吳小鳳，程大釗，詹日明，陳 黎，王天雨，余 華，張桂洪，唐旭東* （1.廣東醫(yī)科大學(xué)抗腫瘤活性物質(zhì)研發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心，廣東湛江 524023；2.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心，廣東湛江 524001；3.廣東醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所，廣東湛江 524023）

肺癌是最常見(jiàn)的癌癥[1]，死亡率居惡性腫瘤之首[2-3]。肺癌分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌（NSCLC），其中NSCLC 約占85%，侵襲、轉(zhuǎn)移是NSCLC 致死的重要因素之一。FZD10 是Frizzle（FZD）家族中的一員，為類(lèi)G 蛋白偶聯(lián)受體。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道FZD10 在骨肉瘤[4]、胃癌[5]、滑膜肉瘤[6]等癌組織中高表達(dá)，而且還發(fā)現(xiàn)FZD10 與神經(jīng)細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞的增殖[7-8]及腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)[8-9]。Gugger 等[10]也證實(shí)FZD10 在肺鱗癌中高表達(dá)，但FZD10 在NSCLC 細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用仍不清楚。因此，本文擬對(duì)此進(jìn)行分析，以期進(jìn)一步了解NSCLC 侵襲、轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，為尋找NSCLC 防治的潛在靶點(diǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株

正常人支氣管上皮細(xì)胞（BEAS-2B）購(gòu)自賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司（iCell Bioscience Inc）；NSCLC 細(xì)胞株A549 和H1299 來(lái)自美國(guó)菌種保藏中心（ATCC）；NSCLC 細(xì)胞株95C、95D、H460購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，H1703 和PC-9 由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

兔抗人FZD10 抗體和兔抗人MMP-2 抗體為英國(guó)Abcam 公司產(chǎn)品；兔抗人MMP-9 抗體為北京Bioss 產(chǎn)品；結(jié)晶紫、CCK8 試劑盒、RIPA 裂解液、BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自碧云天生物科技公司；Matrigel 基質(zhì)膠為美國(guó)BD 公司產(chǎn)品；RT-qPCR 相關(guān)試劑PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）和SYBR? Premix Ex TaqTM II（Tli RNaseH Plus）均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司（大連TaKaRa 公司）；FZD10-siRNA 及轉(zhuǎn)染試劑DharmaFECTTM Transfection Reagents-SiRNA 均購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) NSCLC 細(xì)胞（H1299、A549、H460、H1703、PC-9、95C、95D）和BEAS-2B 細(xì)胞置于含10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 mg/L 鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)液中，37 ℃、5% CO2條件下傳代培養(yǎng)。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 參照美國(guó)Thermo 公司轉(zhuǎn)染試劑DharmaFECTTM Transfection Reagents-SiRNA 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，在95D 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染FZD10-siRNA，并將細(xì)胞分成3 組：（1）模擬轉(zhuǎn)染組（Mock）：僅加轉(zhuǎn)染試劑；（2）非特異siRNA 轉(zhuǎn)染組(Si-CTR)：轉(zhuǎn)染非特異siRNA；（3）FZD10-siRNA 轉(zhuǎn)染組（Si-FZD10）：轉(zhuǎn)染特異性FZD10-siRNA。在所有轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中FZD10-siRNA 的終濃度均為25 nmol/L，在96 孔板中加入FZD10-siRNA 2.5 pmol，在6 孔板中加入FZD10-siRNA 50 pmol。

1.3.3 CCK8 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將100 μL 95D 細(xì)胞懸液接種于96 孔板（細(xì)胞數(shù)為2 500 個(gè)/孔）培養(yǎng)12 h 后轉(zhuǎn)染，分別在24、48、72 h 時(shí)更換培養(yǎng)基為含有CCK8試劑的完全培養(yǎng)基100 μL，培養(yǎng)1～2 h，在波長(zhǎng)為450 nm 條件下檢測(cè)吸光度值。

1.3.4 遷移、侵襲實(shí)驗(yàn) 將95D 細(xì)胞接種到6 孔板中，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染FZD10-siRNA 24 h 后，將已轉(zhuǎn)染細(xì)胞用胰酶消化、離心、去上清，再用含10% FBS 的基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀并制成細(xì)胞懸液；在Transwell 板的下室緩慢加入700 μL 完全培養(yǎng)基（避免出現(xiàn)氣泡），上室（侵襲實(shí)驗(yàn)應(yīng)提前包被Matrigel 基質(zhì)膠）加入細(xì)胞懸液（細(xì)胞數(shù)為30 000 個(gè)/孔），每孔細(xì)胞懸液體積不超過(guò)200 μL。培養(yǎng)24 h 后，用棉簽擦拭上室，于4%多聚甲醛中固定25～30 min，再用結(jié)晶紫在室溫下染色10 min，清洗、晾干后在倒置顯微鏡下觀察并拍照。結(jié)果使用Image J 軟件進(jìn)行分析。

1.3.5 Western blot 使用強(qiáng)RIPA 裂解液分別裂解3 組轉(zhuǎn)染細(xì)胞，提取總蛋白，使用BCA 法檢測(cè)蛋白原液濃度，再進(jìn)行SDS-PAGE 電泳（100 V 電泳約2 h），轉(zhuǎn)膜、電轉(zhuǎn)（100 V 電轉(zhuǎn)1.5 h）、封閉；分別加兔抗人FZD10、MMP-2、MMP-9 抗體（1∶1 000）4 ℃孵育過(guò)夜后，用PBST 緩沖液洗滌3 次；用HRP 標(biāo)記的第二抗體（1∶2 000）常溫孵育1～2 h，再用PBST 緩沖液洗滌3 次；用ECL 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)信號(hào)，Image J 軟件進(jìn)行灰度值分析，將GAPDH 用作內(nèi)參對(duì)照。

1.3.6 RT-qPCR 使用Trizol 分別裂解3 組轉(zhuǎn)染細(xì)胞，提取總RNA，選擇A260/ A280為1.8～2.0 的樣品，RTqPCR 操作參照文獻(xiàn)[11-12]。FZD10 的擴(kuò)增引物序列為F:5′-AGCAGGTCTCTACCCCCATC-3′和R: 5′-TAATC GGGGAGCACTTGAGC-3′（GenBank No.NM_007197.4），GAPDH 的擴(kuò)增引物序列為F: 5′-ATGAATGGGCAGC CGTTAGG-3′和R: 5′-CCCAATACGACCAAATCAGA-GAT-3′（GenBank No.NM_001256799.2），所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。擴(kuò)增條件為42 °C 5 min，95 °C 10 s，再 40 個(gè)循環(huán)（95 °C 5 s,60 °C 31 s）。結(jié)果以2-△△Ct對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行相對(duì)定量分析，GAPDH 為內(nèi)參對(duì)照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 6.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用單因素方差分析及LSD 檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FZD10 在NSCLC 細(xì)胞中的表達(dá)

Western blot 結(jié)果（圖1）顯示：與BEAS-2B 細(xì)胞相比，除A549 和H460 細(xì)胞外，在其他NSCLC 細(xì)胞H1299、95D、95C、H1703、PC-9 中的FZD10 蛋白水平明顯升高，特別是在95D 細(xì)胞中表達(dá)最高，因此我們選擇該細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 NSCLC 細(xì)胞和正常肺上皮細(xì)胞的FZD10 表達(dá)

2.2 FZD10 敲低對(duì)95D 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

從圖2 可見(jiàn)，在95D NSCLC 細(xì)胞中敲低FZD10，與Mock 組和Si-CTR 組比較，Si-FZD10 組細(xì)胞的FZD10 蛋白和mRNA 的表達(dá)都明顯受抑（P＜0.05 或0.01），說(shuō)明FZD10 在95D 細(xì)胞中被成功敲低。CCK8檢測(cè)結(jié)果（圖3）顯示：Si-FZD10 組細(xì)胞的增殖被抑制，且在轉(zhuǎn)染72 h 時(shí)抑制顯著（P＜0.05）；Transwell 小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖4、5）顯示：Si-FZD10 組細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯降低（P＜0.01），而Mock 組和Si-CTR組細(xì)胞的遷移、侵襲能力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說(shuō)明FZD10 的敲低可抑制95D 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

圖2 FZD10 的敲低效果分析

圖3 敲低FZD10 對(duì)95D 細(xì)胞增殖能力的影響（n=3，*P＜0.05）

圖4 敲低FZD10 對(duì)95D 細(xì)胞遷移能力的影響

圖5 敲低FZD10 對(duì)95D 細(xì)胞侵襲能力的影響

2.3 FZD10 敲低對(duì)95D 細(xì)胞MMP-2 和MMP-9 蛋白表達(dá)的影響

圖6 可見(jiàn)，與Mock 組、Si-CTR 組比較，Si-FZD10組細(xì)胞的MMP-2 和MMP-9 蛋白表達(dá)均明顯降低（P＜0.05）。

圖6 敲低FZD10 對(duì)95D 細(xì)胞MMP-2 和MMP-9 蛋白表達(dá)的影響

3 討論

NSCLC 是臨床上常見(jiàn)的惡性腫瘤，盡管近年來(lái)由于靶向藥物和免疫治療的臨床應(yīng)用使NSCLC 的療效顯著提高[13-14]，但NSCLC 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及的信號(hào)分子繁多，治療后的NSCLC 還是面臨較大的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，而目前有關(guān)肺癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制還不完全清楚。

FZD10 是Frizzle 家族中的一種蛋白受體。研究發(fā)現(xiàn)其在肺鱗癌等多種腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)[4-6，10]。但最近Zhang 等[15]卻報(bào)道在45 歲以下的NSCLC 患者組織中FZD10 mRNA 的表達(dá)下調(diào)，這與Gugger 等[10]所報(bào)道的FZD10 在肺鱗癌中過(guò)度表達(dá)不一致。這些報(bào)道結(jié)果的差異說(shuō)明FZD10 在NSCLC 中的表達(dá)還存在爭(zhēng)議。為進(jìn)一步證實(shí)FZD10 在NSCLC 中的表達(dá)情況，本文采用Western blot 技術(shù)分析了NSCLC 細(xì)胞株中FZD10 蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FZD10 蛋白在NSCLC 細(xì)胞株H1299、95C、95D、H1703、PC-9 中都呈現(xiàn)高表達(dá)（圖1）。

有研究顯示，F(xiàn)ZD10 的表達(dá)與Survivin 的表達(dá)相關(guān)，且兩者的高表達(dá)可作為骨肉瘤診斷、惡性程度判斷的重要指標(biāo)[4]；而且，通過(guò)綜合分析TCGA 與GEO甲基化數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)FZD10 可能為膽管癌預(yù)后的相關(guān)基因[16]；特別是FZD10 的表達(dá)還被報(bào)道可影響胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力[5]，并且可能成為滑膜肉瘤[6]、結(jié)腸癌[17]治療的靶點(diǎn)。這些報(bào)道說(shuō)明，F(xiàn)ZD10 在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。本文發(fā)現(xiàn)FZD10 蛋白在具有高轉(zhuǎn)移潛能的NSCLC 細(xì)胞95D 中表達(dá)最高（圖1），初步說(shuō)明FZD10 表達(dá)可能與NSCLC 轉(zhuǎn)移有關(guān)。

為進(jìn)一步探討FZD10 在NSCLC 轉(zhuǎn)移中的作用，本文通過(guò)RNA 干擾技術(shù)敲低95D 細(xì)胞中FZD10 的表達(dá)，分析FZD10 對(duì)NSCLC 細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用特異性FZD10-siRNA 敲低FZD10 后，可以明顯抑制95D 細(xì)胞的增殖（P＜0.05，圖3）、遷移（P＜0.01，圖4）和侵襲能力（P＜0.01，圖5），提示FZD10可能在NSCLC 轉(zhuǎn)移中起重要作用。

基質(zhì)金屬蛋白酶屬鋅依賴(lài)性?xún)?nèi)肽酶家族，其中MMP-2、MMP-9 與基底膜降解、血管生成相關(guān)，參與調(diào)控腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程[18]。為研究FZD10 增強(qiáng)NSCLC 細(xì)胞95D 增殖、遷移、侵襲能力的機(jī)制，本文進(jìn)一步分析了FZD10 對(duì)NSCLC 細(xì)胞MMP-2 和MMP-9 表達(dá)的影響，結(jié)果表明敲低FZD10 后95D細(xì)胞中MMP-2 和MMP-9 蛋白的表達(dá)均顯著降低（P＜0.05，圖6）。本文結(jié)果初步說(shuō)明，F(xiàn)ZD10 可能通過(guò)上調(diào)MMP-2 和MMP-9 的表達(dá)增強(qiáng)NSCLC 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，從而促進(jìn)NSCLC 轉(zhuǎn)移，提示FZD10 可能是NSCLC 防治的潛在靶點(diǎn)。