王 傑，蘇福增，劉小龍，姚俊杰，查天建

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院，烏魯木齊 830000)

燒傷是人類生活中最常見的病癥之一，每年全球因燒傷致死亡人數(shù)已超過30萬[1-3]。嚴(yán)重的燒傷患者常因隨后發(fā)生的并發(fā)癥和感染導(dǎo)致殘疾甚至死亡[4]。由于機(jī)械、化學(xué)或熱損傷導(dǎo)致皮膚屏障功能受損，可導(dǎo)致大量水分流失，從而導(dǎo)致患者血容量不足[5-6]。因此皮膚創(chuàng)面的治療是燒傷治療的關(guān)鍵。

皮膚中神經(jīng)及細(xì)胞的壞死是燒傷后機(jī)體內(nèi)最普遍的病理生理現(xiàn)象，同時(shí)也是眾多并發(fā)癥發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。目前有關(guān)燒傷后的消化道黏膜上皮細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞凋亡機(jī)理,和藥物對細(xì)胞凋亡影響的研究較為深入[7-8]。大量證據(jù)表明，燒傷早期即會出現(xiàn)內(nèi)源性一氧化氮(NO)的降低，這一現(xiàn)象有可能會加劇表皮細(xì)胞的損傷[9]。由活性氧和氮氧化合物所形成的抗氧化應(yīng)激引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性和線粒體功能障礙,以及促炎轉(zhuǎn)錄因子,也會導(dǎo)致細(xì)胞死亡、組織凋亡和器官衰竭[10]?？寡趸缚赡軙种蒲装Y及高代謝反應(yīng)[11]。另外給予抗氧化治療,比如抗壞血酸、谷胱甘肽或與微量元素聯(lián)合使用可有效減緩燒傷患者皮膚細(xì)胞的凋亡過程[12]。具體而言，抗氧化劑可以減弱燒傷皮膚細(xì)胞能量的變化，保護(hù)微血管循環(huán)，減少組織脂質(zhì)過氧化，從而減緩皮膚細(xì)胞的凋亡進(jìn)程[13]。有相關(guān)研究指出，一類新化合物可同時(shí)清除NO及ROS從而有效的抑制細(xì)胞中的氧化應(yīng)激作用從而改善細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，這類藥物稱為乙酰阿魏單硝酸異山梨醇酯(acetyl ferulaic isosorbide, AFI)[14]。本研究希望通過試驗(yàn)探討AFI在燒傷后表皮細(xì)胞凋亡過程中對于細(xì)胞氧化應(yīng)激的改善作用。

1 材料與方法

1.1 材料30只Wistar雄性大鼠，平均體重(200±20)g，適應(yīng)環(huán)境1 w。由新疆醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)、審核(審批號KY2018060612)。根據(jù)不同的處理，分為假傷組、及時(shí)復(fù)蘇組、及時(shí)復(fù)蘇+AFI藥物組、延遲復(fù)蘇組以及延遲復(fù)蘇+AFI藥物組，每組6只。乙酰阿魏單硝酸異山梨醇酯(AFI)、硫氫化鈉(天津福晨化學(xué)試劑廠，批號20080520)、冰醋酸(北京化工廠產(chǎn)品，批號20080331)、氯化鈉(天津福晨化學(xué)試劑廠，批號20081102)、無水乙醇(天津福晨化學(xué)試劑廠，批號20081012)；丙二醛(MDA)測試盒(批號20100106)、一氧化氮(NO)測試盒(批號20091118)、一氧化氮合酶分型測試盒(批號20100106)、髓過氧化物酶測試盒(批號20100106)、超氧化物歧化酶(SOD)測試盒(批號20100106)，均購自南京建成生物科技有限公司；Allegra 64Rcentrifage冰凍離心機(jī)(美國BECKMAN公司)。

1.2 燒傷小鼠模型的制備及實(shí)驗(yàn)方案麻醉后用10%的硫化鈉溶液脫除大鼠背部皮毛,脫毛24 h后,根據(jù)馮士杰在《大鼠燒傷模型的制作》中的造模工藝:在腹腔注入約20%的烏拉坦5 mL/kg,仰臥位將其四肢用橡皮筋固定在泡沫板上,將暴露的背部皮下完全裸露于泡沫板孔中,隨后將泡沫板安置于電熱恒壓水浴鍋中,將暴露的皮下浸漬于約(80±0.5)℃的熱水中持續(xù)15 s,在燒傷后迅速用方紗揩干水痕,并留下大約30%的深I(lǐng)I°度燒傷創(chuàng)面。假傷組水溫為37℃。及時(shí)復(fù)蘇組灼傷后及時(shí)通過腹腔注射乳酸鈉林格氏液40 mL/kg恢復(fù);延遲復(fù)蘇組于灼傷后6 h給予通過腹腔注射乳酸鈉林格氏液40 mL/kg恢復(fù);及時(shí)復(fù)蘇+AFI藥物組灼傷后即刻給予腹腔注射乳酸鈉林格氏液40 mL/kg恢復(fù)同時(shí)給予AFI 10 mg/kg;延遲復(fù)蘇+AFI藥物組灼傷后6 h立即給予腹腔注射乳酸鈉林格氏液40 mL/kg恢復(fù)同時(shí)給予AFI10 mg/kg。各組小鼠均于傷后12 h內(nèi)腹腔注射20%的烏拉坦5 mL/kg麻醉治療后,經(jīng)腹主動脈取血離心分離取新鮮血清,將小鼠血清和余下的燒傷皮膚組織取出后,立即放入-70℃的冰箱中儲存待檢。

1.3 血清及燒傷皮膚中SOD、MDA、NO、NO合酶含量檢測用對應(yīng)的丙二醛測試盒、一氧化氮測試盒、一氧化氮合酶分型測試盒、髓過氧化物酶測試盒、超氧化物歧化酶測試盒，分別按說明書加試劑及標(biāo)本進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清、皮膚SOD活性變化假傷組大鼠血清、皮膚SOD活性均高于燒傷各組大鼠(P<0.05)；使用AFI藥物的及時(shí)復(fù)蘇組大鼠與延遲復(fù)蘇組大鼠血清、皮膚SOD活性均高于未使用AFI藥物組大鼠(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠燒傷后血清、皮膚SOD活性變化

2.2 各組大鼠血清、皮膚MDA水平變化燒傷各組大鼠血清、皮膚MDA水平相比于假傷組均顯著增加(P<0.05)；進(jìn)行復(fù)蘇處理的大鼠中,使用AFI治療干預(yù)的大鼠血清、皮膚MDA水平與未使用AFI治療的大鼠相比顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠燒傷后血清、皮膚MDA水平變化

2.3 各組大鼠血清、皮膚NO及NO合酶變化燒傷各組大鼠血清、皮膚NO和NO合酶含量相比于假傷組均顯著增加(P<0.05)；進(jìn)行復(fù)蘇處理的大鼠中,使用AFI治療干預(yù)的大鼠血清、皮膚NO和NO合酶含量與未使用AFI治療的大鼠相比顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3、4。

表3 各組大鼠燒傷后血清、皮膚NO的變化

表4 各組大鼠燒傷后血清、皮膚NO合酶的變化

3 討論

本研究結(jié)果表明，乙酰阿魏單硝酸異山梨醇酯(acetyl ferulaic isosorbide, AFI)這類抗氧化藥物在燒傷大鼠實(shí)驗(yàn)中可有效的增強(qiáng)燒傷皮膚細(xì)胞的抗氧化作用，從而減緩受損的皮膚細(xì)胞凋亡。

研究表明[15]，在燒傷患者中，創(chuàng)面剩余上皮細(xì)胞決定了燒傷修復(fù)的方式方法和愈合時(shí)間，如何能夠快速修復(fù)創(chuàng)面，恢復(fù)皮膚屏障是治愈燒傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，深Ⅱ°燒傷創(chuàng)面殘存上皮的轉(zhuǎn)歸直接關(guān)系到燒傷患者的愈合周期和手術(shù)次數(shù)，如果能夠減少殘存上皮細(xì)胞凋亡，可大大減少患者植皮面積，降低治療經(jīng)費(fèi)縮短治療周期。另外燒傷受損的皮膚細(xì)胞多處于炎癥狀態(tài)，而炎癥狀態(tài)的皮膚細(xì)胞會導(dǎo)致機(jī)體的高代謝表現(xiàn)，大面積燒傷患者的炎癥特征會增加機(jī)體的分解代謝反應(yīng)從而導(dǎo)致多器官功能障礙甚至導(dǎo)致患者死亡。更多的學(xué)者希望通過探索減少受損皮膚細(xì)胞炎癥的不同途徑來解決這一問題，例如使用抗氧化劑治療[15-16]。本研究中AFI藥物展現(xiàn)出的抗氧化作用能夠較好地抑制燒傷受損的皮膚細(xì)胞的凋亡進(jìn)程，證明了抗氧化劑對燒傷皮膚治療的正面作用，但本研究對于實(shí)驗(yàn)動物燒傷炎癥狀態(tài)的監(jiān)測并不完善。

在細(xì)胞水平，抗氧化劑有減少活性氧產(chǎn)生以及阻斷或減弱轉(zhuǎn)錄因子的合成，減少炎癥標(biāo)志物中重要蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，從而減輕炎癥的作用[17]。而燒傷中進(jìn)行性的皮膚組織損傷常常伴隨著異常高水平的MDA的產(chǎn)生[18]，本研究中燒傷各組大鼠的皮膚MDA檢測水平與該結(jié)論相符。而抗氧化劑是中和活性氧并可能減少損傷的一種有效方法[19-20]，實(shí)驗(yàn)中使用抗氧化劑AFI的大鼠血清及皮膚檢測出MDA均較未使用組大鼠有所降低。AFI的研究學(xué)者在動物實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用心肌抗氧化研究也獲得了一定的療效,本研究將該物質(zhì)運(yùn)用于燒傷動物皮膚的抗氧化研究中也發(fā)現(xiàn)了同樣的抗氧化效應(yīng),能夠降低過氧化應(yīng)激反應(yīng)并且降低上皮細(xì)胞的凋亡。現(xiàn)階段尚無大型的前瞻性臨床試驗(yàn)或隊(duì)列研究來有效的證明抗氧化劑對燒傷患者皮膚細(xì)胞凋亡及炎癥進(jìn)程中有明顯的阻斷效果[21]。而抗氧化劑能夠補(bǔ)充谷氨酰胺從而提高燒傷患者的生存率這一結(jié)論已被證明[22]。本研究中使用AFI這一抗氧化劑作為主要治療措施，對實(shí)驗(yàn)大鼠的相關(guān)檢測一定程度驗(yàn)證了抗氧化劑對燒傷細(xì)胞凋亡的阻斷作用，但缺乏對大鼠炎癥進(jìn)程及燒傷后生存率的研究，需在后續(xù)研究中完善及驗(yàn)證。

有關(guān)對嚴(yán)重?zé)齻幕颊哌M(jìn)行抗氧化劑補(bǔ)充治療的研究表明，這一治療可以有效縮短平均住院時(shí)長，提高創(chuàng)面皮膚愈合率的同時(shí)還能夠降低患者的總體死亡率[23]。對于早期階段的燒傷患者而言，能夠有效抑制皮膚細(xì)胞凋亡過程是十分重要的，因此需要更大規(guī)模的相關(guān)研究來提供證據(jù)，來進(jìn)一步闡述使用抗氧化劑降低細(xì)胞凋亡的具體進(jìn)程。AFI藥物使細(xì)胞因子減少將會導(dǎo)致可的松和兒茶酚胺總體水平降低，胰高血糖素和胰島素的產(chǎn)生減少，進(jìn)而減少細(xì)胞高代謝，減緩細(xì)胞凋亡進(jìn)程[21,24]。

綜上所述，新化合物乙酰阿魏單硝酸異山梨醇酯(AFI)能夠有效的促進(jìn)實(shí)驗(yàn)大鼠燒傷皮膚細(xì)胞的抗氧化作用，從而抑制細(xì)胞的凋亡進(jìn)程，即提高實(shí)驗(yàn)大鼠血清及皮膚中抗氧化酶(SOD)的濃度，降低實(shí)驗(yàn)大鼠血清及皮膚中NO、MDA及NO合酶水平。本研究為有效的抑制燒傷患者皮膚細(xì)胞凋亡，進(jìn)而更有效的救治燒傷患者提供了新的思路，但未能進(jìn)一步研究其化合物的確切藥理學(xué)機(jī)制及大鼠體內(nèi)的作用靶點(diǎn)，將是下一步研究探討的方向。