胡 平

北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，北京 房山102442

奶牛運(yùn)動(dòng)場(chǎng)地面土壤潮濕，糞便、尿液以及運(yùn)動(dòng)場(chǎng)沖洗用水等污染物會(huì)滲入土壤并隨沖洗水、雨水等沖刷擴(kuò)散至周?chē)h(huán)境中。奶牛糞便中攜帶的微生物種類(lèi)豐富，對(duì)畜禽健康和養(yǎng)殖場(chǎng)周?chē)h(huán)境都存在重要威脅[1]。近年來(lái)，在細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析中逐漸使用高通量測(cè)序技術(shù)[2-3]，但對(duì)奶牛場(chǎng)土壤和糞便環(huán)境中全面的微生物群落的研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究基于宏基因組測(cè)序技術(shù)對(duì)北京市某區(qū)奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)土壤和糞便樣本的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究[4-5]，旨在為探究奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)土壤環(huán)境中微生物污染情況提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與處理

試驗(yàn)樣本于2019 年5 月采集自北京市某區(qū)規(guī)?；膛?chǎng)，采集17 份樣本。其中，奶牛運(yùn)動(dòng)場(chǎng)圍欄外2 m 位置土壤采集4 份（CB2M-1、CB2M-2、CB2M-3、CB2M-4）；運(yùn)動(dòng)場(chǎng)圍欄外0.5 m 位置土壤 采 集5 份（CBH-1、CBH-2、CBH-3、CBH-4、CBH-5）；運(yùn)動(dòng)場(chǎng)內(nèi)中心位置土壤采集4 份（CTN-1、CTN-2、CTN-3、CTN-4）；運(yùn)動(dòng)場(chǎng)內(nèi)新鮮糞便樣本4份（FB-1、FB-2、FB-3、FB-4）。以上土壤樣本均采集距地表0～20 cm 深度的松軟土壤，采用滅菌鏟子取樣，封裝于滅菌樣本管中。糞便樣本均無(wú)菌采集自新鮮糞便中心位置，用無(wú)菌采樣管收集封裝（表1）。所有樣本在干冰冰盒保存下迅速運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰箱中保存待檢。

表1 樣本采集信息

1.2 總基因組DNA 提取

將在-80 ℃冰箱中保存的土壤及糞便樣本，按照PowerSoil DNA Isolation Kit （MoBio Laboratories，Carlsbad，CA） 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行微生物組DNA 提取。

將提取到的DNA 用1%瓊脂糖凝膠電泳和分光光度法檢測(cè)DNA 質(zhì)量和濃度，質(zhì)檢合格的樣本存貯在-80 ℃冰箱中備用。

1.3 文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序

將質(zhì)檢合格的DNA 樣品用Covaris 超聲波破碎儀將基因組DNA 隨機(jī)打斷成長(zhǎng)度約300 bp 的小片段，經(jīng)末端修復(fù)、加A 尾、加測(cè)序接頭、純化、PCR 擴(kuò)增等步驟完成文庫(kù)制備。先使用Qubit 初步定量構(gòu)建完成的文庫(kù)，并將文庫(kù)濃度稀釋至2 ng/μL。然后使用Agilent 2100 檢測(cè)文庫(kù)的插入片段，插入片段符合預(yù)期后使用Q-PCR 方法對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量（文庫(kù)有效濃度＞3 nmol/L）。最后把不同文庫(kù)按照有效濃度及目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量的需求進(jìn)行pooling，在Illumina HiSeq4000 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)分析處理

對(duì)原始數(shù)據(jù)使用Trimmomatic 軟件進(jìn)行系列質(zhì)控，過(guò)濾并去掉質(zhì)控后片段長(zhǎng)度＜50 bp 的reads。將質(zhì)控后得到的高質(zhì)量序列clean reads 使用DIAMOND BLASTX 算法進(jìn)行比對(duì)和物種注釋。隨后使用組裝軟件MEGAHIT（v1.0.6）對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝，并過(guò)濾掉組裝結(jié)果中500 bp 以下的片段。采用prodigal 軟件對(duì)組裝得到的contig 序列進(jìn)行ORF（Open Reading Frame）預(yù)測(cè)，使用CD-HIT軟件對(duì)預(yù)測(cè)的結(jié)果去冗余，從而得到非冗余基因集。采用Bowtie 軟件將測(cè)序數(shù)據(jù)與構(gòu)建的非冗余基因集進(jìn)行比對(duì)，并統(tǒng)計(jì)單個(gè)基因在不同樣本的豐度信息。將預(yù)測(cè)得到非冗余基因集與功能注釋數(shù)據(jù)庫(kù)nr、Swiss-Prot、Kegg、Cog/Kog、eggNOG、GO、Pfam、ARDB/CARD、CAZyme 進(jìn)行比對(duì)和注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于基因豐度及物種注釋豐度的PCA

基于基因豐度的PCA 分析（Principal Component Analysis）顯示每個(gè)采樣地內(nèi)樣本之間重復(fù)較好，其基因豐度的組成較為相近。其中CB2M 組與CBH 組在基因豐度組成上較為相似，而與CTN 和FB 組有顯著差異（圖1）。在基于物種豐度的PCA分析結(jié)果顯示，除了CTN 組有1 個(gè)樣本離散之外，CB2M 組、CBH 組以及CTN 組這3 個(gè)樣本組在物種豐度組成方面較為相似，而他們與FB 組在物種豐度組成上有顯著差異（圖2）。

2.2 微生物群落結(jié)構(gòu)

1）細(xì)菌群落組成。本項(xiàng)研究采取的4 組樣本中細(xì)菌群落在門(mén)水平組成上有顯著差異，其中CB2M、CBH 組樣本細(xì)菌群落組成較相似，占比最高的是變形菌門(mén)（Proteobacteria，42.06%～44.01%）和放線菌門(mén)（Actinobacteria，18.42%～22.26%），其次依次是擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes，6.63%～6.70%）、綠灣菌門(mén)（Chloroflexi，3.44%～4.26%）、浮霉菌門(mén)（Planctomycetes，3.40%～4.57%）、芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes，3.82%～4.17%）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria，3.57%～4.53%）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes，2.53%～2.70%）、疣微菌門(mén)（Verrucomicrobia，2.39%～2.53%；Cyanobacteria，2.02%～2.18%）。CTN 組樣本中變形菌門(mén)比例顯著高于CB2M 和CBH 組，而放線菌門(mén)比例小于CB2M 和CBH。在FB 樣本中占比最高的是厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)，并且占比遠(yuǎn)高于在其他3 組中的比例（圖3）。

在屬水平的細(xì)菌組成中，CB2M、CBH 和CTN組樣本細(xì)菌群落中豐度由高到低分別為：鏈霉菌屬（Streptomyces）＞硝銨醇單胞菌屬（Sphingomonas）＞諾卡氏菌屬（Nocardioides）。FB 樣本細(xì)菌組成豐度由高到低分別為：擬桿菌門(mén)（Bacteroides）＞梭菌屬（Clostridium）＞瘤胃球菌屬（Ruminococcus）＞另枝菌屬（Alistipes）＞普氏菌屬（Prevotella）等（圖4）。

2）真菌群落組成。如圖5 所示，CB2M、CBH 2 組樣本的真菌群落組成差異不顯著，其中子囊菌門(mén)（Ascomycota）占比78.71%～82.84%；擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota） 占比9.31%～13.59%；毛霉門(mén)（Mucoromycota）占比4.83%～5.08%；壺菌門(mén)（Chytridiomycota）占比1.53%～1.64%。CTN 樣本中子囊菌門(mén)占比（95.46%）顯著高于在CB2M（82.84%）和CBH（78.72%）中的占比。而FB 樣本中子囊菌門(mén)占比（47.55%）低于上述3 組，擔(dān)子菌門(mén)（19.78%）、毛霉門(mén)（17.87%）和壺菌門(mén)（11.84%）占比則高于上述3 組。

在屬水平層面，4 組樣本的真菌群落組成方面均有顯著差異，CB2M 中比例較高的依次是馬杜拉分支菌屬（Madurella，13.80%）和鐮刀菌屬（Fusarium，9.24%）；CBH 樣本中比例較高的是柄孢殼菌屬（Podospora，8.47%）、鐮刀菌屬7.87%、毛殼菌屬（Chaetomium，6.53%） 和馬杜拉分支菌屬4.60%；CTN 樣本中分別是鏈格孢屬（Alternaria，26.19%）、鐮刀菌屬26.08%、曲霉菌屬（Aspergillus，11.79%）以及毛殼菌屬（Chaetomium，6.04%）；FB 樣本中毛霉菌屬（Mucor，7.30%）、Rhizophagus，5.00%（圖6）。

3）古菌群落組成。由圖7 可知，4 個(gè)樣本組在門(mén)水平上，奇古菌門(mén)（Thaumarchaeota）在CB2M、CBH和CTN 樣本中比例依次升高，分別為46.62%、51.58%、64.88%，而在FB 樣本中只有不到1%。廣古菌門(mén)（Euryarchaeota）在CB2M、CBH 和CTN 樣本中比例依次降低，分別為43.94%、37.59%、27.48%，而在FB 中占比達(dá)到了96.14%。

在屬水平上如圖8 所示，CB2M、CBH 和CTN組主要古菌為亞硝化球菌屬（Nitrososphaera）（33.11%、37.56%、55.77%）和氨氧化古菌Candidatus_Nitrosocosmicus（17.83%、19.50%、13.22%）以及一定比例的甲烷囊菌屬（Methanoculleus）（6.42%、1.47%、1.19%）和甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）（4.64%、4.10%、2.39%），而糞便樣本中絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌為甲烷短桿菌（Methanobrevibacter）（66.34%），其次是甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）（3.34%）。

3 討 論

3.1 細(xì)菌群落分析

在細(xì)菌門(mén)水平組成上，運(yùn)動(dòng)場(chǎng)圍欄外2 m（CB2M）、0.5 m（CBH）和運(yùn)動(dòng)場(chǎng)中央（CTN）土壤的樣本中可見(jiàn)豐度最高的是變形菌門(mén)，其次是放線菌門(mén)，其余依次為擬桿菌門(mén)＞綠灣菌門(mén)＞浮霉菌門(mén)＞芽單胞菌門(mén)＞酸桿菌門(mén)＞厚壁菌門(mén)＞、疣微菌門(mén)＞藍(lán)細(xì)菌門(mén)。且以運(yùn)動(dòng)場(chǎng)中央為圓心，距離越遠(yuǎn)的樣本變形菌門(mén)豐度逐漸下降，而放線菌門(mén)豐度逐漸增加。有報(bào)道稱(chēng)變形菌門(mén)是奶牛場(chǎng)養(yǎng)殖用水樣本中的類(lèi)群，說(shuō)明變形菌門(mén)在運(yùn)動(dòng)場(chǎng)中央糞便和尿液豐富的濕潤(rùn)土壤環(huán)境中更易生長(zhǎng)和繁殖，該結(jié)果與閆艷華等[6]的相關(guān)研究報(bào)道基本一致。在糞便樣本（FB）中占比最高的是厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)，這與其他學(xué)者的報(bào)道[7-8]相似。

在細(xì)菌屬水平物種組成中，鏈霉菌屬豐度最高，其次是硝銨醇單胞菌屬、諾卡氏菌屬。FB 樣本細(xì)菌組成豐度由高到低依次是擬桿菌屬、梭菌屬、瘤胃球菌屬、另枝菌屬和普雷沃菌屬等。其中，圍欄外2.0 m 和0.5 m 組樣本細(xì)菌群落組成相似，鏈霉菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和諾卡氏菌屬比例顯著高于運(yùn)動(dòng)場(chǎng)中央土壤和糞便樣本。硝銨醇單胞菌屬、普雷沃菌屬、梭菌屬等均為常見(jiàn)的機(jī)會(huì)性致病菌，對(duì)奶牛場(chǎng)養(yǎng)殖環(huán)境控制均具有臨床意義[9-10]。

3.2 真菌群落分析

宏基因組技術(shù)不依賴(lài)于微生物的分離培養(yǎng)，克服了傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法的技術(shù)限制，為可培養(yǎng)的微生物提供了一種新的途徑。本項(xiàng)研究運(yùn)用宏基因組學(xué)技術(shù)對(duì)奶牛運(yùn)動(dòng)場(chǎng)中心及周?chē)寥篮图S便中的真菌進(jìn)行了物種分析，結(jié)果顯示運(yùn)動(dòng)場(chǎng)圍欄外2 m 和0.5 m 及運(yùn)動(dòng)場(chǎng)中央土壤中門(mén)水平上豐度占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的真菌為子囊菌門(mén)，而在運(yùn)動(dòng)場(chǎng)中央土壤子囊菌門(mén)的占比顯著高于圍欄外2 組。在糞便樣本中豐度最高的真菌為子囊菌門(mén)、擔(dān)子菌門(mén)、毛霉菌門(mén)和壺菌門(mén)。造成奶牛真菌性乳房炎的多種酵母樣真菌都屬于子囊菌門(mén)[11]，有研究[12]報(bào)道，擔(dān)子菌門(mén)和芽枝霉門(mén)在發(fā)生犢牛腹瀉的糞便樣本中顯著高于健康犢牛。擔(dān)子菌門(mén)是草食動(dòng)物糞便中豐度最高的糞棲真菌，這與楊頊等[13]的相關(guān)報(bào)道一致。在屬水平上，運(yùn)動(dòng)場(chǎng)外2 m 土壤中真菌占比由高至低為馬杜拉菌屬和鐮孢屬；運(yùn)動(dòng)場(chǎng)外0.5 m 的土壤中占比最高的是柄孢殼菌屬、鏈胞菌屬、毛霉菌屬和馬杜拉菌屬；在運(yùn)動(dòng)場(chǎng)中央豐度最高的是鏈格孢屬和鐮孢屬，其次是曲霉菌屬和毛殼菌屬。在糞便樣本中主要是毛霉菌屬和Rhiaophagus。

3.3 古菌群落分析

3 個(gè)土壤樣本中奇古菌門(mén)的豐度隨著距離向運(yùn)動(dòng)場(chǎng)中央靠近逐漸增加，而廣古菌門(mén)豐度逐漸減少。在屬水平上3 個(gè)土壤樣本中主要為亞硝化球菌屬、氨氧化古菌、甲烷囊菌屬和甲烷八疊球菌屬。在糞便樣本中廣古菌門(mén)占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)96.14%，其中絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌為甲烷短桿菌，其次是甲烷八疊球菌屬，這與奶牛消化道大量產(chǎn)甲烷菌密切相關(guān)，與相關(guān)報(bào)道一致。

4 結(jié) 論

本項(xiàng)研究通過(guò)宏基因組技術(shù)對(duì)奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)運(yùn)動(dòng)場(chǎng)內(nèi)、運(yùn)動(dòng)場(chǎng)周邊土壤進(jìn)行了微生物群落分析，同時(shí)對(duì)新鮮奶牛糞便也進(jìn)行了微生物群落分析。研究發(fā)現(xiàn)變形菌門(mén)、放線菌門(mén)是土壤中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，子囊菌門(mén)和擔(dān)子菌門(mén)為土壤中的優(yōu)勢(shì)真菌，奇古菌門(mén)和廣古菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)古菌群落。在新鮮糞便中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)，而擔(dān)子菌門(mén)、毛霉門(mén)和壺菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)真菌群落。在這些優(yōu)勢(shì)群落中大多數(shù)微生物都具有機(jī)會(huì)致病菌特點(diǎn)，往往與奶牛乳房炎、犢牛腹瀉、腐蹄病和皮膚病等相關(guān)，因此控制奶牛場(chǎng)內(nèi)土壤和糞便中的微生物污染是規(guī)模化奶牛場(chǎng)需要嚴(yán)格規(guī)范管理的方向。