀的轉(zhuǎn)基因植物中[3]。

品系特異性序列是指外界序列形式與轉(zhuǎn)基因植物中的一種基因邊界序列，是外部基因與植物基因之間的一種區(qū)域序列，且序列形式是單拷貝形式，因此在使用過程中在精準(zhǔn)度方面具有顯著的優(yōu)勢。目前，為了降低轉(zhuǎn)基因檢測過程中基因選擇等方面的難度，降低出現(xiàn)假陽性的概率，品系特異性序列的檢測形式被廣泛應(yīng)用。

3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因食品檢測工作中的發(fā)展形勢

實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)的應(yīng)用已經(jīng)能夠攻克大多數(shù)轉(zhuǎn)基因檢測工作中的難點(diǎn)，應(yīng)用前景較為良好。現(xiàn)階段，很多技術(shù)人員利用軟件對(duì)PCR技術(shù)應(yīng)用數(shù)據(jù)進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測與分析，從根本上提升數(shù)據(jù)的精準(zhǔn)度。在此過程中，多類PCR儀器也逐漸出現(xiàn)在市場中，短時(shí)間內(nèi)便可完成樣品檢測。

在轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)不斷發(fā)展的過程中，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品種植范圍也越來越大，市場占比也隨著增大。因此，必須要確保檢測方式的運(yùn)用質(zhì)量，同時(shí)要求制定一套完善的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)體系，針對(duì)過去的體系內(nèi)容進(jìn)行優(yōu)化與完善。過去，PCR技術(shù)運(yùn)用中需制作標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測對(duì)比，而標(biāo)準(zhǔn)品的制作通常是將轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因材料進(jìn)行調(diào)和配制而成。目前，市場上最常見的產(chǎn)品是轉(zhuǎn)基因玉米、大豆等，隨著植物種類增加，很多標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建已經(jīng)變得越來越難，在一定程度上影響了轉(zhuǎn)基因研究工作的進(jìn)行。此外，傳統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)品通常只能進(jìn)行單體基因情況測定，而質(zhì)粒體系的建立可制造更符合條件的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，為后續(xù)監(jiān)測工作提供幫助[4]。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)可在運(yùn)用過程中打破傳統(tǒng)測定技術(shù)中轉(zhuǎn)基因食品定量測定方面的阻礙，進(jìn)而從原有的相對(duì)變量檢測形式向更加精準(zhǔn)的絕對(duì)變量轉(zhuǎn)變。但在技術(shù)發(fā)展過程中，由于基因技術(shù)應(yīng)用的復(fù)雜性，很多新型的復(fù)合狀轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品也已經(jīng)出現(xiàn)。此外，傳統(tǒng)的檢測技術(shù)在標(biāo)準(zhǔn)品制作方面通常會(huì)針對(duì)一種成分進(jìn)行檢測，因此在未來技術(shù)運(yùn)用過程中也需加大對(duì)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的重視?？偠灾?，當(dāng)前轉(zhuǎn)基因食品檢測中運(yùn)用PCR技術(shù)可將檢測工作從定性提升至定量，以達(dá)到成分檢測的目的。未來要不斷對(duì)轉(zhuǎn)基因食品檢測技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化與升級(jí)，提升對(duì)成分檢測的精準(zhǔn)度，進(jìn)而為轉(zhuǎn)基因食品產(chǎn)業(yè)提供安全保障[5]。

4 結(jié)論

綜上所述，實(shí)施熒光定量PCR技術(shù)對(duì)于食品成分檢測來講非常重要，不僅能提高檢測效率，還能精準(zhǔn)進(jìn)行成分監(jiān)測，進(jìn)而服務(wù)市場監(jiān)管與提升食品產(chǎn)業(yè)化。未來，政府部門及相關(guān)機(jī)構(gòu)需進(jìn)一步加大對(duì)該技術(shù)的運(yùn)用，助力轉(zhuǎn)基因食品檢測工作高質(zhì)量發(fā)展，為我國轉(zhuǎn)基因食品安全監(jiān)管保駕護(hù)航。