楊藝清，王愛，崔楠，張俊哲，李昭

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，沈陽 110001）

心血管疾病是多種遺傳因素和環(huán)境因素之間復(fù)雜相互作用的結(jié)果［1］，常見的致死性心血管疾病包括缺血性心臟病、高血壓性心臟病、心肌病、心力衰竭等。全球衛(wèi)生政策目標(biāo)之一是到 2025 年將非傳染性疾病導(dǎo)致的早期死亡率降低 25%［1］。因此，研究心血管疾病的機(jī)制具有重要的科學(xué)和社會學(xué)意義。

RNA修飾的類型包括N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）、N1-甲基腺苷、5-甲基胞嘧啶、假尿嘧啶核苷、N6，2’-O-二甲基腺苷［2］和N7-甲基鳥苷［3］等。哺乳動物 mRNA 的最廣泛修飾m6A已引起科研工作者的廣泛關(guān)注。通常m6A 嵌入在5’-RRACU-3’的保守序列中，它主要發(fā)生在3’-非編碼區(qū)的起始段，靠近翻譯終止密碼子［4］。如今，對m6A修飾與疾病關(guān)系的研究越來越廣泛和深入，腫瘤領(lǐng)域是熱點(diǎn)之一，但關(guān)于 m6A 修飾與心血管疾病關(guān)系的研究較少。

本文概述了m6A RNA甲基化修飾的關(guān)鍵酶及動態(tài)調(diào)節(jié)過程，重點(diǎn)闡述了m6A RNA甲基化在心血管疾病中的研究進(jìn)展，討論了 m6A RNA甲基化新技術(shù)，為心血管疾病的預(yù)防和治療提供新的思路。

1 m6A RNA甲基化

m6A修飾的RNA是指RNA分子腺嘌呤的N6甲基化，甲基化過程中存在3種關(guān)鍵酶：甲基化轉(zhuǎn)移酶、去甲基化酶和甲基化閱讀蛋白。

1.1 甲基化轉(zhuǎn)移酶

甲基化轉(zhuǎn)移酶主要有甲基轉(zhuǎn)移酶樣3（methyltransferase-like 3，METTL3）、甲基轉(zhuǎn)移酶樣14（methyltransferase-like 14，METTL14）、甲基轉(zhuǎn)移酶樣16、Wilms 腫瘤1相關(guān)蛋白［5］等成分。

METTL3和 METTL14可以形成穩(wěn)定的復(fù)合物，該復(fù)合物可以在體外和體內(nèi)催化m6A RNA的表觀遺傳學(xué)修飾，Wilms 腫瘤 1 相關(guān)蛋白本身沒有甲基轉(zhuǎn)移酶活性，但可以與METTL3和METTL14的復(fù)合物結(jié)合［6］，這三者共同定位于核小點(diǎn)中，在基因表達(dá)和選擇性剪接的調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用。

1.2 去甲基化酶

去甲基化酶的作用是去除RNA上的m6A修飾，這個(gè)過程顯示了m6A修飾的動態(tài)性和可逆性。去甲基化酶主要包括脂肪肥胖相關(guān)蛋白（fat mass and obesity associated protein，F(xiàn)TO）和烷烴化修復(fù)同系物5（AlkB homolog 5，ALKBH5），這2個(gè)分子是 α-酮戊二酸依賴性雙加氧酶家族的一部分［7］。m6A去甲基化可以通過Fe2+和α-酮戊二酸依賴性方式催化。隨著FTO和ALKBH5表達(dá)的下降，mRNA中的m6A修飾增加。

FTO與人類肥胖有一定關(guān)系，被認(rèn)為是肥胖易感基因，它通過能量消耗和攝入的機(jī)制影響體質(zhì)量指數(shù)［8］。FTO催化的m6A去甲基化可以調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性、降解和翻譯的效率，進(jìn)而控制蛋白的表達(dá)水平。研究［9］表明，F(xiàn)TO是中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)正常發(fā)育必需的酶，證實(shí)了α-酮戊二酸依賴的雙加氧酶家族的突變會導(dǎo)致嚴(yán)重的多畸形綜合征。

富含鐵和2-氧戊二酸依賴性核酸加氧酶的AlkB家族有一個(gè)名為ALKBH5的成員，研究［10］報(bào)道，ALKBH5可催化m6A去甲基化。ALKBH5參與一系列關(guān)鍵的生物過程，如細(xì)胞周期、代謝和細(xì)胞凋亡。

1.3 甲基化閱讀蛋白

m6A甲基化閱讀蛋白的主要功能是識別被m6A修飾的堿基，調(diào)節(jié)RNA的加工、運(yùn)輸、翻譯和穩(wěn)定性［11］。截至目前，已發(fā)現(xiàn)的m6A閱讀蛋白有YTH家族（YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1、YTHDC2）［12］、HNRNP家族（HNRNPA2B1、HNRNPC、HNRNPG）、IGF2BP家族（IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3）［13］等。

YTH RNA結(jié)合蛋白2是第一個(gè)特征性m6A閱讀器。YTH RNA結(jié)合蛋白1最開始與終止密碼子附近的m6A位點(diǎn)結(jié)合，然后與翻譯起始區(qū)結(jié)合，以提高哺乳動物中特定RNA的翻譯效率［14］。YTH RNA結(jié)合蛋白3在翻譯和穩(wěn)定性的初始階段起著至關(guān)重要的作用［15］。不均一核糖蛋白家族C參與前體 mRNA加工和選擇性剪接，不均一核糖蛋白家族G調(diào)節(jié)靶mRNA的選擇性剪接和豐度［16］。胰島素樣生長因子2 mRNA結(jié)合蛋白作為m6A閱讀器位于細(xì)胞質(zhì)中，優(yōu)先識別m6A修飾的mRNA，它可以增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定性并提高翻譯效率［17］。

2 m6A RNA甲基化修飾與心肌肥大

心肌細(xì)胞可以通過變得肥大來適應(yīng)血流動力學(xué)壓力，該反應(yīng)具有改善心臟功能、減少心室壁張力和氧氣消耗的作用。心臟肥大可分為生理性和病理性兩種類型。生理性心臟肥大可以維持正常的形態(tài)，給心臟帶來有益的作用，主要是由于運(yùn)動訓(xùn)練或懷孕引起的。相反，病理性心臟肥大會帶來許多心血管病理生理變化，如心室重構(gòu)、纖維化和心臟基因表達(dá)改變。

HINGER等［18］發(fā)現(xiàn)，在人類心力衰竭樣本中m6A含量有所增加，但呈保守分布。METTL3的蛋白水平增加，F(xiàn)TO減少，而 ALKBH5水平?jīng)]有變化。蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，CORO6減少，而 RE1沉默轉(zhuǎn)錄因子增加。然而，兩者的mRNA不受影響。此外，他們檢測衰竭的人類心臟和肥厚的心肌細(xì)胞中m6A 含量，并發(fā)現(xiàn)RE1沉默轉(zhuǎn)錄因子增加，而在非衰竭的心臟和正常心肌細(xì)胞中觀察到CORO6的m6A含量更高。一旦上調(diào) METTL3，RE1沉默轉(zhuǎn)錄因子和CORO6的翻譯水平就會增加，說明轉(zhuǎn)錄后修飾可能直接影響心肌細(xì)胞的基因表達(dá)，從而導(dǎo)致心肌肥大。

DORN等［19］發(fā)現(xiàn)，m6A甲基化程度因肥大刺激而升高。在體外模型中，抑制 METTL3時(shí)心肌細(xì)胞肥大的生長趨勢完全消失，不會發(fā)生肥大。然而，過表達(dá)METTL3會促進(jìn)自發(fā)性和代償性肥大。在體內(nèi)模型中，心臟特異性METTL3敲除小鼠表現(xiàn)出心臟重構(gòu)和心力衰竭，然后出現(xiàn)心臟穩(wěn)態(tài)失調(diào)，而m6A RNA甲基化酶METTL3水平升高，導(dǎo)致心臟肥大。

雖然在上述心肌肥大模型中，部分研究顯示METTL3的表達(dá)水平變化趨勢相反，可能與實(shí)驗(yàn)細(xì)胞或動物建模方法不同導(dǎo)致肥大的機(jī)制不同有關(guān)。上述4項(xiàng)研究表明，m6A甲基化酶METTL3對心肌細(xì)胞肥大的形成過程有調(diào)控作用，m6A去甲基化酶FTO也在心肌肥大的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用。提示METTL3和FTO可能作為靶點(diǎn)，對病理性心肌肥大具有潛在的治療和研究價(jià)值。

3 m6A RNA甲基化修飾與心血管疾病

3.1 m6A RNA甲基化修飾與心力衰竭

心力衰竭作為一種慢性疾病，在全世界對超過2 000萬的患者造成嚴(yán)重影響。BERULAVA等［20］的研究發(fā)現(xiàn)，心力衰竭期間m6A RNA甲基化水平降低。具體而言，鈣調(diào)蛋白1的mRNA水平保持不變，而蛋白表達(dá)水平降低。也就是說，m6A RNA甲基化水平影響蛋白水平而非mRNA水平。m6A RNA甲基化與核糖體占據(jù)率呈正比，這意味著高甲基化轉(zhuǎn)錄本的蛋白水平增加，而低甲基化轉(zhuǎn)錄本的蛋白水平降低。FTO 敲除小鼠在主動脈弓縮窄術(shù)后心臟表型惡化，表現(xiàn)為射血分?jǐn)?shù)降低和擴(kuò)張程度增加。

MATHIYALAGAN等［21］發(fā)現(xiàn)，去甲基化酶 FTO與心臟的重構(gòu)和修復(fù)有關(guān)。他們檢測到哺乳動物衰竭的心臟和缺氧心肌細(xì)胞中FTO表達(dá)水平下降，因此m6A RNA甲基化增加。Sarco/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶2a是一種收縮蛋白，當(dāng)它高甲基化時(shí)，表現(xiàn)出較低的穩(wěn)定性和調(diào)節(jié)翻譯效率，最終降低心肌細(xì)胞的收縮功能。然而，人心肌細(xì)胞中 FTO 過表達(dá)導(dǎo)致 Sarco/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶2a 去甲基化。隨著Sarco/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶2a表達(dá)的增加，心臟收縮功能得到改善。他們還發(fā)現(xiàn)，在心肌梗死小鼠模型中，F(xiàn)TO 過表達(dá)抑制了纖維化并促進(jìn)了血管生成。這種機(jī)制提供了對心臟重構(gòu)和修復(fù)的新見解。

以上2項(xiàng)研究中，誘發(fā)心力衰竭的模型存在差別。BERULAVA等［20］使用主動脈弓縮窄術(shù)形成壓力負(fù)荷誘發(fā)心力衰竭，MATHIYALAGAN等［21］選擇急性心肌組織缺血模型來誘導(dǎo)心力衰竭。但是在心力衰竭模型中，F(xiàn)TO的表達(dá)水平均下降，說明了去甲基化酶FTO可能在改善缺血和壓力負(fù)荷導(dǎo)致的心肌損傷以及修復(fù)過程中起作用。

3.2 m6A RNA甲基化與冠狀動脈粥樣硬化性心臟病

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是冠狀動脈血管發(fā)生動脈粥樣硬化病變而引起血管腔狹窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或壞死而導(dǎo)致的心臟病。GUO等［22］發(fā)現(xiàn)干擾素調(diào)節(jié)因子-1通過促進(jìn)m6A修飾，抑制 circ_0029589的表達(dá)，從而促進(jìn)急性冠狀動脈綜合征和動脈粥樣硬化中巨噬細(xì)胞焦亡和炎癥的新機(jī)制。具體而言，急性冠狀動脈綜合征患者的巨噬細(xì)胞中hsa_circ_0029589相對RNA表達(dá)水平降低，而hsa_circ_0029589的m6A 水平和m6A甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3的表達(dá)則顯著升高。過表達(dá)干擾素調(diào)節(jié)因子-1抑制了hsa_circ_0029589的表達(dá)，但誘導(dǎo)了其m6A水平以及巨噬細(xì)胞中 METTL3 的表達(dá)。此外，過表達(dá)hsa_circ_0029589或抑制METTL3顯著增加了hsa_circ_0029589的表達(dá)并減弱了巨噬細(xì)胞焦亡。這項(xiàng)研究證明了m6A修飾參與并調(diào)控了急性冠狀動脈綜合征和動脈粥樣硬化中細(xì)胞焦亡的發(fā)生過程。

3.3 m6A RNA甲基化與高血壓

MO等［23］最近的研究表明，m6A RNA甲基化在血壓調(diào)節(jié)中起至關(guān)重要的作用。他們認(rèn)為，共有1 236個(gè)m6A-單核苷酸多態(tài)性與血壓相關(guān)。在這些單核苷酸多態(tài)性中，有761個(gè)與收縮期血壓相關(guān)，799個(gè)和舒張期血壓相關(guān)。利用全基因組關(guān)聯(lián)分析2011年和2018年的全基因組關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)與舒張壓相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的m6A甲基化顯著改變。

WU等［24］測定自發(fā)性高血壓大鼠壁細(xì)胞m6A甲基化調(diào)控哺乳動物高血壓的表觀轉(zhuǎn)錄組機(jī)制。他們采用m6A高通量測序法檢測Wistar大鼠細(xì)胞和自發(fā)性高血壓大鼠壁細(xì)胞m6A甲基化水平，發(fā)現(xiàn)m6A甲基化在mRNA的編碼序列區(qū)域、3’-非編碼區(qū)和5’-非編碼區(qū)更為富集，m6A基序在不同條件下相對保守。自發(fā)性高血壓大鼠壁細(xì)胞m6A的平均豐度整體減少。由此可以得出結(jié)論：m6A與哺乳動物高血壓有關(guān)，可能通過表觀轉(zhuǎn)錄組機(jī)制完成。

3.4 m6A RNA甲基化與心律失常

CARNEVALI等［25］探索了去甲基化酶FTO缺陷小鼠存在心臟自主神經(jīng)失調(diào)和潛在的心律失常現(xiàn)象。小鼠FTO缺乏與生長遲緩、白色脂肪組織喪失、能量代謝增加和全身交感神經(jīng)激活增強(qiáng)有關(guān)［26］。FTO敲除小鼠與野生型小鼠相比，在靜息和應(yīng)激條件下心率值更高，心率變異性增加（低頻射頻/高頻射頻比值增加），更容易出現(xiàn)應(yīng)激誘導(dǎo)的快速心律失常、心室復(fù)極改變和心肌肥厚。由此推斷，小鼠FTO缺乏導(dǎo)致交感-副交感神經(jīng)調(diào)節(jié)失衡，并可能導(dǎo)致心臟電生理性和結(jié)構(gòu)特性的前節(jié)律性重塑。然而，交感神經(jīng)興奮對心臟本來就有正性變時(shí)、正性變力、正性變傳導(dǎo)的作用。因此，F(xiàn)TO缺陷的小鼠的心律失常是否僅僅由交感-副交感神經(jīng)失衡導(dǎo)致仍需要進(jìn)一步探索。

4 m6A RNA甲基化檢測新技術(shù)

目前，研究人員正在積極探索在心血管疾病方面m6A修飾相關(guān)分子的作用，但仍有許多問題和挑戰(zhàn)需要解決，如m6A中使用的廣泛轉(zhuǎn)錄組地圖有助于更好地了解m6A并揭示潛在的表觀遺傳修飾機(jī)制。2012 年，《Nature》和《Cell》發(fā)表了一種通過m6A特異性抗體富集對m6A修飾進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測序的方法［27-28］，但m6A特異性抗體富集的分辨率不足（約100 nt）。近年來，重復(fù)性低、樣本量大、操作繁瑣等原則上無法克服的弱點(diǎn)給m6A研究帶來了很大的阻礙。在最新的研究中，ZHANG等［29］引入了一項(xiàng)m6A檢測新技術(shù)——m6A敏感的RNA核糖核酸內(nèi)切酶測序，該技術(shù)利用新發(fā)現(xiàn)的RNA核酸內(nèi)切酶對m6A有敏感性，擺脫了傳統(tǒng)方法對抗體的依賴，實(shí)現(xiàn)了對m6A跨轉(zhuǎn)錄組的準(zhǔn)確檢測。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，m6A領(lǐng)域的新技術(shù)不斷涌現(xiàn)。此外，m6A的靶向藥物在臨床干預(yù)心血管疾病方面很有前景。

5 結(jié)論與展望

m6A的動態(tài)修飾與心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系，表觀遺傳學(xué)調(diào)控在這一機(jī)制中起到了重要作用。除本文概述的m6A修飾外，研究還在探索其他類型m6A修飾在心血管疾病中的作用。

眾所周知，心血管疾病的形成機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜。在臨床上，部分病例仍難以治愈，且患病率隨年齡增長而增加。因此，新治療策略引起了人們的極大興趣，這可能逆轉(zhuǎn)某些心血管疾病。希望該領(lǐng)域的持續(xù)研究能夠進(jìn)一步加深對心血管疾病過程的理解，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)新的治療方法，從而提高心血管疾病患者的生活質(zhì)量。