周羽 陳路 四川大學華西第二醫(yī)院西部婦幼醫(yī)學研究院疾病基因轉錄剪切調(diào)控實驗室/出生缺陷與相關婦兒疾病教育部重點實驗室 （四川成都 610041）

內(nèi)容提要： 流式細胞分選技術在基礎科研和臨床醫(yī)學研究中的應用廣泛。為提高分選操作效率，保障分選過程中故障能夠及時處理，文章對BD（FACSAria III）流式細胞分選儀分選中常見問題分析和處理進行簡單介紹。

流式細胞分選儀可以通過細胞大小、形態(tài)、顆粒復雜程度及細胞特異性標志物等多參數(shù)對細胞進行鑒別區(qū)分。流式細胞分選技術在臨床和科研工作中應用范圍涉及腫瘤學、血液學和免疫學等領域[1-4]。特別是在疾病診斷、療效評估、微生物檢測、物種倍性鑒定和金屬納米顆粒檢測等生物醫(yī)學研究及制藥工業(yè)領域都有廣泛的應用[5-10]?？蒲泄ぷ髦袠颖痉诌x前的準備通常還存在樣本處理過程繁瑣、樣本需分批收集、分選前后樣本需保持活性等特點。因此，儀器分選過程中對儀器操作員的分選經(jīng)驗有一定的要求。分選不順利不僅延長整個實驗周期，還會造成人力、物力和財力的浪費，因此，儀器日常維護和專業(yè)技術培訓非常重要[11,12]。流式技術的發(fā)展關注精準性、易操作性、檢測參數(shù)量、高純度、高通量、靈敏度、流式數(shù)據(jù)展示以及數(shù)據(jù)分析等方面。新一代的流式細胞儀如量化成像分析流式細胞儀結合了熒光顯微成像技術，可以將細胞信息進行量化成像分析，可用于藥物篩選研究和外周血循環(huán)腫瘤細胞的檢測[13-15]。本綜述針對常用的流式細胞分選儀（BD FACSAria III）日常分選過程中經(jīng)常遇到的問題進行詳細的分析和整理。

1.流式細胞分選技術

1.1 流式分選技術優(yōu)勢

流式細胞儀可以根據(jù)不同的熒光信號對特異抗原、單個分子（DNA、RNA、蛋白）以及微生物進行特定分析和分選。流式細胞分選技術是最有效和快速的細胞分選技術。由于該技術對細胞分選具有高純度、高活性以及高速的特點，因此流式分選技術在高純度目的細胞、低含量細胞和多孔板分選中有顯著優(yōu)勢。特別是BD FACSAria III在選擇單細胞分選模式后可以很快地結合下游單細胞建庫測序及其他實驗。

1.2 流式分選原理

BD FACSAria Ⅲ型號流式分選儀具有卓越的多色性能，可以配置六根激光，具備18色的檢測能力，能夠滿足多色交叉的復雜分選方案。同時該儀器自動化操作性強，具有較高分析靈敏度、分辨率和回收率等性能，在細胞分選中具有廣泛的應用。分選進行時，樣本中的細胞在壓力的驅動下以液流形態(tài)通過石英杯流動池，激光聚焦到樣本流上，細胞產(chǎn)生光學信號并被收集[16]。被圈定的目的細胞在電極板的加電作用下帶上不同的電荷，分選倉可以給液滴充上正電荷或負電荷以及不同的電量，液滴的偏轉角度被調(diào)節(jié)到合適的位置，因此包裹目的細胞的液滴可以實現(xiàn)多路分選，最多可以同時完成四路分選。在軟件的分選調(diào)節(jié)窗口呈現(xiàn)的操作是調(diào)節(jié)電壓的強弱就可以將包裹著細胞的液滴依次有序地分選到不同的收集管里。

1.3 影響流式分選的因素

流式分選過程涉及樣本制備、樣本保存、儀器校準質控、電壓設置、補償調(diào)節(jié)、圈門及數(shù)據(jù)分析等關鍵步驟[17]。①分選前，由于流式細胞分選的細胞純度和效率與分選細胞樣本的狀態(tài)和染色、離心等操作有關。因此，分選前需要保持細胞的活性，選擇合適的細胞緩沖液，并且避免過高離心轉速對細胞造成損害。②分選中，分選細胞的純度和得率與儀器的液流狀態(tài)和分選模式選擇有關，比如分選前后需要檢查維護儀器液流系統(tǒng)、分選倉、收集倉等關鍵部件處于正常狀態(tài)。因此，分選過程中樣品、儀器和軟件的實時監(jiān)控顯得尤為重要。分選過程中液流出現(xiàn)不穩(wěn)定狀態(tài)時，已調(diào)節(jié)好的液滴延遲時間可能不適用，液滴加電時間不準確，造成非目的細胞被分選到收集管中，從而間接影響了分選細胞的純度。分選模式通常有三種：富集模式、純化模式和單細胞模式。富集模式使所有含陽性細胞的液滴都被選中，而純化模式是所有含陰性細胞的液滴都被舍棄。因此選擇不同的分選模式會直接影響目的細胞的得率。此外，上樣細胞的大小和濃度不同，分選過程中需要調(diào)節(jié)細胞的上樣速率，保證細胞的分選效率。③分選后，由于實驗目的不同，分選的細胞將用于培養(yǎng)或者裂解后提取核酸等。在對細胞活性要求較高的情況下，需要對分選過程中無菌環(huán)境進行嚴格把控，包括儀器無菌管路準備，分選操作人員取樣、過濾、上樣時進行無菌消毒處理，儀器上樣倉和樣品接收倉表面噴灑酒精消毒。如果分選后的細胞將用于提取RNA，細胞也需要保持較高的活性，否則細胞破碎會使釋放出來的RNA被迅速降解。通常實驗人員會在細胞緩沖液中加入防止RNA降解的成分，同時收集器連接冷凝管使樣本保持4°C，并且收集到的細胞應及時進行后續(xù)實驗處理。

2.分選中常見問題分析及處理（BD FACSAria lll）

2.1 液流紊亂

液流紊亂是流式細胞分選儀在分選過程中最常見的現(xiàn)象，操作人員需要及時發(fā)現(xiàn)和處理并首先關掉液流，否則會首先影響儀器的整個液流系統(tǒng)，造成樣本的浪費，影響目的細胞的分選效果。液流突然紊亂的原因及解決方法通常有：①液流存在氣泡：分選前如果鞘液過濾器中氣泡沒有排完，分選中液流就會受影響，需要重新徹底檢查氣泡是否排完；②液路出現(xiàn)漏液：檢查液路管是不是漏液，拔掉重新扣緊，或者是管子里的密閉圈磨損了，磨損的話則更換密閉圈；③氣路存在漏氣：檢查氣管是不是沒有扣緊或者鞘液桶的蓋子周圍漏氣，可以用手感受一下，如果是密封圈磨損，則及時更換；④樣本中有雜質或細胞粘黏嚴重堵住了流動室的噴嘴，因此超聲清洗噴嘴，樣本重新過濾處理后再上機。

2.2 上樣速率

問題描述：設備運行過程中，上樣速率突然變?yōu)?evt/s，但是液流窗口顯示液流處于正常狀態(tài)?？赡茉颍菏紫葯z查上樣倉中流式樣品管是否還有細胞懸液，排除細胞樣本跑完造成的流速為零。該現(xiàn)象最常見的原因是樣本中細胞成團對上樣倉中進樣針或噴嘴造成堵塞。處理方法：①細胞堵管道了，準備一管次氯酸，以最高速沖洗后，選擇進樣針反沖；②如果是進樣針外壁細胞聚團，進樣針反沖無法清洗干凈，樣本運行中就會出現(xiàn)堵塞，這時需要在擰旋鈕處畫個標記，擰開后取出進樣針，打開進樣針反沖，用吸水紙擦拭外壁，再按照之前標記的位置組裝好后放回去；③如果是噴嘴堵了，將噴嘴超聲處理。

2.3 分選速率

問題描述：儀器分選過程中分選速率變?yōu)?evt/s，但是樣本流速正常?？赡茉蚣疤幚矸椒ㄓ校孩倥懦康募毎Φ拈T是開放式的門；②目的細胞所圈門的前面一個邏輯門位置避免處于信號過弱的位置；③目的細胞所在的門稍微移動下，有時可能是目的細胞比例極低，收集一定數(shù)量級目的細胞所需分選時間較久造成的軟件識別反應滯后。

2.4 流式散點圖形態(tài)改變

問題描述：樣本運行時散點圖中細胞信號點突然全部壓線，緊貼坐標軸，而電壓并沒有改變過并且液流處于穩(wěn)定狀態(tài)?？赡茉颍和ǔＪ菄娮斓目讖竭M了氣泡，但是又沒有完全堵住噴嘴的孔徑，因此還是會有液滴下落，細胞是擠著通過變窄的孔徑的。處理方法：暫停液流，將噴嘴取下后重新安裝，必要時超聲處理噴嘴。

2.5 液滴延遲時間的調(diào)節(jié)

液滴延遲是指細胞經(jīng)過激光檢測區(qū)域到液滴分離斷點之間的距離的時間。液滴延遲時間的確定關乎液滴最佳充電的時間，與最終細胞分選純度和得率相關。因此液滴延遲的調(diào)節(jié)在流式分選過程中顯得尤為重要。目前BD FACSAria III流式細胞儀有產(chǎn)品化的Accudrop微球，可以按照操作說明進行自動校準。但在實際過程中容易出現(xiàn)校準失敗的情況，可能的原因及處理辦法：①液流不穩(wěn)。分選的液流需要達到最佳狀態(tài)，也就是振幅和頻率是比較穩(wěn)定的狀態(tài)，必要時需要重新調(diào)節(jié)。②Accudrop微球上樣不符合要求。檢查Accudrop微球是否在效期內(nèi)并且最好是現(xiàn)配現(xiàn)用，確保微球的上樣速率在合適的范圍，通常速率要求是600～1500evts/s。

2.6 電極板加電錯誤

問題描述：流式儀分選倉中的電極板加電時會不斷報錯，提示加電發(fā)生錯誤，而儀器上電壓指示燈呈現(xiàn)紅色狀態(tài)，這在分選中并不常見，但通常會發(fā)生在儀器開機時間過長，樣本分選操作頻繁的情況。電極板電壓傳感和軟件連接失靈，電極板無法加電也不能關掉，重啟軟件或者機器也不能改善。原因分析及處理方法：可能放置儀器的房間里溫度過高，影響分選儀電極板加電，可以調(diào)低空調(diào)設置溫度，將儀器打開上蓋和右側蓋進行降溫后再開機進行分選。

2.7 四路分選

問題描述：流式細胞儀在四路分選過程中主液流分叉調(diào)節(jié)很重要。有時候會出現(xiàn)中心液流和左一路、左二路、右一路、右二路液流采集點幾乎連成一條線的現(xiàn)象，該現(xiàn)象說明中心液流分叉很嚴重，而分選過程中主液流中細胞屬于非目的細胞，分叉嚴重會導致非目的細胞通過左右兩邊的分液流被分選到流式收集管里?？赡艿脑蚣疤幚矸椒ǎ孩俜诌x過程中液流突然出現(xiàn)不穩(wěn)定的現(xiàn)象，干擾了電極板對液滴的加電。可以暫停分選，微調(diào)液流窗口中的amp，通常分選窗口液流的穩(wěn)定性會有改善。②電極板表面有雜質，分選過程中液流濺到電極板表面，水分蒸發(fā)后留下PBS顆粒，也會干擾電極板對液滴的加電?？梢杂妹藓灢潦秒姌O板，液流分叉的情況會有改善。

3.小結

流式細胞分選儀（BD FACSAria III）屬于大型精密儀器，儀器硬件故障率較低，而分選中經(jīng)常會遇到一些高頻率故障。光學系統(tǒng)方面，激光器每日啟動后的穩(wěn)定狀態(tài)，可以通過儀器標準的質控流程檢測，如有問題，需要及時調(diào)試；液流系統(tǒng)方面，液路紊亂或斷流是發(fā)生頻率較高的故障，需要實驗人員做出及時處理；分選方面，液滴延遲和分選角度等在正式分選前調(diào)試好，在整個分選操作結束之前需要關注整個儀器運作的液路、光路、樣本量剩余等穩(wěn)定狀態(tài)。待分選的細胞如果能夠盡快順利地進入分選流程，那么細胞是最大程度地保持了最佳狀態(tài)，這有利于后續(xù)的實驗。實驗操作員熟練掌握流式分選技術可以保障細胞樣本在最佳活性狀態(tài)下完成分選。當流式細胞儀出現(xiàn)不穩(wěn)定狀態(tài)或者故障時，儀器操作員如果能夠查找原因，做出正確的分析并及時處理，不僅能夠保證樣本的分選純度，還能夠避免儀器各貴重部件的進一步損壞，這有利于大型儀器的長期維護工作。同時避免了流式分選樣本浪費的可能，盡可能地保證了樣本中目的細胞的順利分選。此外，實驗人員可以參照包括血液學、免疫學等不同領域研究的流式操作指南，可以更詳細了解樣本分選前的樣本處理、樣本染色及分選中和分選后的注意事項。因此只有對流式分選原理和流程有清楚的認識，明確分選過程中導致分選中斷的可能原因，才能排除故障并做出及時的處理，從而起到縮短分選時間，保證科研項目的順利進行，為高校節(jié)約科研經(jīng)費和為醫(yī)院節(jié)省檢驗成本的作用。