崔帥帥 綜述 楊曉紅 審校(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，貴州 遵義 563000)

骨穩(wěn)態(tài)取決于成骨細(xì)胞的骨形成和破骨細(xì)胞的骨破壞的平衡。BMSCs是一種異質(zhì)性的干細(xì)胞，可以從許多不同來源獲得，并分化為中胚層類型譜系，包括成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞[1]。BMSCs廣泛應(yīng)用于干細(xì)胞移植、基因治療、組織工程和免疫治療等領(lǐng)域[2]。BMSCs通常從骨髓抽吸物中分離并表征其特征，無(wú)論是科學(xué)研究，還是臨床目的，BMSCs都被認(rèn)為是最有希望的骨再生細(xì)胞來源[3]。BMSCs具有向成骨譜系分化的高親和力，其向成骨細(xì)胞分化是骨再生和修復(fù)過程中的關(guān)鍵步驟[4]，但同時(shí)BMSCs也有向脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞分化等潛能。在衰老或其他病理刺激下，如激素紊亂等，BMSCs向脂肪細(xì)胞分化增多[5]，導(dǎo)致骨髓環(huán)境中脂肪組織過度堆積，骨微結(jié)構(gòu)改變，骨骼脆性增加，骨折風(fēng)險(xiǎn)變大[6]。然而，BMSCs干細(xì)胞的譜系分配傾向于成脂或成骨譜系的明確機(jī)制尚不清楚。證據(jù)表明[7]，BMSCs的成骨分化與多種遺傳因素密切相關(guān)，如信號(hào)分子、生長(zhǎng)因子等，但近年來細(xì)胞分化的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制越來越受到關(guān)注。最近的研究證據(jù)[8]表明，表觀遺傳修飾，如組蛋白乙?；虳NA甲基化，參與了BMSCs在骨再生過程中的細(xì)胞分化過程。N6-甲基腺嘌呤(m6A)修飾作為表觀遺傳調(diào)控的另一層(RNA表觀遺傳學(xué))，最近被報(bào)道在胚胎干細(xì)胞(ESCs)和各種癌細(xì)胞類型的細(xì)胞功能和分化中發(fā)揮重要作用[9]。然而，對(duì)于m6A修飾在BMSCs細(xì)胞分化中的作用知之甚少。鑒于m6A與健康和疾病的強(qiáng)烈相關(guān)性，學(xué)者們對(duì)于m6A在骨穩(wěn)態(tài)中的潛在作用也做出了重要的探索，本文將對(duì)m6A在骨發(fā)育過程中的相關(guān)研究作一綜述。

1 N6-甲基腺嘌呤(m6A)修飾概述

N6-甲基腺嘌呤(m6A)是最普遍的轉(zhuǎn)錄后內(nèi)部mRNA修飾，參與多種生物過程的微調(diào)[10]。在哺乳動(dòng)物中，m6A由甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物(MTC)催化，該復(fù)合物由一個(gè)酶亞基甲基轉(zhuǎn)移酶樣3(METTL3)和一個(gè)底物識(shí)別亞基甲基轉(zhuǎn)移酶樣14(METTL14)和一個(gè)調(diào)節(jié)亞基Wilms腫瘤1相關(guān)蛋白(WTAP)等蛋白組成，多種蛋白質(zhì)共同參與調(diào)節(jié)MTC的功能，從而使m6A甲基化能夠高效、精準(zhǔn)的調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)功能。MTC可以被去甲基酶脂肪與肥胖相關(guān)蛋白(FTO)和人類ALKB同系物5(ALKBH5)清除[11]，使m6A修飾成為動(dòng)態(tài)可逆的過程。在分子水平上，m6A標(biāo)記可以動(dòng)態(tài)安裝和從其被調(diào)控的轉(zhuǎn)錄本中移除，以調(diào)節(jié)RNA代謝，包括選擇性剪接、RNA穩(wěn)定性和翻譯[12]。m6A發(fā)揮作用的主要機(jī)制是通過招募m6A結(jié)合蛋白，可以被含有YTH (YT521B同源性)結(jié)構(gòu)域的蛋白識(shí)別，也可以被真核起始因子3 (eIF3)識(shí)別[13]，進(jìn)而影響RNA的加工和表達(dá)。

2 m6A在成骨分化中的正向調(diào)控作用

一項(xiàng)研究[14]通過RNA測(cè)序證實(shí)，METTL3基因敲除后，大量受影響的基因與成骨分化和骨礦化相關(guān)，如Runx2、Osterix、ALP等。METTL3通過調(diào)節(jié)PI3K-Akt信號(hào)通路和VEGF的表達(dá)水平影響B(tài)MSCs的成骨分化。抑制METTL3可降低BMSCs成骨分化過程中Akt磷酸化、Vegfa及其選擇性剪切的表達(dá)水平。G.Yan等[15]利用m6A RNA免疫沉淀(RIP)芯片發(fā)現(xiàn)pre-miR-320是BMSCs中METTL3靶基因中m6A甲基化最強(qiáng)烈的基因，在METTL3沉默后其甲基化顯著降低。此外，他們進(jìn)一步證明了RUNX2是miR-320的靶基因，而METTL3/m6A通過雙重機(jī)制上調(diào)RUNX2的表達(dá)水平來實(shí)現(xiàn)成骨：(1) METTL3/m6A通過抑制pre-miR-320和miR-320上調(diào)RUNX2水平；(2)METTL3/m6A促進(jìn)RUNX2 mRNA的直接甲基化，提高其表達(dá)水平和細(xì)胞穩(wěn)定性。

3 m6A在成骨分化中的負(fù)向調(diào)控作用

然而，還有一些不同的聲音。J.Yu等[16]研究發(fā)現(xiàn)METTL3正調(diào)控MYD88的表達(dá)，MYD88是NF-κB的擴(kuò)散接受調(diào)節(jié)因子，隨后激活NF-κB信號(hào)通路，而NF-κB信號(hào)通路被認(rèn)為是成骨的抑制因子，從而負(fù)調(diào)控成骨。不過，這種傾向可以被去甲基化酶ALKBH5逆轉(zhuǎn)。在另一項(xiàng)研究[17]中也證明了METTL3在體外和體內(nèi)均抑制成骨過程，而這種作用是通過METTL3/ mir-712-5p/FGFR3軸實(shí)現(xiàn)的。具體來說，METTL3介導(dǎo)了miR-7212-5p水平的升高，miR-7212-5p通過靶向FGFR3抑制MC3T3-E1細(xì)胞的成骨細(xì)胞分化。此外，H.E.Son等[18]也首次證實(shí)了FTO通過誘導(dǎo)輕度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活成骨分化的潛在機(jī)制，在C3H10T1/2細(xì)胞中，p-AMPK上調(diào)FTO的表達(dá)，F(xiàn)TO誘導(dǎo)AMPK磷酸化，F(xiàn)TO與p-AMPK之間存在正反饋回路；在機(jī)制上，m6A去甲基化酶FTO調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激基因啟動(dòng)子的去甲基化，從而刺激內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進(jìn)而促進(jìn)成骨分化。

4 m6A在成軟骨分化中的作用

在原代軟骨細(xì)胞單層培養(yǎng)中，軟骨細(xì)胞發(fā)生脫分化，失去表型和形成軟骨的能力?；谖㈥嚵蟹治?，B. Ma等[19]發(fā)現(xiàn)體外擴(kuò)增的人類軟骨細(xì)胞檢測(cè)到總基因表達(dá)總體下降。DNA甲基化部分導(dǎo)致許多基因的表達(dá)下調(diào)。通過整合RNA-Seq和ERRBS數(shù)據(jù)集，軟骨細(xì)胞肥大分化還伴隨著體外DNA甲基化的變化。此外，在炎癥條件下，在IL -1b處理的ATDC5細(xì)胞中METTL3 mRNA和m6A甲基化水平呈劑量依賴的方式上調(diào)。有趣的是，只有MELLT3的表達(dá)量增加，而其他調(diào)控因子的表達(dá)量未受顯著影響。當(dāng)METTL3沉默時(shí)，ECM通過降低MMP-13和Coll X的表達(dá)，上調(diào)Aggrecan和Coll II的表達(dá)來加速降解。這表明METLL3在介導(dǎo)炎性因子分泌、軟骨細(xì)胞膠原合成和降解方面具有重要意義，并且有可能是骨關(guān)節(jié)炎的治療靶點(diǎn)[20]。

5 m6A在成脂分化中的作用

就像“骨質(zhì)流失就是脂肪增加”的觀點(diǎn)一樣，成骨的反義詞是脂肪形成[21]。FTO是一種與人類肥胖有關(guān)的基因，它通過控制m6A水平和mRNA剪接來調(diào)控脂肪生成。X.Zhao等[22]證明m6A位點(diǎn)與SRSF1-和2-結(jié)合簇存在空間重疊，因此m6A修飾可以被視為一種新的外顯子RNA剪接順式調(diào)控信號(hào)。FTO通過調(diào)控m6A水平，從而控制SRSF2在剪接位點(diǎn)的結(jié)合，調(diào)節(jié)前脂肪細(xì)胞分化的RUNX1T1的選擇性剪接。miRNA在調(diào)控BMSCs分化為特定譜系方面有很大的作用。MiR-149-3p通過直接靶向FTO調(diào)控BMSCs分化為脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞的交替譜系，其在BMSCs中表達(dá)在成脂肪分化過程中降低，而在成骨分化過程中增加[23]。FTO可以通過調(diào)控下游信號(hào)通路m6A水平促進(jìn)成脂分化。METTL3-YTHDF2介導(dǎo)的m6A甲基化通過靶向JAK1/STAT5/C/EBPβ通路抑制豬BMSCs脂肪形成過程[24]。FTO也能通過GDF11-FTO-PPAR軸調(diào)控BMSCs的命運(yùn)，抑制成骨過程，促進(jìn)BMSCs譜系向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)移[25]。

6 m6A在破骨細(xì)胞分化中的作用

破骨細(xì)胞是來源于造血前體細(xì)胞的大型多核細(xì)胞[26]。破骨細(xì)胞作為唯一的骨吸收細(xì)胞，在維持骨穩(wěn)態(tài)和保持骨骼完整方面起著至關(guān)重要的作用。Lorenzo de la Rica等通過轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合基序分析發(fā)現(xiàn)，在破骨細(xì)胞分化和融合過程中，關(guān)鍵功能通路和基因發(fā)生低甲基化和高甲基化[27]。破骨細(xì)胞誘導(dǎo)后m6A和METTL3的總表達(dá)增加，但FTO和ALKBH5的表達(dá)不增加。當(dāng)Mettl3被敲除時(shí)，破骨細(xì)胞的大小增加，但骨吸收能力降低。從機(jī)制上講，Mettl3抑制破骨細(xì)胞基因(Nfatc1、cFos、Ctsk、Acp5和Dcstamp)的表達(dá)，并失活RANKL誘導(dǎo)的MAPK、NF-κB和PI3K-AKT信號(hào)通路的磷酸化水平。相反，Atp6v0d2的表達(dá)增加，這是一個(gè)促進(jìn)細(xì)胞-細(xì)胞融合和多核過程的融合相關(guān)基因，由于Mettl3和YTHDF2的缺失提高了Atp6v0d2 mRNA的穩(wěn)定性[28]。這些發(fā)現(xiàn)闡明了RNA表觀遺傳調(diào)控破骨細(xì)胞發(fā)育的分子基礎(chǔ)。

7 小結(jié)和展望

基因表達(dá)在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯和翻譯后等不同層面受到密切控制。在BMSCs的一些轉(zhuǎn)錄本上發(fā)現(xiàn)了m6A甲基化，特別是那些編碼發(fā)育調(diào)節(jié)因子的轉(zhuǎn)錄本，這些調(diào)節(jié)因子調(diào)控BMSCs分化為特定的譜系。m6A修飾與調(diào)控成脂分化的下游信號(hào)通路如PTH/PTH1r通路、PI3K/AKT通路、wnt/β-catenin通路等存在交叉，拓寬了干細(xì)胞分化的多層調(diào)控。另一方面，m6A調(diào)控因子(“編寫器”、“擦除者”和“讀取者”)也被ncRNA調(diào)控，例如miRNA 320、miRNA 149-3p和miRNA7212-5p，這些上游miRNA可能也是后續(xù)研究中有趣的候選miRNA。這種表觀遺傳機(jī)制可以決定BMSCs的命運(yùn)，并為干細(xì)胞生物學(xué)中轉(zhuǎn)錄后水平基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了新的視角。然而BMSCs的臨床應(yīng)用效率有限，因?yàn)橛锌赡芊只刹恍枰慕M織。因此，要成功利用BMSCs通過m6A調(diào)控產(chǎn)生中胚層譜系來治療骨病，了解其分化為特定終末譜系的分子機(jī)制至關(guān)重要，這將是未來的研究重點(diǎn)。