李長忠 林 蓓 林 楊 戴天宇 李夢晴

1.山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東濟(jì)南 250000；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，天津 300000；3.吉林大學(xué)第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，吉林長春 132000；4.阜陽市婦女兒童醫(yī)院婦產(chǎn)科，安徽阜陽 236000

高危型人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）持續(xù)感染是女性宮頸癌的主要致病因素［1-2］。研究顯示，95%以上的宮頸癌都與高危型HPV感染有關(guān)［3］，其中以HPV16/18兩種基因型最為常見，占比高達(dá)70%～80%［4］。開發(fā)HPV16/18疫苗，對宮頸癌防控意義重大。研究發(fā)現(xiàn)，HPV16/18疫苗不僅可預(yù)防HPV16、18感染，還對HPV31、35、45、51、52等其他幾種基因型也具有較強(qiáng)或者部分交叉保護(hù)作用［5-6］。

HPV主要衣殼蛋白或稱晚期蛋白L1，是構(gòu)成HPV衣殼體的主要成分，在體外能自發(fā)組裝成與天然病毒結(jié)構(gòu)相似的類病毒顆粒（virus-like particle，VLP）［7-8］。HPV L1集中了主要的HPV中和表位及型特異性表位，免疫原性較高，是保護(hù)性HPV疫苗研發(fā)的主要靶點［9-10］?，F(xiàn)有3種上市HPV疫苗（2價、4價以及9價疫苗）的主要成分均為L1蛋白自發(fā)組裝成的VLP以及起輔助作用的免疫佐劑，其作用機(jī)制主要是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生L1特異的IgG和IgA中和抗體［11］；中和抗體能中和病毒、阻斷感染［11］。接種疫苗屬于主動免疫［12］，相反，抗體被動免疫也能發(fā)揮相應(yīng)的抗病毒作用［13］。但抗體的規(guī)模化制備和保存面臨不小挑戰(zhàn)。

雞卵黃抗體（eimmunoglobulin of egg yolk，IgY）技術(shù)的發(fā)展為解決抗體生產(chǎn)、儲存的難題提供了替代方案［14］。IgY的抗原結(jié)合能力與哺乳動物IgG相當(dāng)，但I(xiàn)gY穩(wěn)定性好、易于保存［15］。研究發(fā)現(xiàn)，IgY抗體在室溫下保存6個月對其活性無明顯影響，在37℃下也可保存長達(dá)1個月［15-16］。除了良好的熱穩(wěn)定性，IgY還耐酸、耐堿、耐多種蛋白酶處理［15-16］。雞蛋中IgY產(chǎn)量可觀，1只母雞1周內(nèi)下蛋所產(chǎn)生的IgY抗體量即與90～100 mL人血產(chǎn)生的IgG量相當(dāng)［15］；而且，由于IgY在蛋黃中高度富集（蛋黃IgY濃度比雞血漿濃度高6倍），比較容易從雞蛋中提取到高濃度的IgY［17］。研究顯示，母雞在接觸免疫抗原后，可在雞蛋中提取、制備高濃度的抗原特異IgY抗體，且免疫母雞的方式多為直接注射抗原蛋白［18-21］。但抗原蛋白成本較高，而且作用時間有限，一段時間過后特異抗體水平容易下降甚至消失，因此蛋白抗原往往需反復(fù)加強(qiáng)注射，才能刺激免疫動物的特異抗體水平維持穩(wěn)定。Wen等［22］使用乙型流感病毒特異的抗原蛋白每隔2周共5次免疫母雞，監(jiān)測不同時間點雞蛋中的病毒特異IgY滴度水平，發(fā)現(xiàn)滴度在初次免疫第2周開始升高，到第5周達(dá)到峰值，高水平維持4周后迅速降低，即第3次免疫1周后達(dá)到峰值，但在全部5次免疫完成2周后就急劇下降。

微環(huán)DNA（minicircle，MC）是一種去除了質(zhì)粒骨架成分的增強(qiáng)型非病毒基因載體，體積比普通質(zhì)粒小一半以上［23-24］。研究發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒大小與細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率負(fù)相關(guān)，質(zhì)粒越小，轉(zhuǎn)染效率越高［25］。由于MC明顯小于普通質(zhì)粒，顯然更有利于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。更重要的是，MC去除了質(zhì)粒骨架成分導(dǎo)致的轉(zhuǎn)基因沉默效應(yīng)［26］，可在體內(nèi)持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物［27］。借助某些理化手段的輔助，比如電穿孔（electroporation，EP）技術(shù)或MusFX技術(shù)（專利申請?zhí)枺篣S 15/640，577），MC可高效轉(zhuǎn)染肌肉細(xì)胞。通過螢火蟲熒光素酶報告基因顯示，本團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)MC在小鼠肌肉中可長期、穩(wěn)定、高水平表達(dá)數(shù)月甚至1年以上，表達(dá)信號仍未見明顯降低（未發(fā)表數(shù)據(jù)），因此MC也能用于特定抗原基因的持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)。

綜合考慮，本研究通過肌肉注射HPV16/18-L1 MC基因載體（MC.HPV L1）免疫母雞，從雞蛋蛋黃中提取HPV特異IgY抗體，研究其抗HPV作用。

1 材料和方法

1.1 載體構(gòu)建和MC制備

利用密碼子優(yōu)化工具GenSmart?Codon Optimization（https：//www.genscript.com/gensmart-freegene-codon-optimization.html），對HPV16/18-L1融合蛋白編碼序列（coding sequence，CDS）進(jìn)行密碼子優(yōu)化。優(yōu)化原則主要包括：根據(jù)家雞（Gallus gallus domesticus）密碼子偏好表，去除稀有密碼；調(diào)整GC含量，避免GC過高（＞70%）或過低（＜30%）；避免形成mRNA二級結(jié)構(gòu)；去除CpG二核苷酸、RNA不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域、重復(fù)序列等。進(jìn)一步在優(yōu)化序列N端依次引入Kozak序列（GCCACC）和組織纖溶酶原激活物信號肽（tissue plasminogen activator signal peptide，tPA.SP）編碼序列，組成全長DNA片段。其中，Kozak序列可促進(jìn)蛋白翻譯、增強(qiáng)目的基因表達(dá)，tPA.SP信號肽可引導(dǎo)HPV16/18-L1融合蛋白分泌。上述全長DNA片段由南京金斯瑞生物科技有限公司（GenScript，南京）合成。最后，將合成好的DNA片段插入改良的微環(huán)克隆載體多克隆位點（multiple cloning site，MCS）之中，構(gòu)建成HPV16/18-L1微環(huán)母質(zhì)粒。改良微環(huán)克隆載體命名為modified pMC.BESPX，是基于微環(huán)空載體pMC.BESPX改造而成，具體是在pMC.BESPX attB/attP重組位點之間依次插入了CMV啟動子、多克隆位點MCS以及牛生長因子polyA信號（bpA）等3個元件。

微環(huán)母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化基因工程大腸桿菌（ZYCY10P 3S2T22），利用Kay等［24］報道的標(biāo)準(zhǔn)微環(huán)DNA制備方法，制備HPV16/18-L1微環(huán)DNA（MC.HPV16/18-L1）。

1.2 免疫程序與HPV特異IgY制備

制備的HPV16/18-L1 MC作為免疫原，每只產(chǎn)蛋雞連續(xù)3天或每隔15天進(jìn)行基礎(chǔ)免疫，共免疫3次；3個月后，加強(qiáng)免疫1次。單次免疫條件如下：25 μg HPV16/18-L1微環(huán)稀釋于0.9%的氯化鈉溶液中，稀釋后總體積為1 mL；各取0.5 mL分別注射至母雞左右側(cè)胸脯肌肉，同時使用活體基因?qū)雰x（型號：寧波新芝WJ-2005型）對注射部分進(jìn)行電脈沖（電壓60 V，頻率60 Hz，間隔200 ms，脈沖數(shù)6次），促進(jìn)肌肉細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

基礎(chǔ)免疫完成15天后，開始收集雞蛋備用。將雞蛋外殼清洗干凈，傳遞至潔凈環(huán)境進(jìn)行消毒、干燥，用打蛋器打破蛋殼，分離并收集蛋黃。用細(xì)不銹鋼絲棒攪拌、刺破蛋黃膜，然后轉(zhuǎn)移至攪拌罐內(nèi)攪勻。再經(jīng)辛酸萃取、離心、深濾等步驟提取IgY抗體。IgY依次經(jīng)過1.0、0.45、0.22 μm濾器過濾除菌后，最后分裝。清洗后的所有工序均要求獨(dú)立的潔凈環(huán)境，其中，過濾除菌和分裝為萬級，其余均為十萬級。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定HPV特異IgY抗體效價

利用ELISA測定上述IgY分裝樣品的抗體效價。Chicken HPV16 L1 Ab ELISA Kit（#BEK1256）和Chicken HPV18 L1 Ab ELISA Kit（#BEK1257）均購自重慶巴而思生物科技有限公司，分別用于HPV16 L1和HPV18 L1 IgY抗體效價檢測。具體方法如下：將樣品對應(yīng)微孔按序編號，每板設(shè)陰性對照（未免疫的蛋黃提取樣品）2孔、陽性對照2孔、空白對照（不加樣品及酶標(biāo)試劑）2孔；每孔中加入不同稀釋倍數(shù)的IgY樣品100 μL；封板膜封板后置于37℃孵育90 min；加TBST洗滌液洗板、拍干，重復(fù)5次；每孔加酶標(biāo)試劑100 μL；封板膜封板后置于37℃孵育60 min；每孔加TMB顯色液100 μL，混勻，37℃避光顯色15 min；每孔加終止液100 μL，終止反應(yīng)。自動酶標(biāo)儀測定450 nm波長吸光度（optical density，OD）值，以（樣本OD均值-空白對照OD均值）/（陰性對照OD均值-空白對照OD值）≥2.1為陽性判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 HPV特異IgY的抗病毒治療方案

以HPV特異IgY作為主要成分，混合其他輔料，制成抗HPV凝膠產(chǎn)品（江蘇潤潔生物科技有限公司生產(chǎn)，商品名：曦曦愛），產(chǎn)品送重慶市食品藥品檢驗檢測研究院進(jìn)行產(chǎn)品效果檢測。采用ELISA方法檢測產(chǎn)品的卵黃抗體效價，檢測試劑盒為重慶巴而思生物科技有限公司生產(chǎn)的Chicken HPV16L1 antibody ELISA kit（#BEK1256）。

檢測曦曦愛抗HPV凝膠產(chǎn)品。在山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院、中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院、吉林大學(xué)第二醫(yī)院婦科招募20～65歲有性生活、HPV16/18陽性（單純HPV16、HPV18陽性感染者，或HPV16/18復(fù)合感染）的成年非孕女性作為研究對象。宮頸液基細(xì)胞學(xué)（thin prepcytology test，TCT）檢測結(jié)果包括：未見上皮內(nèi)病變、不典型鱗狀上皮細(xì)胞（atypical squamous cells of undeterm ined signification，ASC-US）或低度鱗狀上皮內(nèi)病變（low squamous intraepithelial lesion，LSIL）患者，除外非典型鱗狀上皮細(xì)胞不除外高度鱗狀上皮內(nèi)病變（ASCH）、高度鱗狀上皮內(nèi)病變（highly squamous intraepithelial lesions，HSIL）患者納入本研究。將患者隨機(jī)分為試驗組與對照組，其中，試驗組使用曦曦愛凝膠治療，睡前曦曦愛抗HPV凝膠陰道給藥，1支/d，1個治療周期為3個月，結(jié)束后8周復(fù)查HPV。對照組不用藥處理，復(fù)查時間同試驗組。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果判定：部分患者除HPV16/18外，還伴有其他基因型復(fù)合感染，如所有基因型均為陰性，認(rèn)為所有病毒已被清除干凈，定義為“完全轉(zhuǎn)陰”；如只清除了部分基因型，定義為“部分轉(zhuǎn)陰”；如還能檢測到所有基因型，則認(rèn)為該患者“未轉(zhuǎn)陰”。

本次臨床研究每個受試對象均被告知試驗的性質(zhì)、目的和過程，并且研究對象有權(quán)在不提出任何理由和不被妨礙進(jìn)一步治療的情況下退出試驗。所有研究對象均在入組前簽署書面知情同意書。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用軟件SAS 8.2進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料采用n（%）表示，兩組間比較采用卡方檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 微環(huán)DNA制備與鑒定

將合成好的全長DNA片段（Kozak-tPA.SPHPV16/18-L1 CDS）克隆至載體modified pMC.BESXP，構(gòu) 建 成HPV16/18-L1母 質(zhì) 粒（parental plasmid，PP）（圖1A）。PP轉(zhuǎn)化至基因工程細(xì)菌E coli.ZYCY10P3S2T體內(nèi)，PP隨著菌體培養(yǎng)在其體內(nèi)大量復(fù)制、擴(kuò)增。之后，添加阿拉伯糖，誘導(dǎo)E.coli ZYCY10P3S2T表達(dá)重組酶phiC31和識別I-SceI位點的核酸內(nèi)切酶。phiC31介導(dǎo)PP在attB/attP位點處發(fā)生DNA重組，形成微環(huán)DNA（minicircle，MC）和質(zhì)粒骨架DNA（plasmid backbone，PB）2個小型環(huán)狀DNA分子。MC含目的基因表達(dá)框和36 bp的attR重組位點，PB含質(zhì)粒復(fù)制起始位點ori、抗生素抗性基因Kan、32個串聯(lián)重復(fù)的I-SceI酶切位點ISceI*32和38 bp的attL重組位點。I-SceI核酸內(nèi)切酶可特異性識別并切割PB上的I-SceI位點，將骨架DNA線性化；線性DNA進(jìn)而被DNA酶消化、降解。最終，在工程菌ZYCY10P3S2T菌體內(nèi)只剩下了唯一的環(huán)狀DNA分子，即MC。提取MC，并對DNA樣品進(jìn)行瓊脂糖電泳分析，發(fā)現(xiàn)MC條帶接近理論大小3.5 kb（圖1B Lane 1），而對應(yīng)的PP理論大小為7.5 kb（圖1B Lane 3）。在MC樣品中，除了1條清晰的MC主條帶，還有1條僅隱約可見的PP雜帶存在，說明仍有極少量PP殘留（圖1B Lane 3）。使用軟件Image J計算電泳條帶灰度，進(jìn)一步估算出DNA樣品中殘留PP含量低于6.5%，而MC比例超過93.5%，即MC DNA純度＞93.5%。

圖1 HPV16/18-L1微環(huán)制備與鑒定

2.2 HPV16/18特異IgY抗體及凝膠產(chǎn)品效價

HPV16/18-L1微環(huán)免疫母雞后，從雞蛋黃中提取IgY，分別用HPV16、HPV18 L1抗體ELISA試劑盒測定其抗體效價，發(fā)現(xiàn)IgY樣品最大稀釋比例1∶4 096時，檢測結(jié)果仍為陽性，說明HPV16、18 L1抗體的效價為1∶4 096。

曦曦愛抗HPV凝膠產(chǎn)品經(jīng)重慶市食品藥品檢驗檢測研究院進(jìn)行產(chǎn)品效果檢測，結(jié)果顯示曦曦愛抗HPV凝膠產(chǎn)品的抗體效價為1∶1 024，報告編號2017TY2336（報告略）。

2.3 IgY可清除生殖道HPV感染

截止目前，共收集到276例HPV16/18陽性患者的信息，其中1例因藥物過敏而終止治療，2例隨訪信息存疑數(shù)據(jù)摒棄，對剩余273例進(jìn)行統(tǒng)計。試驗組183例，對照組90例。其中試驗組140例在治療前僅有HPV16和/或HPV18感染（HPV16單一感染102例、HPV18單一感染31例、HPV16/18共感染7例），經(jīng)HPV16/18 IgY治療后121例（86.4%）完全轉(zhuǎn)陰，3例（2.1%）HPV16/18已轉(zhuǎn)陰但分別新感染了HPV33、38、52，16例（11.4%）未轉(zhuǎn)陰；HPV16/18的轉(zhuǎn)陰率達(dá)88.6%。試驗組剩余43例在治療前不止HPV16/18陽性，還混合感染了1種或多種其他HPV基因型，如HPV31、33、39、45、51、52、58、59、66、68等，這些患者經(jīng)IgY治療后，有19例（44.8%）實現(xiàn)了完全轉(zhuǎn)陰，10例（23.3%）HPV16/18已轉(zhuǎn)陰但還有其他基因型感染，另外還有14例（32.6%）未轉(zhuǎn)陰。經(jīng)統(tǒng)計分析HPV16/18伴發(fā)其他基因型的轉(zhuǎn)陰率67.4%。對照組中單純HPV16和/或HPV18感染患者數(shù)量72例，完全轉(zhuǎn)陰14例（19.4%），部分轉(zhuǎn)陰7例（9.7%）；混合有其他基因型感染者數(shù)量18例，其中完全轉(zhuǎn)陰2例（11.1%），部分轉(zhuǎn)陰0例。曦曦愛抗HPV凝膠對臨床HPV16、HPV18型感染（包括單純HPV16/18感染、混合其他基因型HPV感染）的轉(zhuǎn)陰率為83.6%（153/183）。對照組（未干預(yù)組）未給予任何治療手段，依靠患者免疫力自我轉(zhuǎn)陰。研究結(jié)果顯示，對照組90例患者中HPV16、HPV18完全轉(zhuǎn)陰例數(shù)為23例，總體轉(zhuǎn)陰率僅為25.6%（23/90）。詳見表1。

表1 曦曦愛抗HPV凝膠產(chǎn)品對HPV16/18陽性患者的療效［n（%）］

3 討論

宮頸癌的發(fā)生與女性生殖道HPV持續(xù)感染，特別是以HPV16/18為代表的高危型HPV持續(xù)感染密切相關(guān)。HPV感染前的預(yù)防以及感染后的及時治療均是阻止宮頸癌發(fā)生的重要手段。目前，HPV疫苗已成功用于預(yù)防感染，但仍然缺乏有效的抗病毒治療手段。病毒特異的IgG抗體在清除感染的過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，一方面可中和或凝集病毒，阻止其侵染新的細(xì)胞，另一方面還可通過抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（antibody-dependent cellmediated cytotoxicity，ADCC）、抗體依賴的細(xì)胞吞噬 作 用（antibody-dependent cellular phagocytosis，ADCP）以及補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用（complementdependent cytotoxicity，CDC）等清除已感染的細(xì)胞，有望開發(fā)成治療藥物［28］。但商業(yè)化IgG抗體生產(chǎn)困難，價格昂貴，限制了其大規(guī)模應(yīng)用。IgY具有與IgG類似的抗原結(jié)合能力，熱穩(wěn)定性好、半衰期長，而且生產(chǎn)簡單、成本低廉，是IgG潛在的替代品。研究表明，IgY對甲型/乙型流感病毒、SARS冠狀病毒、ZiKA病毒、結(jié)核桿菌、綠膿桿菌等多種病毒或細(xì)菌感染都具有治療作用［22，29-33］。本 研究 初步 探 索HPV16/18-L1 MC誘導(dǎo)的IgY治療女性生殖道HPV16/18感染的可行性。

抗原免疫是誘導(dǎo)母雞產(chǎn)生特異IgY，隨后富集于雞蛋的前提。但有研究發(fā)現(xiàn)，蛋白抗原免疫作用時間有限，高水平特異IgY僅能維持?jǐn)?shù)周時間，因此特異IgY的生產(chǎn)原料也局限于這段時間內(nèi)所下雞蛋。MC去除了骨架DNA成分導(dǎo)致的轉(zhuǎn)基因沉默效應(yīng)，可在體內(nèi)肌肉組織中長期穩(wěn)定高水平表達(dá)；本團(tuán)隊通過小鼠實驗跟蹤了螢火蟲熒光素酶報告基因近1年的穩(wěn)定表達(dá)，且實驗結(jié)束時表達(dá)強(qiáng)度仍無明顯下降趨勢（數(shù)據(jù)未發(fā)表）。本團(tuán)隊通過編碼抗原基因的MC代替抗原蛋白免疫母雞肌肉組織，也可介導(dǎo)抗原基因的持續(xù)高表達(dá)，在體內(nèi)源源不斷地產(chǎn)生抗原蛋白，進(jìn)而持續(xù)刺激母雞產(chǎn)生特異免疫應(yīng)答，使相當(dāng)長時間內(nèi)的特異IgY抗體都維持在較高水平。本團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)，MC免疫與蛋白抗原加鋁佐劑免疫所激起的特異抗體水平峰值相當(dāng)，但MC維持高值的時間明顯更持久，長達(dá)1年（數(shù)據(jù)未發(fā)表）。此外，MC通過大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)生，避免了抗原蛋白表達(dá)純化的復(fù)雜過程。顯然，使用MC免疫相對抗原蛋白直接免疫具有節(jié)省生產(chǎn)成本的明顯優(yōu)勢。更重要的是，由于經(jīng)MV誘導(dǎo)的蛋黃特異IgY含量穩(wěn)定，更容易使特異IgY各批次間的質(zhì)量實現(xiàn)穩(wěn)定均一。

病毒特異的抗體通過ADCC、ADCP及CDC途徑清除感染細(xì)胞，分別依賴于抗體Fc端與NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、補(bǔ)體系統(tǒng)的結(jié)合。由于IgY Fc不同于哺乳動物（包括人）抗體Fc段，不能交叉結(jié)合哺乳動物的NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及補(bǔ)體，顯然IgY在人體中并不能發(fā)揮相應(yīng)的ADCC、ADCP、CDC作用。本研究觀察到HPV-L1 IgY對女性生殖道HPV感染有明顯療效，必然有其他“清除”HPV感染細(xì)胞的作用機(jī)制。HPV主要感染生殖道上皮細(xì)胞，這些細(xì)胞生存期短，更新頻繁。本研究推測，由于HPVL1特異IgY阻斷了病毒對新生健康上皮細(xì)胞的感染，而上皮細(xì)胞不斷更新，逐漸替代已感染的細(xì)胞，在經(jīng)過較長時間的治療后，最終有可能實現(xiàn)清除感染的目的。此外，持續(xù)感染的機(jī)體中仍然存在病毒特異的體液和細(xì)胞免疫，雖然強(qiáng)度有限，不足以徹底清除感染；但在局部高劑量特異IgY抑制感染的前提下，機(jī)體也有可能借助自身免疫加快清除感染的進(jìn)程。生殖道上皮細(xì)胞更新速率和機(jī)體自身免疫強(qiáng)度存在個體差異，特異IgY對少部分患者無效，可能跟這部分人生殖道上皮細(xì)胞更替較慢、機(jī)體免疫更弱有關(guān)，本團(tuán)隊正嘗試通過增加IgY療程解決這一問題。

部分患者除感染HPV16/18外還混合感染了其他HPV基因型，在IgY有效人群中，部分患者可以完全轉(zhuǎn)陰（44.2%），但也有不少患者只能部分轉(zhuǎn)陰（23.3%），其中包括清除了HPV16/18但仍有其他HPV基因型感染，推測除了患者生殖道上皮細(xì)胞更替速率和免疫水平的個體差異外，還跟HPV16/18抗體對其他HPV基因型的交叉作用強(qiáng)弱程度不一有關(guān)。HPV16/18抗體對HPV31、35、45、51、52等幾種基因型可能有或強(qiáng)或弱的交叉保護(hù)和治療作用［5-6］，但對其他的基因型無效?？紤]到HPV基因型的多樣性，提示需要開發(fā)廣譜HPV IgY抗體或者使用多種HPV基因型特異的IgY抗體組合才能充分應(yīng)對HPV混合感染的情況。

總之，本研究表明，HPV16/18-L1微環(huán)DNA免疫母雞能誘導(dǎo)較高滴度的HPV16/18-L1特異IgY持續(xù)穩(wěn)定產(chǎn)生，并且這些特異IgY顯示出良好的抗病毒能力，對多數(shù)HPV感染者有效，其中僅感染HPV16/18的患者中有超過8成實現(xiàn)了完全轉(zhuǎn)陰，為解決HPV持續(xù)感染的問題提供了一種可行思路。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突