米合熱尼沙·阿木熱江，卡地爾亞·庫爾班，古娜娜·對山別克，海力茜·陶爾大洪

(1新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,烏魯木齊 830017，2新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)藥學(xué)部,烏魯木齊 830011)

蕪菁(BrassicarapaL.)為十字花科蕓苔屬亞種二年生草本植物，地下塊根作為蔬菜在我國已有長時間的種植歷史，主要分布在新疆和西藏，具有滋陰潤肺、健胃消食、增強體質(zhì)等功效[1-3]。有研究表明蕪菁水提物(BAE)中含有糖、黃酮、生育酚、皂苷、揮發(fā)油、酚類、鞣質(zhì)、氨基酸和蛋白質(zhì)等多種化學(xué)物質(zhì)[4-5]，具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等一系列潛在的生物學(xué)活性[6]。近年來對植物活性多糖的研究越來越多，多糖對慢性疾病的預(yù)防和治療等生理功能引起了學(xué)者關(guān)注[7-8]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)蕪菁酸性均一多糖BRAP-2對小鼠Lewis肺癌細(xì)胞具有抑制作用，可增強巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞先天免疫反應(yīng)[9-10]。本研究提取分離純化蕪菁多糖，采用紫外-可見分光光譜法(Ultraviolet-visible spectrophotometry，UV)、比旋光度法、氣相色譜法(Gas chromatography, GC)、傅里葉紅外光譜法(Infrared spectroscopy, IR)、核磁共振法(Nuclear magnetic resonance ,NMR)分別測定蕪菁多糖均一組分1(BP1)和組分2(BP2)的分子質(zhì)量、單糖組成、化學(xué)鍵組成、糖鏈結(jié)構(gòu)，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器UV-2700紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；WZZ-1型自動旋光儀(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；AVATER-360 型IR光譜儀(美國尼高力儀器股份有限公司)；核磁共振光譜儀(Bruker scendTM 600)。

1.2 試劑葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)(品天津市天新精細(xì)化工開發(fā)中心, 批號：50-99-7)；阿拉伯糖(Ara)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glc)和半乳糖(Gal)(天津市天新精細(xì)化工開發(fā)中心, 批號：50-99-7)；DEAE-纖維素52填料(上?；瘜W(xué)試劑站分裝廠)；葡聚糖凝膠 Sephadex-G150 填料(上?；瘜W(xué)試劑場，Pharmacia 進(jìn)口分裝)。

1.3 藥材蕪菁藥材2021年12月采摘與柯坪縣阿恰鄉(xiāng)，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院叢媛媛教授鑒定為十字花科蕓苔屬，蕓苔種植物蕪菁(BrassicarapaL.)的地下塊根。

2 方法與結(jié)果

2.1 蕪菁多糖的制備將1 kg蕪菁干燥粉碎，用95%乙醇浸泡脫脂，揮干藥渣后在70℃的水浴鍋中用水(H2O)回流提取2次(2 h/次)。濃縮濾液，醇沉(80%乙醇)12 h。溶解已揮干的沉淀并透析48 h。冷凍干燥后得到了蕪菁粗多糖BRP。采用Savag法[11]除去蛋白質(zhì)，配制成100 mg/mL的多糖溶液，4 000 r/min離心15 min,再用DEAD-纖維素52柱層析(3.5×69 cm)，分別用H2O和0.1～1.0 mg/mL NaCl溶液梯度洗脫。采用蒽酮-硫酸法[12]制作n-A(n為管數(shù)，A為吸光度)洗脫曲線，濃縮，透析(截留相對分子質(zhì)量Mw=3 500 Da)，冷凍干燥備用。將含量較高的成分取適量溶解在2 mL H2O中，4 000 r/min離心15 min，上清液上樣到用3～5倍H2O固定好的sephadex-G150凝膠柱層析(2.0×60 cm)，用H2O洗脫并用10 mL的離心管收集洗脫液，同上述方法測定A，濃縮，冷凍干燥后備用。制備1 mg/mL(10 mg溶解在10 mL H2O中)均一多糖溶液，以H2O為空白在UV分光光度計200～400 nm處進(jìn)行掃譜。采用DEAE-纖維素52柱層析分離得到了7個組分，命名為BP1、BP2、BP3、BP4、BP5、BP6、BP7，其中BP1和BP2的含量較高。經(jīng)Sephadex-G150洗脫的BP1,BP2洗脫曲線顯示為單一峰，可判斷為均一組分。因在260、280 nm處未出現(xiàn)明顯的吸收峰，可認(rèn)為不含蛋白質(zhì)和核酸，見圖1～3。

圖1 DEAE-纖維素52蕪菁多糖洗脫曲線

圖2 BP1 UV掃描圖譜

圖3 BP2 UV掃描圖譜

2.2 蕪菁多糖相對分子質(zhì)量的測定稱取BP1和BP2組分各5 mg加1 mL H2O溶解，3 500 r/min離心10 min后取上清液上sephadexG-150 凝膠層析柱，每管收集2 mL。用Glu測總體積Vt制作Ve/V0-lgMw[其中Ve為各Dextran洗脫體積，V0為藍(lán)色葡聚糖(相對分子質(zhì)量200萬)測定凝膠柱的空體積]標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱取BP1和BP2組分各5 mg，用兩種組分樣品的洗脫體積，有效分配系數(shù)Kav和已繪制的相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出多糖樣品的相對分子質(zhì)量[13]。分別將均一組分洗脫體積代入方程：gMw=-2.5Ve/V0+8.588(r=0.999 5)計算相對分子質(zhì)量，見表1。

表1 不同分子量的標(biāo)準(zhǔn)Glu 及多糖的洗脫體積及相對分子質(zhì)量

2.3 蕪菁均一多糖的旋光度測定各稱取BP1、BP2 10 mg置10 mL容量瓶中，加H2O定容，以鈉(Na)燈為光源，測定比旋光度[α]。比旋光度[α]=αL-1C，式中α為旋光度(°), L為試管的長度(dm)，C為溶液的濃度(g/mL)[14]。測定結(jié)果顯示，組分BP1和BP2旋光度分別為+0.19、+0.13，比旋光度分別為+18.83、+12.00，均右旋。

2.4 蕪菁多糖均一組分部分酸水解分析各稱取BP1、BP2 10 mg置具塞試管中，加0.05 mol/L 的三氟醋酸(CF3COOH)2 mL，90 ℃水浴中加熱2 h，過量的CF3COOH反復(fù)用乙醇減壓蒸干法除去，倒入透析袋(截留相對分子質(zhì)量M=500)透析24 h,分別收集袋內(nèi)，外部分并濃縮，冷凍干燥后進(jìn)行GC分析。GC-14C條件：毛細(xì)管管柱(OV-1701，30×0.32 mm，0.25 μm)，柱溫度從160 ℃升至200 ℃(8 ℃/min)，維持10 min，再升至230 ℃(5℃/min)，維持5 min；進(jìn)樣口溫度250℃，火焰離子化檢測器溫度270℃；載氣(H2)線速50 mL/min，O2氣流速500 mL/min，進(jìn)樣量1 μL，分流比3∶1。均一組分BP1和BP2袋內(nèi)、外部分酸水解結(jié)果表明，組分BP1袋內(nèi)、外部分水解產(chǎn)物說明的主鏈單糖殘基為Man、Glc、Gal和Ara，其中Glc比較多；末端、分支單糖殘基為Man和Glc。組分BP2的袋內(nèi)，外部分酸水解結(jié)果可知主鏈單糖殘基為Ara、Man、Glc和Gal，其中Glc比較多，同為末端、分支單糖殘基。

2.5 蕪菁多糖均一組分高碘酸氧化分析精密稱取的8.100 mg 高碘酸鈉(NaIO4)置100 mL容量瓶溶解定容，從中分別取1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL置于50 mL容量瓶，定容搖勻，測吸光度A，繪制c-A標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性方程。稱取兩份20 mg置25 mL的棕色容量瓶，避光條件下再加0.015 mol/L 的 NaIO4溶解并定容。每6 h取0.1 mL置25 mL容量瓶加 H2O定容，在最大波長222 nm處測定A。A穩(wěn)定時加入2 mL乙二醇(CH2OH)2，進(jìn)行所消耗的NaIO4的計算。吸取5 mL反應(yīng)后的蕪菁多糖組分溶液，用NaOH溶液進(jìn)行滴定。取25 mL濃度為0.001 5 mol/L NaIO4溶液，并加入2 mL(CH2OH)2搖勻，吸取5 mL作為空白對照進(jìn)行NaOH溶液滴定。H5IO6標(biāo)準(zhǔn)曲線所得回歸方程為Y=46.418X-0.009 3，r=0.999 5(1.62～16.20 μg/mL)。HCOOH(甲酸)的生成量以NaOH的消耗量來計算。結(jié)果表明，根據(jù)多糖組分均生成HCOOH，可判斷多糖結(jié)構(gòu)中都含有1→6或者1→糖苷鍵。因NaIO4與HCOOH的摩爾質(zhì)量(M)之比大于2，所以這兩種糖中大量存在的糖苷鍵可能是1→2或者1→2,6和1→4或者1→4,6。

2.6 蕪菁多糖樣品的IR分析各取BP1和BP22 mg，采用壓片法與200 mg溴化鉀(KBr)在瑪瑙研缽中研磨混勻后壓片，在4 000～400 cm-1區(qū)域內(nèi)進(jìn)行IR掃描來確定糖苷鍵的構(gòu)型及觀察其他官能團(tuán)[15]。在3 381 cm-1和3 361 cm-1處分別出現(xiàn)的寬強峰是糖類分子內(nèi)氧氫鍵的伸縮振動吸收峰，說明兩種多糖組分分子之間或者分子內(nèi)可能存在H鍵；2 930 cm-1和2 933 cm-1處出現(xiàn)的較弱峰是糖苷鍵中-CH2的C-H振動吸收峰；1 600±3 cm-1吸收峰是表明含有糖醛酸的游離的R-COOH或R-COOH鹽C=H不對稱伸縮振動；圖4中的1 408 cm-1和圖5中的1 398 cm-1, 1 381 cm-1左右的峰分別是-COOH的C-O伸縮振動峰和C-H變角振動峰。BP1在1 078 cm-1，1 047 cm-1處出現(xiàn)強吸收峰是碳氧鍵伸縮振動峰，為吡喃環(huán)特征峰；因BP2糖環(huán)上C-O-C的不對稱伸縮振動，所以在1 066±10 cm-1處的峰是典型的吡喃糖環(huán)內(nèi)酯和-OH的吸收峰；圖4中1 050±50 cm-1處較大的吸收峰是糖環(huán)C-O-C和C-O-H的碳氧伸縮振動峰；924±1 cm-1處為α-吡喃環(huán)的對稱伸縮振動峰；864 cm-1，868 cm-1處的吸收峰是吡喃環(huán)上-CH的橫向振動，817 cm-1處的吸收峰是α-吡喃環(huán)的碳?xì)滏I的變角振動。檢測結(jié)果表明吡喃糖是組成BP1、BP2的單糖。

圖 4 多糖 BP1 的紅外光譜圖

圖 5 多糖 BP2的紅外光譜圖

2.7 蕪菁多糖樣品的NMR分析在NMR管中裝入各40 mg的BP1、BP2，適量的H2O中充分溶解，核磁共振儀上進(jìn)行1H-NMR，13C-NMR光譜分析。組分BP1和BP2的核磁共振氫譜、碳譜圖顯示，在δ3.0～4.5 ppm區(qū)域的大部分質(zhì)子信號和δ22.92～106.47 ppm區(qū)域的異頭碳信號為典型的多糖信號。如組分BP1在δ4.5～5.5 ppm的異頭氫質(zhì)子信號區(qū)出現(xiàn)了能證明含有4種單糖殘基的δ5.42、5.25、5.19、4.60 ppm等4個質(zhì)子信號，且異頭氫化學(xué)位移值δ5.42、5.25、5.19 ppm均大于δ4.95 ppm，推斷為α構(gòu)型糖殘基。因δ4.60 ppm小于δ4.95 ppm，可認(rèn)為存在β構(gòu)型糖殘基。碳譜顯示BP1在δ90～110 ppm異頭碳信號區(qū)出現(xiàn)了δ104.3、100.88、94.98、91.65 ppm等4個信號峰，說明含有4種單糖殘基。其中δ100.88、94.98、91.65 ppm異頭碳化學(xué)位移值均小于δ103，可推斷為α構(gòu)型糖殘基，δ104.3 ppm大于δ103 ppm，推斷是β構(gòu)型糖殘基。組分BP2在δ4.5～5.5 ppm的異頭氫質(zhì)子信號區(qū)同樣出現(xiàn)了能說明可能含有單糖殘基的質(zhì)子信號，分別為δ5.24、5.23、5.18、4.64 ppm，其中異頭氫化學(xué)位移為δ4.64 ppm小于δ4.95 ppm，是β構(gòu)型糖殘基。δ5.24、5.23、5.18 ppm異頭氫化學(xué)位移大于δ4.95 ppm，存在α構(gòu)型糖殘基。碳譜結(jié)果顯示BP2在δ90～110 ppm異頭碳信號區(qū)出現(xiàn)了δ104.37、100.95、98.79、96.92 ppm等4個信號峰，說明含有4種單糖殘基。其中δ100.95、98.79、96.92 ppm異頭碳化學(xué)位移值均小于δ103 ppm，可認(rèn)為是α構(gòu)型糖殘基。大于δ103 ppm的δ104.3 ppm可證明是β構(gòu)型糖殘基，見表2、3。

表2 多糖BP1的1H-NMR和13C-NMR 化學(xué)位移/ppm

表3 多糖BP2的1H-NMR和13C-NMR 化學(xué)位移/ppm

3 討論

高分子化合物多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，化學(xué)成分多樣[16]。多糖之所以具有不同的生物學(xué)活性是與 其結(jié)構(gòu)、單糖組成和相對分子質(zhì)量等有關(guān)[17]。

本研究通過水提醇沉的方法得到蕪菁粗多糖，進(jìn)一步分離純化后選擇含量較高的蕪菁均一多糖組分BP1、BP2，分析其相關(guān)結(jié)構(gòu)鑒定。結(jié)果顯示BP1和BP2相對分子質(zhì)量分別為 110 662，37 844，[a]為+18.83，+12.00；BP1，BP2均由Ara、Man、Glc、Gal組成，其摩爾比分別為1∶2.90∶16.48∶1.52，1.24∶2.03∶15.24∶1。IR分析結(jié)果可知組分BP1、BP2的單糖均為吡喃糖。α-D-Man-(1→，→6)α-D-Glc-(1→和→2,6和1→連接的β-D-Gal組成BP1主鏈，α-D-Man-(1→,→6)α-D-Glc-(1→組成支鏈。組分BP2主鏈由→6)α-D-Ara-(1→, →6)α-D-Man-(1→和→6，1→)連接的 β-D-Glc組成，→6和1→)連接的β-D-Glc組成支鏈。

以上研究分析只能推測多糖的一級結(jié)構(gòu)，為蕪菁多糖今后進(jìn)一步研究以及多糖的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。