孫利君，陳日紅，孫開裕，黃先進(jìn)，全禎豪，黃超輝，許慶文，林 琳（廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院胃腸外科，廣東湛江 524000）

據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）收集的數(shù)據(jù)提示，2020 年全世界新增胃癌病例約108.9 萬例，2020 年全世界胃癌死亡人數(shù)約為76.9 萬，且多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已為晚期，出現(xiàn)了腹膜轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移或盆腔轉(zhuǎn)移等，從而錯(cuò)過了手術(shù)治療的最佳時(shí)機(jī)。目前認(rèn)為外周血微轉(zhuǎn)移灶與腫瘤發(fā)生血行轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素[1]，且臨床上依賴傳統(tǒng)的血清學(xué)腫瘤指標(biāo)、影像學(xué)檢查等存在特異性不足、滯后性等缺點(diǎn)[2-3]，難以早期檢測(cè)微轉(zhuǎn)移灶。隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，人們逐漸發(fā)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）是惡性腫瘤患者復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的重要影響因素。有文獻(xiàn)報(bào)道，CTCs 可作為胃癌早期檢測(cè)的生物標(biāo)志物，并可提供關(guān)于胃癌患者治療反應(yīng)和預(yù)后的有用信息[4-6]。血清腫瘤標(biāo)志物是與腫瘤相關(guān)的抗原，而非腫瘤的特異性抗原，在一定程度上也能夠反映腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，血清腫瘤標(biāo)志物可以在腫瘤組織、血液和排泄物中檢測(cè)到。迄今，還沒發(fā)現(xiàn)一種標(biāo)志物對(duì)胃癌腹膜轉(zhuǎn)移早期診斷有較高的陽(yáng)性率和特異性，且多數(shù)腫瘤標(biāo)志物在胃癌復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移早期敏感度低，說明對(duì)于腫瘤腹膜轉(zhuǎn)移的早期診斷具有一定的困難。尋找一種更為簡(jiǎn)單、快捷、無創(chuàng)的方法來診斷胃癌腹膜轉(zhuǎn)移迫在眉睫，從而為胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的早期診斷、治療方案選擇等提供更為可靠的依據(jù)，本文對(duì)此進(jìn)行了探究。

1 資料和方法

1.1 病例資料

選取2019-2021 年廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院胃腸外科收治的無腹膜轉(zhuǎn)移胃癌患者147 例（無腹膜轉(zhuǎn)移胃癌組）及有腹膜轉(zhuǎn)移的胃癌患者40 例（腹膜轉(zhuǎn)移胃癌組）。無腹膜轉(zhuǎn)移胃癌組中男96 例，女51 例，平均年齡63.2 歲；腹膜轉(zhuǎn)移胃癌組中男22 例，女18 例，平均年齡62.7 歲。

1.2 方法

檢測(cè)患者CTCs 及CEA、CA125、CA199 的表達(dá)水平，分析胃癌腹膜轉(zhuǎn)移與臨床病理特征的相關(guān)性，分析CTCs、CEA、CA125、CA199 單檢及聯(lián)合檢測(cè)在胃癌腹膜轉(zhuǎn)移中的診斷效能。

1.2.1 CTCs 的檢測(cè) 采用多重mRNA 原位分析（MRIA）的方法，對(duì)CTCs 進(jìn)行分型和鑒定。在患者術(shù)前空腹?fàn)顟B(tài)下抽取其外周血10 mL，首先裂解外周血中的紅細(xì)胞，再根據(jù)CTCs 與白細(xì)胞的大小差異通過納米技術(shù)進(jìn)行CTCs 的分離和富集，再對(duì)富集的CTCs進(jìn)行特異性基因核酸定位。根據(jù)CanPatrol? CTCs 檢測(cè)技術(shù)說明書判讀標(biāo)準(zhǔn)以及參閱文獻(xiàn)，本研究將胃癌患者的外周血中檢測(cè)的CTCs 數(shù)大于或等于2 個(gè)定義為CTCs 陽(yáng)性。

1.2.2 血清腫瘤標(biāo)志物（CEA、CA125、CA199）的檢測(cè) 患者血清腫瘤標(biāo)志物 CEA、CA125、CA199 的標(biāo)本均在術(shù)前空腹?fàn)顟B(tài)下抽取外周血，并送廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科進(jìn)行定量標(biāo)記分析。所采集的血樣標(biāo)本離心后加入相應(yīng)的腫瘤標(biāo)記盒中進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)及腫瘤試劑盒說明，本研究將血清 CEA、CA125、CA199 的臨界值分別定為 5 μg/L、35 U/mL、27 U/mL，超過其臨界值的定義為陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用 SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，對(duì)各組計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，以描述正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，中位數(shù)及四分位間距描述非正態(tài)分布數(shù)據(jù)。分類資采用卡方檢驗(yàn)。采用獨(dú)立樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)（Mann-Whitney U 檢驗(yàn)）進(jìn)行組間CTCs、CEA、CA125 及CAl99 測(cè)量值的比較。CTCs、CEA、CAl25 及CAl99對(duì)胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的診斷效能比較采用MedCalc 軟件進(jìn)行受試者工作特征曲線（ROC 曲線）分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者臨床及病理學(xué)特征的比較

與無腹膜轉(zhuǎn)移胃癌組相比，有腹膜轉(zhuǎn)移胃癌組患者原發(fā)病灶的腫瘤更大、分化程度更低、神經(jīng)及脈管侵犯更多，CTCs、CEA、CA125、CA199 陽(yáng)性率更高（P＜0.01）；而兩組的性別、年齡的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 兩組臨床及病理學(xué)特征的比較 （例）

續(xù)表1

2.2 CTCs、CEA、CA125、CA199 表達(dá)水平

腹膜轉(zhuǎn)移胃癌組的CEA、CA125、CA199、CTCs、上皮型CTCs（eCTCs）、間質(zhì)型CTCs（bCTCs）、混合型CTCs（mCTCs）的水平均高于無腹膜轉(zhuǎn)移胃癌組（P＜0.01 或0.05）。見表2。

表2 CTCs、CEA、CA125 及CA199 表達(dá)水平在兩組中的差異 [中位數(shù)（P25，P75）]

2.3 CTCs、CEA、CA125、CA199 對(duì)胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的診斷效能分析

根據(jù)ROC 曲線，血清CA125 參考值為18.39 U/L時(shí)，診斷胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的敏感度為62.50%，特異度為88.44%，AUC 值為0.74，95%置信區(qū)間為[0.672，0.802]，約登指數(shù)為0.509（P＜0.05）。當(dāng)血清CTCs 參考值為10 個(gè)/10 mL 時(shí)，診斷胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的敏感度為90.00%，特異度為53.06%，AUC 值為0.72，95%置信區(qū)間為[0.649 0.783]，約登指數(shù)為5.234（P＜0.05）。CTCs、CA125 對(duì)于胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的診斷效能高于CEA、CA199。見表3，圖1。

圖1 CTCs、CEA、CA125、CA199 診斷胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的ROC 曲線

表3 CTCs、CEA、CA125、CA199 診斷效能的比較

2.4 CTCs、血清CEA、CA125、CA199 聯(lián)合對(duì)胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的診斷效能分析

根據(jù)ROC 曲線可知，CTCs+CEA+CA125+CA199聯(lián)合診斷胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的 ROC 曲線下面積0.80，敏感性為 65.00%，特異性為87.80%，CTCs+CEA+CA125+CA19 聯(lián)合起來對(duì)于胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的診斷準(zhǔn)確性較單一診斷時(shí)的準(zhǔn)確性高。見表4、5，圖2。

表4 CTCs、CEA、CA125、CA199 診斷效能的兩兩比較

圖2 CTCs、CEA、CA125、CA199 聯(lián)合診斷胃癌腹膜轉(zhuǎn)移ROC 曲線

表5 CTCs、CEA、CA125、CA199 聯(lián)合對(duì)胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的診斷效能

3 討論

腹膜轉(zhuǎn)移已成為影響胃癌患者預(yù)后的重要因素之一。目前腫瘤腹膜轉(zhuǎn)移常用的診斷手段包括CT、MRI、超聲多普勒以及PET-CT、腹腔灌洗液細(xì)胞學(xué)、診斷性腹腔鏡探查[7-8]，但這些均具一定的局限性。腹膜轉(zhuǎn)移的發(fā)病機(jī)制也十分復(fù)雜，可能與腫瘤細(xì)胞的粘附、移動(dòng)、降解、血管生成、免疫逃逸等因素有關(guān)。目前公認(rèn)的發(fā)病機(jī)制是“種子-土壤學(xué)說”[9]。目前已發(fā)現(xiàn)大約80% 的轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞來源于早期播散的癌細(xì)胞[10]。CTCs 的概念是由Ashworth 在1896 年首次提出的[11]，它是指在血液循環(huán)中的具有轉(zhuǎn)移潛能及高活力的腫瘤細(xì)胞，不僅可形成微轉(zhuǎn)移，而且在一定條件下還可發(fā)展為轉(zhuǎn)移癌[12]。Pantel 等[13]的研究表明，在胃癌患者中，外周血中CTCs 的檢測(cè)可能在監(jiān)測(cè)腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移方面有臨床價(jià)值。一項(xiàng)關(guān)于胃癌患者中CTCs 預(yù)后意義的meta 分析結(jié)果顯示CTCs 的檢測(cè)與胃癌患者的不良預(yù)后相關(guān)，晚期胃癌中CTCs 的數(shù)量高于早期胃癌，低分化胃癌高于高/中分化胃癌，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌；它還與患者的無病生存率和總生存率顯著相關(guān)[14]。也有研究發(fā)現(xiàn)CTCs 在胃癌腹膜轉(zhuǎn)移患者中更常見（9/25，36%），而在肝轉(zhuǎn)移患者中較少（1/5，20%）[15]。正常情況下血清中CEA 含量極低，而在食管癌、胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌患者中CEA 水平呈升高趨勢(shì)。CAl99 是一種存在于血清中的黏蛋白，有研究發(fā)現(xiàn)在胃癌患者中，血清CEA和CA199 水平可被廣泛用于預(yù)測(cè)預(yù)后和復(fù)發(fā)[16-17]。但在Kim 等[18]的研究中，血清CEA 和CA199 診斷腹膜轉(zhuǎn)移的特異性與敏感性卻不高，本研究結(jié)果基本與其相符。本研究中CEA 診斷胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的敏感性和特異性分別為55.00% 和74.15%，CA199 診斷胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的敏感性和特異性分別為52.50% 和80.27%。CA125 是一種存在于細(xì)胞表面的糖蛋白，能夠參與并促進(jìn)卵巢腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。因CA125 無組織特異性，其升高也見于胃腸道腫瘤、肺部腫瘤等[19]。有研究表明，腫瘤細(xì)胞表面膜上的CA125 通過與間皮細(xì)胞表面分子間硫蛋白的結(jié)合啟動(dòng)細(xì)胞與間皮細(xì)胞的附著，從而促進(jìn)腹膜轉(zhuǎn)移的形成[20-21]。也有研究提示血清CA125 表達(dá)水平對(duì)于胃癌腹膜轉(zhuǎn)移有一定的診斷價(jià)值[22-23]。可見，血清CA125 表達(dá)水平升高可能不僅僅是疾病進(jìn)展的結(jié)果，可能與腹膜轉(zhuǎn)移的進(jìn)展也有因果關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，腹膜轉(zhuǎn)移胃癌組CEA、CA125、CA199、CTCs 及其分型的平均水平均高于無腹膜轉(zhuǎn)移胃癌組，這與以往研究報(bào)道的結(jié)果一致，即CTCs、血清腫瘤標(biāo)志物在腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中有其臨床價(jià)值。有研究結(jié)果提示，CTCs 對(duì)胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的診斷有一定的診斷意義[24]。在先前有關(guān)胃癌CTCs 的研究中，Hiraiwa 等[25]使用了2 個(gè)CTCs 作為臨界值，本研究也參考他們的做法，使用2 個(gè)CTCs 作為臨界值。而對(duì)于胃癌腹膜轉(zhuǎn)移，本研究通過ROC 曲線分析將臨界值確定為10 個(gè)CTCs，此時(shí)CTCs 對(duì)胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的靈敏性為90.00%，特異性為53.06%，AUC 為0.72，這與以往的研究結(jié)果基本一致。

近年來，大量的研究發(fā)現(xiàn)腫瘤標(biāo)志物在判定腫瘤的療效、預(yù)后等方面有一定的臨床價(jià)值，還發(fā)現(xiàn)腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)可以提高其診斷的準(zhǔn)確性。在胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的早期診斷中，單一的傳統(tǒng)血清腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)是片面的，采用聯(lián)合檢測(cè)的方法很有必要。本研究中，我們對(duì)CTCs、CEA、CA125、CA199 單一診斷及CTCs+CEA+CA125+CA199 聯(lián)合診斷胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的AUC 分別為 0.72、0.63、0.74、0.68、0.80。診斷的準(zhǔn)確性排序?yàn)镃TCs+CEA+CA125+CA199＞CA125＞CT Cs＞CA199＞CEA，CTCs+CEA+CA125+CA199 聯(lián)合診斷的準(zhǔn)確性高于CTCs、CEA、CA125、CA199 單一檢測(cè)。

綜上所述，CTCs、血清腫瘤標(biāo)志物（CEA、CA125、CA199）聯(lián)合檢測(cè)可提高診斷胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的準(zhǔn)確性，對(duì)胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的早期診斷、病情進(jìn)展等均有較為重要的臨床價(jià)值，可成為較可靠的腫瘤評(píng)價(jià)指標(biāo)，二者結(jié)合可提高臨床診斷的準(zhǔn)確率。

但需注意的是，本研究也存在以下局限性：（1）CTCs 并不是胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的特異性生物標(biāo)志物，它可以在各種腫瘤中檢測(cè)到，如結(jié)直腸癌、乳腺癌、食管癌，因此CTCs 用于胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的診斷仍存在一定局限性，更適合作為胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的輔助診斷；（2）本研究并未納入腹膜轉(zhuǎn)移之外其他遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的胃癌患者，對(duì)此無法進(jìn)行直接分析，且納入的患者均來自同一機(jī)構(gòu)，樣本量較??；（3）對(duì)于CTCs 臨界值的確定，盡管筆者查閱了大量文獻(xiàn)，但迄今的相關(guān)研究并未確定得到公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)，這可能使本研究出現(xiàn)偏倚，需要后續(xù)更為深入的研究，例如進(jìn)行多中心及更大樣本的研究，從而進(jìn)一步確定CTCs 的臨界值，以使CTCs 及血清腫瘤標(biāo)志物在胃癌腹膜轉(zhuǎn)移患者中的臨床意義更為明確。