張 冰，張靜靜，藺洛文，耿 強(qiáng)，田 雨，湯先哲，毛文燕

(1新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院麻醉科，烏魯木齊 830011；2新疆醫(yī)科大學(xué)，烏魯木齊 830017)

腎缺血再灌注(Renal ischemia reperfusion,RIR)過程不僅會(huì)增加血清中促炎趨化因子、細(xì)胞因子等水平、加速細(xì)胞凋亡從而導(dǎo)致一系列病理改變，而且還會(huì)破壞心臟、肝臟、腦和肺等遠(yuǎn)隔器官的正常功能[1-4]。右美托咪定(Dexmedetomidine，Dex)是一種高度選擇性的α2腎上腺素能受體激動(dòng)劑，具有抗凋亡作用和器官保護(hù)作用[5-7]。磷脂酰肌醇3激酶/絲氨酸/蘇氨酸激酶(PI3K/Akt)信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)參與細(xì)胞增殖與凋亡重要的信號(hào)傳導(dǎo)通路[8-10]，有研究表明，右美托咪定可通過調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路抑制心肌自噬以及心肌缺血再灌注后心肌細(xì)胞凋亡[11-13]。前期研究表明腎缺血再灌注后可導(dǎo)致心肌細(xì)胞的炎性反應(yīng)及凋亡，造成一定程度的心肌損傷，但其機(jī)制不清[14-15]。本研究進(jìn)一步探討α2AR/PI3K/Akt通路在大鼠腎缺血再灌注后心肌細(xì)胞凋亡中的作用，同時(shí)使用右美托咪定進(jìn)行預(yù)處理，進(jìn)一步探究右美托咪定器官保護(hù)作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象與分組Wistar大鼠由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，選取10周齡、雄性、體重250～300 g大鼠40只，嚴(yán)格按照清潔級(jí)大鼠標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行飼養(yǎng)。按照隨機(jī)數(shù)字表法分分為5組，分別按相應(yīng)處理方式，每組8只。(1)假手術(shù)組(Sham組)：游離雙側(cè)腎蒂，只穿線，不結(jié)扎，以等容量的生理鹽水替代Dex。(2)缺血再灌注組(I/R組)：建立腎缺血再灌注模型(腎缺血45 min，再灌注4 h)，以等容量生理鹽水替代Dex。(3)右美托咪定組(Dex組)：以4 μg·kg-1·h-1的速率靜脈泵注右美托咪定，余同Sham組。(4)右美托咪定+I/R組(Dex+I/R組)：缺血前30 min以4 μg·kg-1·h-1的速率靜脈泵注右美托咪定至再灌注4 h，余同I/R組。(5)阿替哌唑+右美托咪定+I/R組(Atip+Dex+IR組)：在進(jìn)行 Dex 預(yù)處理前10 min，以250 μg/kg的劑量腹腔注射阿替哌唑，余同Dex+I/R組。

1.2 方法

1.2.1 大鼠腎缺血再灌注模型制作 大鼠術(shù)前禁食12 h，不禁飲水，電子秤稱重。以10%水合氯醛350 mg/kg劑量腹腔注射麻醉后于潔凈手術(shù)臺(tái)仰臥位固定，備皮，消毒液消毒3遍后切皮，持組織剪沿腹白線打開大鼠腹部，將雙腎充分暴露，對(duì)于右腎，小心分開包膜和腎蒂，結(jié)扎后將右腎切除，左腎同樣將腎包膜及腎蒂分開，持動(dòng)脈夾夾閉腎動(dòng)脈并計(jì)時(shí)，缺血45 min后輕輕松開動(dòng)脈夾并計(jì)時(shí)，腎臟血供恢復(fù)，肉眼可見腎臟顏色逐漸由暗紅色轉(zhuǎn)為鮮紅色。將各臟器輕放回腹腔后，逐層縫合關(guān)腹，并于腹部覆蓋紗布，將大鼠轉(zhuǎn)為側(cè)臥位，加蓋無菌手術(shù)巾并以手術(shù)燈光照保溫并計(jì)時(shí)。實(shí)驗(yàn)全程以保溫毯維持大鼠體溫。

1.2.2 標(biāo)本留取 再灌注4 h，在麻醉下放血致死，快速打開胸腔分離心臟，沿主動(dòng)脈根部剪下心臟，剪除多余結(jié)締、脂肪組織，使用4℃預(yù)冷的PBS緩沖液進(jìn)行沖洗，直至液體清亮，使用紗布吸干多余溶液，剪去右心及左房，于左心室前壁留取大小約5×5 mm3的組織標(biāo)本，置于盛有10%甲醛及無甲醛的凍存管中，并迅速轉(zhuǎn)入-80℃低溫冰箱中保存，以用于HE染色、TUNEL染色、Western Blot法進(jìn)一步檢測(cè)分析心肌細(xì)胞的凋亡情況。

1.2.3 HE染色 心肌組織標(biāo)本石蠟包埋后，將心臟組織切成5μm厚的切片。然后將切片用蘇木精/曙紅染色并在光學(xué)顯微鏡下拍照。

1.2.4 TUNEL染色 心肌組織使用甲醛溶液固定并包埋在石蠟中，將組織切成5 μm切片進(jìn)行TUNEL染色。通過在生物顯微鏡下觀察并以盲法計(jì)算和分析每個(gè)高倍視野的TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行凋亡率(%)的計(jì)算與分析。

1.2.5 Western Blot檢測(cè) 檢測(cè)心肌細(xì)胞中PI3K、Akt、p-Akt、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 心肌組織HE染色Sham組：大部分心肌纖維在鏡下呈整齊排列，心肌纖維間存在分散的少量浸潤(rùn)慢性炎細(xì)胞；部分心肌細(xì)胞呈現(xiàn)空泡樣變性；少量血管充血及出血。I/R組:大部分心肌纖維排列較為紊亂，部分心肌纖維斷裂較嚴(yán)重，心肌纖維間存在較多慢性炎細(xì)胞浸潤(rùn)，可觀察到較多核固縮、胞質(zhì)均質(zhì)紅染或呈粗顆粒狀，存在壞死溶解；部分心肌細(xì)胞可見空泡樣變性。Dex組：心肌纖維排列較整齊，部分心肌細(xì)胞可見橫紋，部分心肌細(xì)胞空泡變性。Dex+I/R組：心肌纖維排列較整齊，心肌纖維間散在部分慢性炎細(xì)胞浸潤(rùn)；部分心肌細(xì)胞可見空泡變性；小部分心肌纖維溶解壞死。Atip+Dex+I/R組：心肌纖維排列稍紊亂，部分細(xì)胞間隙增寬，部分心肌細(xì)胞可見空泡樣變性。見圖1。

a b c d e

2.2TUNEL染色觀察心肌細(xì)胞凋亡情況與Sham組比較，I/R組、Atip+Dex+I/R組凋亡率明顯升高(P<0.05)；與I/R組比較，Dex組、Dex+I/R組凋亡率明顯降低(P<0.05)；與Dex+I/R組比較，Atip+Dex+I/R組凋亡率明顯升高(P<0.05)；見表1。心肌組織TUNEL染色結(jié)果見圖2。

表1 大鼠心肌組織凋亡率分析(%，n=40)

a b c d e

2.3 Western Blot檢測(cè)心肌組織PI3K、Akt、p-Akt、Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)Akt蛋白的表達(dá)在各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與Sham組比較，I/R組PI3K、p-Akt、Bcl-2蛋白表達(dá)水平均呈現(xiàn)明顯降低(P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)水平則相反，呈明顯升高(P<0.05)。與Sham組比較, Dex組PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)水平呈現(xiàn)明顯降低(P<0.05)。與I/R組比較，Dex+I/R組PI3K、p-Akt、Bcl-2水平顯著升高(P<0.05)，Bax水平顯著降低(P<0.05)。與I/R組比較，Atip+Dex+I/R組Bcl-2蛋白水平顯著上調(diào)(P<0.05)，Bax水平降低(P<0.05)。與Dex+I/R組比較，Atip+Dex+I/R組PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)水平均呈現(xiàn)明顯降低(P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)水平呈現(xiàn)明顯增加(P<0.05)。見表2、圖3。

表2 大鼠心肌組織中各蛋白的表達(dá)水平分析

圖3 Western Blot蛋白條帶圖

3 討論

右美托咪定可通過抑制NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用及通過抗凋亡緩解腎缺血再灌注心肌損傷[14-15]，但具體抗凋亡機(jī)制不清。本研究HE染色結(jié)果顯示，腎缺血再灌注可導(dǎo)致遠(yuǎn)隔心肌細(xì)胞的損傷，心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)較重，提示本研究造模比較成功。本研究結(jié)果顯示腎缺血再灌注可導(dǎo)致明顯的心肌細(xì)胞凋亡，右美托咪定預(yù)處理可減輕心肌的凋亡；通過對(duì)心肌組織凋亡率的計(jì)算，發(fā)現(xiàn)右美托咪定預(yù)處理可明顯減輕心肌組織的凋亡，同時(shí)給與α2受體拮抗劑后，右美托咪定的保護(hù)作用減弱。證實(shí)右美托咪定是通過α2受體發(fā)揮作用的。本研究通過對(duì)心肌組織中PI3K、Akt、p-Akt、Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，Akt蛋白在心肌凋亡過程中并非通過原形發(fā)揮作用，而是通過磷酸化后發(fā)揮作用。腎缺血再灌注后遠(yuǎn)隔心肌凋亡過程中，PI3K、p-Akt與Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低，Bax蛋白表達(dá)水平則相反，PI3K/Akt通路處于抑制狀態(tài)，凋亡平衡被打破，處于凋亡活躍狀態(tài)；當(dāng)給與右美托咪定預(yù)處理后，PI3K、p-Akt與Bcl-2蛋白表達(dá)明顯升高，Bax蛋白表達(dá)水平降低，此時(shí)處于抗凋亡狀態(tài)。同時(shí)，預(yù)先給與阿替哌唑拮抗α2受體后，右美托咪定的保護(hù)作用明顯減弱，由此證實(shí)右美托咪定可通過α2AR/PI3K/Akt通路減輕腎缺血再灌注后遠(yuǎn)隔心肌的凋亡。

綜上所述，右美托咪定預(yù)處理對(duì)腎缺血再灌注后心肌細(xì)胞凋亡起到保護(hù)作用，可能通過α2腎上腺素受體激活PI3K而使其下游的直接靶點(diǎn)Akt磷酸化，以進(jìn)一步發(fā)揮抑制心肌細(xì)胞凋亡的作用，對(duì)于腎缺血再灌注后的心肌細(xì)胞起到保護(hù)作用。