王思拓，時 權(quán)，劉紫微，徐 娟

1 解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 100853；2 解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 口腔科，北京 100853

牙源性干細胞是來源于牙齒組織的間充質(zhì)干細胞，起源于頭顱神經(jīng)嵴細胞，在組織工程領(lǐng)域引起了越來越多的關(guān)注。目前已分離并鑒定出了多種牙源性干細胞，如括牙髓干細胞(dental pulp stem cells，DPSCs)、根尖乳頭干細胞(stem cells from apical papilla，SCAPs)、脫落乳牙 干 細胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHEDs)、牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)、牙囊前體細胞(denta follicle progenitor cells，DFPCs)、牙齦間充質(zhì)干細胞(gingival mesenchymal stem cells，GMSCs)、牙 胚 干 細胞(tooth germ stem cells，TGSCs)和牙槽骨骨髓間充質(zhì)干細胞(alveolar bone marrow mesenchymal stem cells，ABMSCs)。與其他組織來源的干細胞相比，牙源性干細胞具有許多生物學(xué)特性。相比于骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)，GMSCs具有更快的體外增殖速度，且表現(xiàn)出更強的成骨能力[1]。此外，ABMSCs的成骨能力優(yōu)于長骨骨髓間充質(zhì)干細胞[2]。然而，干細胞療法具有突變致瘤，免疫排斥和倫理限制等局限性[3]。最近的研究表明干細胞療法的有效性很大程度上得益于其旁分泌效應(yīng)，作為旁分泌效應(yīng)的重要媒介，外泌體是細胞主動向胞外分泌的一種直徑為30～150 nm的囊泡樣小體，具有磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)并含有RNA (miRNA和lncRNA等)、DNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等多種內(nèi)容物，最早在網(wǎng)織紅細胞中被發(fā)現(xiàn)，并在1987年被命名為“Exosome”[4]。

外泌體可由多種細胞(如樹突狀細胞、干細胞、上皮細胞、腫瘤細胞等)在生理或病理狀態(tài)下分泌，廣泛存在于血液、尿液、唾液、腹腔積液和膽汁等體液中[5]。外泌體主要通過配體/受體識別、膜融合或吞噬等方式進入靶細胞，并將其攜帶的內(nèi)容物直接釋放到靶細胞的胞質(zhì)中，通過激活相關(guān)信號通路影響靶細胞的微環(huán)境和相應(yīng)生物學(xué)功能，發(fā)揮細胞間通訊的作用[5-6]。研究表明，外泌體與其供體細胞有著相似的生物學(xué)效應(yīng)[5]。因此，來自不同細胞類型或不同細胞狀態(tài)的外泌體，可能具有不同的生物學(xué)功能。

骨修復(fù)再生是一個復(fù)雜的過程，包括組織再生、血管生成和免疫調(diào)節(jié)等過程，其不僅涉及骨髓干細胞、成骨細胞、破骨細胞、骨前體細胞等骨相關(guān)細胞，免疫細胞、血管內(nèi)皮細胞等其他系統(tǒng)細胞在骨修復(fù)再生中也發(fā)揮著重要作用[7]。外泌體作為細胞間通訊的重要媒介物質(zhì)，能夠通過影響多種細胞的功能來參與骨修復(fù)再生過程。近年來人們從多種牙源性干細胞中分離提取外泌體并研究其相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。牙源性干細胞來源外泌體在組織修復(fù)再生、免疫調(diào)節(jié)和生物學(xué)發(fā)育等過程中發(fā)揮重要作用[8]。本文將對牙源性干細胞來源外泌體應(yīng)用于骨修復(fù)再生中的研究進展做一闡述。

1 DPSCs來源外泌體與骨修復(fù)

DPSCs是最先被發(fā)現(xiàn)的牙源性干細胞[9]，由外胚層神經(jīng)嵴發(fā)育而來。因此，DPSCs來源外泌體(DPSCs-derived exosomes，DPSCs-Exos)與牙髓再生[10]、神經(jīng)退行性疾病[11]等神經(jīng)再生過程密切相關(guān)。同時，DPSCs-Exos在骨組織工程領(lǐng)域也展現(xiàn)出較好的骨修復(fù)效果。Swanson等[12]將PLGAPEG共聚物微球材料作為載體包裹DPSCs-Exos構(gòu)建外泌體緩釋體系，將控釋DPSCs-Exos的微球材料植入小鼠顱骨缺損模型中進行骨修復(fù)，8周后發(fā)現(xiàn)顱骨缺損修復(fù)效果顯著。該研究還表明DPSCs-Exos可以促進BMSCs的成骨分化，且DPSCs-Exos與骨髓間充質(zhì)干細胞來源外泌體對BMSCs的體外成骨效果相似[12]。

Xie等[13]對經(jīng)成骨誘導(dǎo)不同時間的DPSCs來源外泌體進行circRNA轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)經(jīng)成骨誘導(dǎo)的DPSC-Exos中環(huán)狀溶血磷脂酸受體1(circLPAR1)表達量增加，增加程度與供體細胞成骨分化程度一致。該研究同時發(fā)現(xiàn)，circLPAR1可通過與hsa-miR-31結(jié)合而消除hsa-miR-31對DPSCs的成骨抑制作用，從而促進受體同型DPSCs的成骨分化[13]。

miRNA在DPSCs-Exos促進骨形成中發(fā)揮重要作用。DPSC-Exo攜帶的miR-1246可以促進巨噬細胞從促炎表型轉(zhuǎn)化為抗炎表型，并有效減輕了牙周炎小鼠的牙槽骨吸收和炎癥反應(yīng)[14]。與未經(jīng)表面修飾的DPSCs-Exos相比，miR-140-5p修飾的DPSCs-Exos抑制了IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞凋亡，并減輕了大鼠骨關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)[15]。

2 PDLSCs來源外泌體與骨修復(fù)

牙周膜干細胞已被證實為外泌體的可靠來源細胞[16]。體外研究表明，PDLSCs來源外泌體(PDLSCs-derived exosomes，PDLSCs-Exos)具 有促進血管生成[17]、調(diào)節(jié)成骨細胞活性[18]、免疫調(diào)節(jié)[19-20]和抗炎[21]等作用，TGF-β、MAPK、mTOR、FoxO信號通路[22]、PI3K/Akt[23]和NF-κB信號通路[24]在其中扮演重要角色。Liu等[25]研究發(fā)現(xiàn)，PDLSCs-Exos具有促進大鼠BMSCs成骨分化的作用，且經(jīng)成骨誘導(dǎo)后的PDLSCs-Exos對大鼠BMSCs的促成骨作用明顯增強。PDLSCs-Exos在骨修復(fù)再生中的積極作用在體內(nèi)實驗中也得到了同樣的結(jié)果。Pizzicannella等[26]通過構(gòu)建大鼠顱骨缺損模型，將負載聚乙烯亞胺(polyethyleneimine，PEI)工程化PDLSCs-Exos的3D膠原膜材料置入缺損部位，6周后發(fā)現(xiàn)顱骨缺損區(qū)域骨修復(fù)效果明顯，且骨形成與血管生成增加密切相關(guān)。

在PDLSCs-Exos的成骨機制方面，通過RNA測序技術(shù)分析不同狀態(tài)的細胞來源外泌體中差異表達的miRNA，發(fā)現(xiàn)與未經(jīng)成骨誘導(dǎo)的PDLSCs-Exos相比，經(jīng)成骨誘導(dǎo)的PDLSCs-Exos中72個miRNA上調(diào)，35個miRNA下調(diào)，其中miR-122-5p、miR-25-3p和miR-142-5p等成骨相關(guān)miRNA在經(jīng)成骨誘導(dǎo)的PDLSCs-Exos中高表達[25]。PDLSCs-Exos攜帶的miRNA可以通過靶向調(diào)控成骨相關(guān)信號通路的靶基因影響細胞的成骨分化過程[25]。另有研究表明，與未經(jīng)成骨誘導(dǎo)的PDLSCs-Exos相比，經(jīng)成骨誘導(dǎo)5 d和7 d的PDLSCs-Exos中3個circRNA和2個lncRNA上調(diào)，39個circRNAs和5個IncRNAs下調(diào)，且這種上調(diào)或下調(diào)趨勢呈時間依賴性[22]。

3 GMSCs來源外泌體與骨修復(fù)

由于GMSCs的生物學(xué)特性，GMSCs來源外泌體(GMSCs-derived exosomes，GMSCs-Exos)的生物學(xué)功能也被逐漸關(guān)注。多項研究表明，GMSCs-Exos在組織修復(fù)與再生中具有良好的作用[27-28]。GMSCs-Exos可以增強成骨細胞的遷移和成骨分化[29]。Diomede等[30]將GMSCs-Exos與PLA材料結(jié)合并置入大鼠顱骨缺損中，發(fā)現(xiàn)GMSCs-Exos能夠有效促進骨缺損區(qū)域的骨再生及血管再生。同時，PEI工程化GMSCs-Exos的骨修復(fù)和血管再生效果更好，GO分析結(jié)果顯示PEI工程化GMSCs-Exos上調(diào)了19個成骨相關(guān)基因的表達[30]。骨代謝主要依靠成骨與破骨的相互平衡，以達到修復(fù)骨缺損的目的。GMSCs-Exos在促進成骨的同時，還具有抑制破骨的特性[31]。Nakao等[31]通過結(jié)扎誘導(dǎo)構(gòu)建小鼠牙周炎模型并向炎癥區(qū)域局部注射GMSCs-Exos或TNF-α預(yù)處理的GMSCs-Exos(GMSCs-Exos-TNF) 1周后，與注射PBS的對照組相比，GMSCs-Exos組和GMSCs-Exos-TNF組中破骨細胞數(shù)量和牙槽骨吸收程度均降低，其中GMSCs-Exos-TNF組抑制破骨效果更明顯。

4 其他牙源性干細胞來源外泌體與骨修復(fù)

除上述 3 種牙源性干細胞來源外泌體，SHEDs來源外泌體(SHED-derived exosomes，SHED-Exos)、根間乳頭干細胞來源外泌體(SCAPs-derived exosomes，SCAPs-Exos)、DFPCs來源外泌體(DFPCs-derived exosomes，DFPCs-Exos)在骨缺損修復(fù)中也表現(xiàn)出潛在的治療效果。多項研究表明，SHED/SCAPs/DFPCs-Exos在血管生成[32-33]、炎性調(diào)節(jié)[34]、成骨再生[33,35-36]中發(fā)揮積極作用。體外研究表明，SHED-Exos可以促進BMSCs的成骨分化并抑制其脂質(zhì)生成[35]，也可通過Wnt/β-catenin和BMP/Smad信號通路促進PDLSCs的成骨分化[36]。已有多項體內(nèi)實驗驗證了SHED-Exos在抗炎和骨缺損修復(fù)中的作用[33-35]。Wei等[35]在結(jié)扎誘導(dǎo)的牙周炎小鼠模型中以每周1次的頻率局部注射SHED-Exos并持續(xù)2周后發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，SHED-Exos組牙槽骨吸收程度減輕，骨高度增加。此外，Wu等[33]在大鼠下頜第一磨牙至第三磨牙頰側(cè)牙槽骨處制備4 mm ×2 mm × 1.5 mm的牙槽骨缺損并將負載SHEDExos的β-TCP材料填塞到缺損部位4周后發(fā)現(xiàn)，與空白缺損組和β-TCP支架組相比，含有SHEDExos的支架組新生血管形成和新骨形成明顯增加。另有研究表明，SHED-Exos可通過miR-100–5p/mTOR信號通路增強顳下頜關(guān)節(jié)炎軟骨細胞的抗炎能力，這為顳下頜關(guān)節(jié)炎的治療提供了新的思路[34]。Shi等[37]研究發(fā)現(xiàn)，DFPCs-Exos可減少牙周炎大鼠模型中牙槽骨的吸收和破骨細胞的數(shù)量，LPS預(yù)處理的DFPCs-Exos抑制破骨效果更顯著。

在分子機制層面，piRNA表達譜可能影響外泌體的生物學(xué)功能。Wang等[38]從SHED-Exos和BMSCs-Exos中分別鑒定出593個和920個已知的piRNA，發(fā)現(xiàn)21個piRNA在兩種外泌體中有差異表達，其中15個piRNA在SCAPs-Exos中上調(diào)、6個piRNA在SCAPs-Exos中下調(diào)。SHEDExos中高表達的piRNA主要與細胞代謝、細胞增殖和分化、牙齒發(fā)育和骨組織形成相關(guān)信號通路有關(guān)，這為進一步研究牙源性干細胞來源外泌體的骨修復(fù)機制提供了新的方向[38]。

5 結(jié)語

干細胞來源外泌體具有廣闊的應(yīng)用前景，其相比于直接應(yīng)用干細胞治療，具有以下潛在優(yōu)勢：1)免疫原性低；2)外泌體治療可以有效避免與直接應(yīng)用干細胞治療相關(guān)的安全性問題，并且易于制備和運輸；3)外泌體作為納米顆粒，可以穿過多種屏障(如血-腦脊液屏障、毛細血管等)，且可以直接被靶細胞攝取并作用于靶細胞，作用效率更高[39]。目前，牙源性干細胞來源外泌體的研究仍處早期階段，針對其在骨修復(fù)再生中的研究相對較少，且停留在細胞分子、動物實驗等基礎(chǔ)研究階段。有限的動物實驗多采用口腔頜面部骨缺損或疾病模型，如顱骨缺損[12,26,30]、牙槽骨缺損[33]、結(jié)扎誘導(dǎo)的牙周炎[14,17,21,31,35]模型，關(guān)于其在機體其他部位骨缺損和骨疾病模型中的應(yīng)用研究鮮有報道。此外，牙源性干細胞來源外泌體的成骨方面具體機制尚不明確，許多具體應(yīng)用問題亟待解決，還有許多新的領(lǐng)域需要我們發(fā)現(xiàn)和探索。