曾榕，刁麗梅

(1.廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧 530001；2.廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023)

癲癇是因腦部神經(jīng)元同步異常放電所導致的慢性大腦功能失調(diào)綜合征，以短暫性、反復癇性發(fā)作為特征，主要表現(xiàn)為認知功能障礙、運動抽搐、自主神經(jīng)功能紊亂等，其與腦內(nèi)興奮性/抑制性神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)失衡、神經(jīng)膠質(zhì)細胞功能失常、病理性神經(jīng)環(huán)路建立、離子通道基因突變、神經(jīng)炎癥、遺傳、免疫等諸多因素相關[1]。流行病學資料分析顯示，全球約有7 000萬的癲癇患者，活動性癲癇的患病率為(4～12)/1 000，同時每年新發(fā)癲癇的患病率為(16～51)/10 萬，癲癇發(fā)病率在欠發(fā)達國家是發(fā)達國家的兩倍之多[2-3]。現(xiàn)今癲癇的主要治療手段以抗癲癇藥物(antiepileptic drugs，AEDs)為主，盡管西醫(yī)治療癲癇療效顯著，但長期應用可存在焦慮抑郁障礙、共濟失調(diào)等副作用，約有30%的患者因療效欠佳、耐受性差而發(fā)展成為難治性癲癇(refractory status epilepticus，RSE)。而中醫(yī)藥治療癲癇具有療效穩(wěn)定、毒副作用少、患者依從性高等優(yōu)勢，能有效控制癇性發(fā)作及延長發(fā)作間期?，F(xiàn)代藥理研究表明，動物類中藥含有豐富的蛋白多肽類成分，具有抗炎、抗凝、抗驚厥、抗纖維化、改善腦組織等多方面的作用，有利于改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀[4-5]，順應臨床亟需副作用更小，效果更穩(wěn)定的抗癇藥物應用需求。近年來，中醫(yī)藥治療越來越受到抗癲癇研究領域的廣泛關注，為進一步探究中藥在治療癲癇方面的作用，本文對應用于抗癇研究的動物藥中蛋白多肽類成分的作用機制進行闡述，為研發(fā)新型抗癇藥物和了解癲癇的病理機制提供新的思路和方法。

1 蛋白多肽類成分的來源與作用機制

1.1 蛋白多肽類成分的來源

多肽是指100個氨基酸以下的大分子物質(zhì)，既是多個氨基酸通過肽鍵連接而成的短鏈蛋白質(zhì)，也是蛋白質(zhì)水解的中間產(chǎn)物。通常10個以內(nèi)氨基酸組成的肽叫做寡肽，超過10個氨基酸組成的肽稱為多肽，50個以上氨基酸脫水生成的多肽為蛋白質(zhì)。

天然活性多肽主要源自于各類動植物及海洋生物、微生物，目前在脊椎動物研究中最為廣泛。在哺乳動物體內(nèi)，肽類物質(zhì)主要來自于外周臟器或中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)，如生長抑素和神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y，NPY)共同參與癲癇的發(fā)病機制，NPY作為重要的神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)因子可以影響CNS本身的分化與發(fā)育，并在大腦的不同部位發(fā)揮著調(diào)節(jié)作用，在海馬組織內(nèi)以降低神經(jīng)元興奮性為主，而在外周神經(jīng)系統(tǒng)中常與去甲腎上腺素共存，參與心血管活動的中樞性調(diào)節(jié)過程[6]?，F(xiàn)代藥理研究表明，蛋白多肽類成分是動物藥發(fā)揮獨特療效的重要物質(zhì)基礎，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中具有抗驚厥、鎮(zhèn)靜、改善腦代謝等作用[5, 7]。經(jīng)化學加工后提取的多肽化合物，具有生物活性強、免疫原性低、分子質(zhì)量小、選擇特異性高、易于合成與修飾、不易產(chǎn)生耐藥性等特點。此外，該成分直接來源的中藥還具有易獲得、毒副作用小、臨床療效確切、炮制工藝完備等優(yōu)勢，在抗癇新藥的開發(fā)與應用中具備探索前景。

1.2 蛋白多肽類物質(zhì)透過血腦屏障的作用機制

血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)由腦微血管內(nèi)皮細胞、星型膠質(zhì)細胞、周皮細胞、基膜緊密連接而成，是維護中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)性和功能性屏障。該神經(jīng)膠質(zhì)膜的高度致密性使細胞旁轉(zhuǎn)運受到限制，阻礙和控制血液中的物質(zhì)進入腦組織，僅有2%的親脂性小分子物質(zhì)(分子量<500 Da)可以穿過血腦屏障到達中樞神經(jīng)系統(tǒng)，其余98%的小分子物質(zhì)和近100%的大分子均無法通過[8]。這在維持內(nèi)環(huán)境的相對恒定的同時，給藥物開發(fā)和靶向治療帶來極大挑戰(zhàn)，因為藥物必須首先能通過血腦屏障，并在大腦中達到一定的血藥濃度方可調(diào)節(jié)相應的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療靶點。而能否透過血腦屏障阻礙進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)受藥物的分子量大小、親水性強弱、脂溶性高低、蛋白質(zhì)結(jié)合力強弱及特定電荷相互作用的影響。多肽作為內(nèi)源性的生理活性物質(zhì)，具有易于合成和修飾、生物兼容度高、免疫原性低、特定受體親和度高、組織細胞間穿透力強、成本低廉等特點，僅需很少量的肽類物質(zhì)就能跨越血腦屏障轉(zhuǎn)運到中樞神經(jīng)系統(tǒng)來誘發(fā)一系列的生理效應[9-10]。以這些多肽作為載體轉(zhuǎn)運工具，能夠以非侵入性方式將神經(jīng)治療藥物輸送到腦實質(zhì)，降低腦損傷或神經(jīng)功能障礙的風險。

大多數(shù)多肽跨越血腦屏障的機制是非飽和的跨膜擴散，其滲透程度主要取決于藥物的脂溶性，如脂溶性較強的δ-促睡眠肽、阿片肽及其類似物更容易穿過血腦屏障，并具有更強的生理活性[9, 11]。如低濃度、強脂溶性的內(nèi)皮-單核細胞激活多肽Ⅱ釋放入腦實質(zhì)，可以抑制SE大鼠腦海馬區(qū)的血管生長，改善內(nèi)皮細胞間的緊密連接，有利于控制急性期癲癇的發(fā)作[12]。

蛋白多肽類成分透過血腦屏障的轉(zhuǎn)運機制主要包括以下幾種。一是載體介導的主動轉(zhuǎn)運：載體介導的轉(zhuǎn)運蛋白對化學修飾結(jié)構(gòu)具有高度選擇性，只能轉(zhuǎn)運與內(nèi)源性底物具有相似分子結(jié)構(gòu)和大小的藥物。轉(zhuǎn)運蛋白在管腔一側(cè)識別底物，然后底物-轉(zhuǎn)運蛋白結(jié)合系統(tǒng)觸發(fā)載體蛋白自外而內(nèi)的構(gòu)象變化，底物順濃度梯度輸送到細胞膜的開腔側(cè)以實現(xiàn)跨膜轉(zhuǎn)運。但有一些小分子肽例如胰島素、亮氨酸腦啡肽、β淀粉樣多肽等，可以通過飽和轉(zhuǎn)運系統(tǒng)來透過血腦屏障[13]。二是受體介導的細胞轉(zhuǎn)運：多種蛋白質(zhì)通過受體介導的內(nèi)吞作用透過血腦屏障，常見的內(nèi)源性受體主要有胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、低密度脂蛋白等。受體介導的轉(zhuǎn)運具有強烈親和力、高度選擇性及靶向特異性，在腦內(nèi)皮細胞管腔側(cè)的循環(huán)中，配體與特定的受體結(jié)合，受體-配體復合物通過囊泡運輸機制到達細胞內(nèi)腔，配體在溶酶體作用下從復合物中解離并釋放到腔外間隙完成轉(zhuǎn)運，受體則循環(huán)到內(nèi)皮細胞腔內(nèi)側(cè)。這種機制的傳輸具有單向性、飽和性、耗能性，可以增強生物制劑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的富集效應，提高血藥濃度[14]。三是吸附介導的細胞轉(zhuǎn)運：吸附介導轉(zhuǎn)運的親和力較低，選擇性較差，但擁有更高的結(jié)合能力。多聚陽離子蛋白，或含有陽離子序列的合成肽中帶正電荷的部分與腦內(nèi)皮細胞表面帶負電荷的部分相互作用，靜電結(jié)合能力的大小決定了胞吞作用的強弱。在阿爾茨海默病中，陽離子蛋白作為配體，通過吸附鐵螯合劑將其轉(zhuǎn)運至腦實質(zhì)中與鐵離子結(jié)合，抑制脂質(zhì)過氧化和蛋白質(zhì)降解，有效發(fā)揮神經(jīng)保護作用[15]。因此，多肽陽離子化可以促使治療藥物透過血腦屏障，增加腦內(nèi)生理性攝取量。

血腦屏障/多肽/調(diào)節(jié)蛋白相互作用形成了一種腦外周組織通信手段，建立起穩(wěn)定的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周循環(huán)之間傳遞信息分子的管道，同時這些分子物質(zhì)受到生理變化的影響，在疾病狀態(tài)下發(fā)生病理改變。針對這些特異性變化，研發(fā)相應的中樞神經(jīng)系統(tǒng)性藥物，能夠?qū)Πd癇、腦水腫、持續(xù)神經(jīng)功能障礙等神經(jīng)退行性病變產(chǎn)生積極的治療效果。

2 含蛋白多肽類成分動物藥的抗癇作用與機制

2.1 全蝎

全蝎(Scorpion)，是鉗蝎科動物東亞鉗蝎的干燥全體，歸肝經(jīng)，具有息風鎮(zhèn)痙、通絡止痛和攻毒散結(jié)的功效，常用于治療肝風內(nèi)動、痙攣抽搐、小兒驚風等病癥，是我國傳統(tǒng)的抗癇中藥材[16]。全蝎的有機活性組分構(gòu)成多樣，包括蝎毒、硫磺酸、棕櫚酸、膽甾醇、銨鹽等，其中蝎毒是蛋白質(zhì)和多肽的混合物，神經(jīng)毒素多肽成分含量豐富。據(jù)報道，全蝎提取物肽類能夠通過抑制大腦皮層N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR)結(jié)合活性，延緩戊四唑(PTZ) 誘導的癲癇小鼠模型的發(fā)作[17]?？拱d癇肽(anti-epilepsy peptide，AEP)是從蝎毒液中提取的生物活性多肽之一。該多肽由61個氨基酸殘基組成，分子量為8.3kDa，屬于長鏈抑制性神經(jīng)毒素。AEP對電壓門控鈉離子通道具有調(diào)節(jié)作用，影響動作電位的發(fā)生[18]。AEP的分子量較小，可通過血腦屏障抑制NMDAR的過度激活，同時與25kDa突觸體相關蛋白結(jié)合誘導腦組織中抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA的釋放，恢復中樞神經(jīng)網(wǎng)絡的興奮性/抑制性系統(tǒng)平衡，緩解癲癇的驚厥和痙攣癥狀[19]?，F(xiàn)已證實，全蝎中AEP抗癲癇和預防復發(fā)的治療效果佳，藥物依賴性低，具有潛在的臨床應用前景。

2.2 蜈蚣

蜈蚣(Centipede)，是蜈蚣科動物少棘巨蜈蚣的干燥體，臨床上可用于治療癲癇、驚厥、抽搐等[16]。蜈蚣毒素提取液預防癲癇發(fā)作易感性可能與調(diào)控海馬內(nèi)腦啡肽表達來降低海馬興奮性有關[20]。蜈蚣毒素信號肽Rh Tx可激活感覺神經(jīng)元痛覺受體TRPV1，引起細胞內(nèi)Ca2+濃度升高，介導星形膠質(zhì)細胞炎癥表達，從而提高神經(jīng)元興奮性加速癲癇發(fā)作[21-22]。NTX-Ssm97成熟肽是從蜈蚣毒液中分離出來的一種選擇性抑制哺乳動物Nav1.7通道的生物活性肽，可阻斷外周傷害性刺激信息傳入中樞，是開發(fā)鎮(zhèn)痛、解痙藥物的良好分子靶標[23]。蜈蚣多肽毒素靶向離子通道，參與調(diào)節(jié)機體多種生理或病理過程，這可能是應用于開發(fā)癲癇免疫治療及拓寬抗炎藥物選擇的一種先導途徑。

2.3 地龍

地龍(Earthworm)，是矩蚓科動物參環(huán)毛蚓、威廉環(huán)毛蚓等的干燥全體，具有清熱止痙、平肝熄風的功效，臨床常用于治療高熱神昏、驚癇抽搐、肢體麻木等癥[16]。地龍中含有豐富的蛋白質(zhì)和多肽，如抗微生物蛋白、鈣調(diào)素結(jié)合蛋白、脂類蛋白、抗菌肽等，其中能有效發(fā)揮神經(jīng)保護作用的蛋白多肽類成分質(zhì)量分數(shù)不低于50%[24]。蚯蚓菌素是一種結(jié)構(gòu)類似于防御素的多肽，具有神經(jīng)保護和神經(jīng)營養(yǎng)作用，能夠減輕小膠質(zhì)細胞介導的神經(jīng)炎癥反應，抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)治療藥物所誘導的細胞凋亡[25]。AEDs在治療孕婦、嬰兒和幼兒的癲癇發(fā)作時，可呈劑量依賴性產(chǎn)生相應的神經(jīng)毒性，誘導大腦發(fā)育過程中的神經(jīng)細胞凋亡進而發(fā)生腦損傷，或并發(fā)認知功能障礙及智力下降[26]。故對于長期使用AEDs維持治療的癲癇患者，設計針對不同大腦發(fā)育階段的抗癇治療方案，輔助中藥神經(jīng)保護療法，促進腦內(nèi)神經(jīng)營養(yǎng)因子信號傳遞，致使療效最大化，避免或最大限度地減少上述易受傷害年齡組的神經(jīng)毒性副作用。

2.4 僵蠶

白僵蠶(Mulberry Silkworm)，是由球孢白僵菌感染的家蠶(4～5齡家蠶)干燥幼蟲，含有蛋白質(zhì)和多肽、脂肪酸、黃酮、甾體、多糖等多種化合物，具有顯著的抗驚厥和抗癲癇作用[16]。僵蠶蛋白提取物具有兩面性，既能通過抑制脂質(zhì)過氧化和保護抗氧化酶，促進淀粉樣β蛋白誘導的星形膠質(zhì)細胞毒性沉淀，引起膠質(zhì)細胞功能異常，誘導癲癇的發(fā)生發(fā)展[27]；又可通過調(diào)控γ-氨基丁酸信號通路，降低谷氨酸對神經(jīng)生長因子刺激的PC12神經(jīng)元樣細胞模型損傷，發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護作用[28]。經(jīng)高效液相色譜法-串聯(lián)質(zhì)譜法分析，僵蠶蛋白酶解多肽由低于10個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量在500～1 000之間[29]，更易于透過血腦屏障阻礙進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮抗驚厥、抗凝的藥理作用。故隨著對僵蠶蛋白質(zhì)、多肽組分的深入研究，將其進一步應用于開發(fā)抗癲癇藥物具有廣闊前景。

2.5 羚羊角

羚羊角(Antelope Horn)，是?？苿游镔惣恿缪虻慕?，屬于貴重中藥材，主入肝經(jīng)，長于平肝、息風、解痙，用于肝風內(nèi)動之驚厥抽搐者，如妊娠子癇、高熱痙厥、癲癇發(fā)狂等癥[16]。完整的羚羊角包括角殼和骨塞兩部分，羚羊角塞以水煎、濃縮和透析所得的大分子蛋白質(zhì)成分 (分子量16 kDa以上, 主要為68 kDa左右) 具有一定的解熱、鎮(zhèn)痛和鎮(zhèn)驚作用[30]，羚羊角肽主要來自于角蛋白，動物角在胃腸道極端環(huán)境下被降解后析出特異性生物活性肽，通常每個活性肽分子含有不超過20個氨基酸殘基，肽的分子量越低，它們越有可能通過腸道屏障來發(fā)揮生物學作用[31-32]。蔡際群[33]在遺傳性癲癇動物模型-京都震顫大鼠的海馬和皮質(zhì)安插電極觀察其腦電波變化，發(fā)現(xiàn)羚羊角方可以劑量依賴性方式抑制震顫大鼠每次癲癇小發(fā)作持續(xù)時長，及減少發(fā)作次數(shù)，從而有效改善腦電圖情況。與丙戊酸鈉對比，停藥后具有藥效半衰期長，毒副作用小的優(yōu)點，有利于延長癇性發(fā)作間期。因羚羊數(shù)量銳減，市場價格居高不下，現(xiàn)臨床多使用山羊角替代，蛋白質(zhì)組學研究表明二者生物活性高度相似，在胃腸道消化酶作用下釋放多肽或溶解蛋白來發(fā)揮療效[32]。對于長期需依賴藥物治療的癲癇患者而言，在保證療效的同時又能有效緩解經(jīng)濟壓力，并且提高瀕危藥用動物替代品的開發(fā)力度，對保護生物多樣性具有重要意義。

2.6 麝香

麝香(Abelmusk)，是鹿科動物林麝成熟雄體香囊中的干燥分泌物，屬芳香開竅藥，具有通關利竅、醒腦通絡的功效[16]，臨床常與息風解痙藥物配伍，共奏熄風化痰、開竅醒神之功來改善癲癇患者的精神狀況。麝香的化學成分極其復雜，包括麝香酮及其類似物、類固醇和蛋白質(zhì)。麝香中蛋白質(zhì)多肽類化合物通過減少中性白細胞及其顆粒內(nèi)容物的釋放、抑制活性脂質(zhì)成分合成、降低游離鈣素水平等方式影響中性粒細胞的功能，從而發(fā)揮抗炎作用[34]。在天然麝香中可分離出有效抗炎蛋白Mu-a-1[35]，Mu阿片受體能抑制小白蛋白中間神經(jīng)元末梢釋放GABA ，維持海馬體CA1區(qū)神經(jīng)回路穩(wěn)態(tài)[36]，有利于調(diào)節(jié)癲癇發(fā)作引起的免疫炎癥反應。因天然麝香稀缺名貴，市售中成藥多采用人工麝香，因缺乏統(tǒng)一的質(zhì)量評估體系，臨床療效參差不齊，采用高效液相色譜法-串聯(lián)質(zhì)譜法分析對比天然麝香與人工麝香提取物中的胰蛋白酶多肽，發(fā)現(xiàn)二者含量模式存在顯著差異[37]，將蛋白質(zhì)作為麝香的質(zhì)量評價指標，有利于開發(fā)優(yōu)質(zhì)天然麝香替代品制成中成藥廣泛應用臨床。

2.7 牛黃

牛黃(Cow-Bezoar)，是?？苿游稂S牛或水牛的膽囊、膽管或肝管中的結(jié)石，功善清心豁痰，涼肝熄風，開竅醒神，常用于治療熱病神昏、中風痰迷、驚癇抽搐、癲癇發(fā)狂等[16]。因本品極珍貴，現(xiàn)多以人工牛黃和體外培育牛黃替代品入藥，膽汁酸是牛黃的主要活性成分之一，具有抗炎、抗癌、抗病毒、退熱、免疫功能保護等作用，是評價牛黃及其代用品質(zhì)量的重要指標[38]。AEDs丙戊酸及其活性代謝產(chǎn)物能通過干擾膽汁酸穩(wěn)態(tài)引起肝毒性[39]，牛黃膽汁酸是一種強抗氧化劑，可能通過中止氧化應激反應來修復肝臟膽汁酸合成和轉(zhuǎn)換途徑，促進膽汁排泄，從而起到保護肝細胞的作用[40]，與抗癇藥物協(xié)同使用可緩解其肝臟毒性。體外培育牛黃發(fā)揮抗驚厥作用可能通過保護CA3區(qū)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)作用，抑制苔狀纖維側(cè)支生芽，阻斷異常神經(jīng)回路形成，使癲癇波發(fā)放減少，腦電圖評分改善，進而減少癲癇發(fā)作次數(shù)[41]。天然牛黃多用于臨床急危重癥，千金難求，不作為普適性藥物使用，或可聯(lián)合初期抗癇一線藥物使用于RSE，不失為一種更安全有效的臨床治療手段。

3 小結(jié)

癲癇是世界上第二大中樞神經(jīng)系統(tǒng)性疾病，以早期診斷不及時、藥物治愈率低、易于反復發(fā)作等為諸多病患所苦。目前，癲癇的治療以AEDs為主，起效快、藥效強，但容易引起耐藥性癲癇的產(chǎn)生，以及共濟失調(diào)、焦慮抑郁障礙、肝腎功能損害等不良反應的伴生。中藥治療癲癇具有療效穩(wěn)定、毒副作用少、患者依從性高等優(yōu)勢，能有效控制癇性發(fā)作及延長發(fā)作間期，提高患者生活質(zhì)量。雖然中藥治療癲癇起效慢，臨床常需協(xié)同AEDs使用，但我國中藥資源豐富，許多具有抗癇活性的蛋白多肽成分均源自于中藥，以動物藥居多，含量高，毒性低，具有顯著的抗癇作用，其抗癇機制主要包括調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)及受體、調(diào)節(jié)離子通道、抗神經(jīng)元氧化損傷、調(diào)控炎癥因子及凋亡相關基因的表達等多重途徑。而蛋白多肽類成分因為易于合成和修飾、生物兼容度高、免疫原性低、特定受體親和度高、組織細胞間穿透力強、成本低廉、性能安全、穩(wěn)定等特點，能夠通過血腦屏障/多肽/調(diào)節(jié)蛋白相互作用形成一種腦外周組織聯(lián)系管路，將治療藥物高度富集于腦實質(zhì)內(nèi)，調(diào)控相應的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療靶點，目前在治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中受到廣泛關注。因此，隨著多肽技術(shù)、中藥炮制工藝等現(xiàn)代生物技術(shù)的研究與發(fā)展，從中藥中開發(fā)具有抗癇活性的蛋白多肽類成分用于治療癲癇有良好的前景，能為癲癇的臨床診斷與治療提供有力的佐助。

目前針對動物藥蛋白多肽類成分的研究也存在一些問題，考慮其成分復雜，僅有少量能夠被完全分離純化并確定氨基酸序列，空間結(jié)構(gòu)解析不足，且蛋白多肽類成分多為親水性大分子，由于胃腸道不穩(wěn)定、滲透性低、血清半衰期短等，直接口服生物利用度不足，難以達到臨床起效標準。故從動物藥中提取該類成分作為治療性多肽，提高生物口服利用度具有一定的研究潛力。臨床中多以中藥復方或中藥復方聯(lián)合AEDs治療癲癇，少以單藥起效。中藥復方具有多成分、多靶點、多通路的綜合藥理作用，大部分中藥動物藥與諸藥配伍后經(jīng)過煎煮、濃縮，最終制成相應的湯藥或中成藥來發(fā)揮功效，其是否會改變動物藥中蛋白多肽類成分的主要起效方式，從而影響最終的治療效果值得深究，故需要有特定的研究方法和手段去探索動物藥中如蛋白多肽類成分、小分子化合物等發(fā)揮療效的重要物質(zhì)基礎，以期解決中藥動物藥在臨床使用及推廣中的科學問題。