方炳雄，陳曉佳，劉 琪，趙 煒，阮 杰* （.普寧市人民醫(yī)院精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中心，廣東普寧 55300；.廣東醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東東莞 53808）

新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）是β 屬單股正鏈RNA病毒，為有包膜的RNA 病毒［1］。該病毒的全基因組序列是由冠狀病毒開放閱讀框（ORF）、核殼蛋白N 基因和包膜蛋白E 基因等組成[2-3]。國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第八版修訂版）》指出：新型冠狀病毒的病原體檢測(cè)方法主要是實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（熒光PCR 法）[4]。根據(jù)中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)（CNAS）《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則及其在分子診斷領(lǐng)域的應(yīng)用說明（CNAS-CL02-A009）》文件要求，臨床實(shí)驗(yàn)室開展分子診斷檢驗(yàn)項(xiàng)必須進(jìn)行檢測(cè)系統(tǒng)的性能驗(yàn)證，分子診斷領(lǐng)域中定性檢測(cè)項(xiàng)目驗(yàn)證內(nèi)容至少應(yīng)包括檢測(cè)下限、特異性、抗干擾能力、準(zhǔn)確度等［5-6］。本研究參照中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)（CNAS）制定的CNASGL039《分子診斷檢驗(yàn)程序性能驗(yàn)證指南》[7]，利用新型冠狀病毒核酸性能驗(yàn)證參考品和廣東省新型冠狀病毒檢測(cè)室間質(zhì)控品對(duì)兩種國(guó)產(chǎn)的新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑盒的靈敏度、精密度、準(zhǔn)確度、特異性及抗干擾能力進(jìn)行性能驗(yàn)證，以期為同行在開展新項(xiàng)目制定性能驗(yàn)證方案時(shí)提供參考。

1 資料和方法

1.1 標(biāo)本來源

性能驗(yàn)證參考品來自廣州邦德盛生物科技有限公司的新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）核酸性能驗(yàn)證參考品（規(guī)格型號(hào)：BDS-CKP-034，批號(hào)：2021001），其中包含陽性參考品、檢測(cè)限參考品、分析特異性參考品、精密度參考品和干擾物參考品。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度為2.0E+05 copies/μL，編號(hào)為GBW（E）091132。廣東省新型冠狀病毒檢測(cè)室間質(zhì)控品來自廣東省臨床檢驗(yàn)中心，用于全省核酸檢測(cè)質(zhì)量控制評(píng)價(jià)標(biāo)本。編碼為20200301、20200302、20200303、20200304、20200305和20210201、20210202、20210203、20210204、20210205。

1.2 試劑與儀器

檢測(cè)試劑來自國(guó)產(chǎn)的新型冠狀病毒2019-nCOV的核酸檢測(cè)試劑盒（熒光PCR 法），一種是國(guó)械注準(zhǔn)20203400063，生產(chǎn)批號(hào)2020095，檢測(cè)時(shí)間為110 min，下文稱為試劑A；另一種是國(guó)械注準(zhǔn)20203400749，生產(chǎn)批號(hào)：2021094，檢測(cè)時(shí)間為70 min，下文稱為試劑B。使用全自動(dòng)核酸提取儀（杭州奧盛儀器有限公司Auto-Pure 32A）與核酸提取或純化試劑盒（廣州賽百純生物科技有限公司，批號(hào)：SUP011602-21-0114）配套進(jìn)行核酸提取。采用ABI Q5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國(guó)Applied Biosystems quantstudio 5）進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。

1.3 檢測(cè)方法及結(jié)果判讀

按照核酸提取試劑說明書提取參考品的核酸，按照檢測(cè)試劑盒說明書操作，試劑A 的擴(kuò)增反應(yīng)條件為：50 ℃ 15 min，95 ℃ 15 min，94 ℃ 15 s，55 ℃ 45 s，45個(gè)循環(huán)，在55 ℃采集熒光信號(hào)。若檢測(cè)樣本在FAM和VIC 通道Ct 值≤40，且有明顯的擴(kuò)增曲線，則判斷樣本2019 新型冠狀病毒陽性；若檢測(cè)樣本在FAM 和VIC 通道無擴(kuò)增曲線或Ct 值＞40，且Cy5 通道有擴(kuò)增曲線，則判斷樣本2019 新型冠狀病毒陰性；若檢測(cè)樣本僅在FAM 或VIC 單一通道Ct 值≤40，另一通道無擴(kuò)增曲線，結(jié)果需復(fù)檢，復(fù)檢結(jié)果一致則可判斷為陽性，復(fù)檢結(jié)果為陰性則判斷為陰性。

試劑B 的擴(kuò)增反應(yīng)條件為：50 ℃ 2 min，95 ℃2 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，10 個(gè)循環(huán)；95 ℃ 5 s，60℃ 35 s，32 個(gè)循環(huán)，在60 ℃采集熒光信號(hào)。若檢測(cè)樣本在FAM 和VIC 通道Ct 值≤30，且有明顯的擴(kuò)增曲線，則判斷樣本2019 新型冠狀病毒陽性；若檢測(cè)樣本在FAM 和VIC 通道無擴(kuò)增曲線或Ct 值＞30，且Cy5 通道有擴(kuò)增曲線，則判斷樣本2019 新型冠狀病毒陰性；若檢測(cè)樣本僅在FAM 或VIC 單一通道Ct 值≤30，另一通道無擴(kuò)增曲線，結(jié)果需復(fù)檢，復(fù)檢結(jié)果一致則判斷為陽性，復(fù)檢結(jié)果為陰性則判斷為陰性。

1.4 性能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

1.4.1 靈敏度實(shí)驗(yàn) 利用廣州邦德盛生物科技有限公司提供的5 個(gè)檢測(cè)限參考品（L1-L5）以及不含SARSCoV-2 RNA 的RNA 樣品稀釋液共同制備的陽性參考品進(jìn)行檢測(cè)，其濃度分別為2.0E+05、2.0E+04、2.0E+03、5.0E+02、2.5E+02 和1.25E+02 copies/mL。廠家聲稱的最低檢測(cè)限為500 copies/mL，前3 個(gè)濃度重復(fù)檢測(cè)10 次，后3 個(gè)濃度重復(fù)檢測(cè)20 次。要求應(yīng)符合廠家聲稱的最低檢測(cè)限，且陽性符合率應(yīng)≥95%。

1.4.2 精密度實(shí)驗(yàn) 利用廣州邦德盛生物科技有限公司提供的精密度參考品進(jìn)行檢測(cè)，其中包含R1（低值）SARS-CoV-2-RNA 2.0E+03 copies/mL 陽性標(biāo)本和R2（中值）SARS-CoV-2-RNA 2.0E+04 copies/mL陽性標(biāo)本。利用同一樣本重復(fù)檢測(cè)10 次，計(jì)算變異系數(shù)（CV）值，用于評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性，要求CV 值不超過5%。

1.4.3 準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn) 利用本實(shí)驗(yàn)室參加2020 年和2021 年兩次廣東省臨床檢驗(yàn)中心提供的新型冠狀病毒檢測(cè)室間質(zhì)評(píng)及廣州邦德盛生物科技有限公司提供的陽性參考品，共20 個(gè)樣本評(píng)價(jià)試劑盒的準(zhǔn)確性，按照臨床樣本檢測(cè)流程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果與樣本信息比較，計(jì)算出準(zhǔn)確度。

1.4.4 特異性實(shí)驗(yàn) 驗(yàn)證與新型冠狀病毒種屬相近或引起癥狀相似的其他病原體，如人冠狀病毒HCoVOC43、人冠狀病毒HCoV-HKU1、人冠狀病毒HCoV-229E、人冠狀病毒HCoV-NL63、新型冠狀病毒SARS、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、人副流感病毒、腺病毒、腸道病毒、肺炎支原體、EB 病毒、人巨細(xì)胞病毒、結(jié)核分枝桿菌以及2 個(gè)人類基因組DNA 標(biāo)本有無交叉反應(yīng)。本次特異性實(shí)驗(yàn)對(duì)每個(gè)標(biāo)本重復(fù)檢測(cè)2 次，檢測(cè)結(jié)果均為陰性，則特異性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)符合要求。

1.4.5 抗干擾實(shí)驗(yàn) 驗(yàn)證咽拭子或痰液標(biāo)本中可能存在的血紅蛋白、白蛋白、膽紅素、甘油三酯、總Ig G、總Ig M 和抗核抗體，以及樣本中可能存在的新型冠狀病毒治療藥物，如利巴韋林+阿奇霉素、奧司他韋、阿奇霉素、頭孢曲松、妥布霉素、鹽酸組胺和氯化鈉是否會(huì)干擾新型冠狀病毒核酸檢測(cè)。干擾物參考品是加入干擾物質(zhì)的弱陽性標(biāo)本，濃度為2.0E+03 copies/mL，干擾物參考品樣本信息如表1 所示。利用參考品進(jìn)行核酸提取，每個(gè)參考品重復(fù)檢測(cè)2 次，要求標(biāo)本中可能存在的內(nèi)源性物質(zhì)或治療藥物對(duì)檢測(cè)結(jié)果無干擾。

表1 干擾物參考品樣本信息

2 結(jié)果

2.1 靈敏度實(shí)驗(yàn)

在2.0E+05、2.0E+04、2.0E+03、5.0E+02、2.5E+02和1.25E+02 copies/mL 6 個(gè)濃度中，試劑A 的陽性率均為100%，檢出限為1.25E+02 copies/mL；試劑B 在前5 個(gè)濃度的陽性率為100%，在第6 個(gè)濃度陽性率為50%（10/20），檢出限為2.5E+02 copies/mL。如圖1、2 所示，試劑A 和試劑B 在500 copies/mL 中檢測(cè)陽性率均為100%，能夠達(dá)到廠家檢出限500 copies/mL 的要求，靈敏度驗(yàn)證合格。

圖1 試劑A 靈敏度擴(kuò)增曲線（左圖為2.5E+02 copies/mL，右圖為1.25E+02 copies/mL）

2.2 精密度實(shí)驗(yàn)

在2.0E+03 copies/mL（R1）水平，試劑AN基因的CV 值為0.37%，ORF1ab基因的CV 值為0.61%；試劑BN基因的CV 值為1.23%，ORF1ab基因的CV值為1.48%。在2.0E+04 copies/mL（R2）水平，試劑AN基因的CV 值為0.16%，ORF1ab基因的CV 值為0.22%；試劑BN基因的CV 值為0.87%，ORF1ab 基因的CV 值為0.54%。兩種試劑的CV 值均小于5%，符合試劑說明書的要求，精密度驗(yàn)證合格。

2.3 準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)

10 個(gè)室間質(zhì)評(píng)標(biāo)本和10 個(gè)陽性參考品的兩種檢測(cè)試劑檢測(cè)結(jié)果與已知結(jié)果一致，一致率為100%，符合試劑說明書的要求，準(zhǔn)確度驗(yàn)證合格。檢測(cè)結(jié)果如表2 所示。

表2 兩種試劑的準(zhǔn)確度驗(yàn)證結(jié)果

2.4 特異性實(shí)驗(yàn)

圖2 試劑B 靈敏度擴(kuò)增曲線（左圖為5.0E+02 copies/mL，右圖為2.5E+02 copies/mL）

檢測(cè)16 個(gè)含有與新型冠狀病毒種屬相近或引起癥狀相似的其他病原體及2 個(gè)含人類基因組DNA的參考品，每個(gè)參考品重復(fù)2 次檢測(cè)。原始熒光多組分曲線（Multicomponent Plot）如圖3 所示，擴(kuò)增曲線（Amplification Plot）如圖4 所示。參考品的N 基因和ORF1ab 基因均無擴(kuò)增曲線，圖中的擴(kuò)增曲線為內(nèi)標(biāo)基因Cy5，表明以上病原體間不存在交叉反應(yīng)，特異性好，符合試劑說明書要求，特異性驗(yàn)證合格。

圖3 特異性實(shí)驗(yàn)熒光多組分曲線圖（左為試劑A，右為試劑B）

圖4 特異性實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增曲線（左為試劑A，右為試劑B）

2.5 抗干擾實(shí)驗(yàn)

檢測(cè)14 種在咽拭子或痰液標(biāo)本中可能存在的內(nèi)源性干擾物或新型冠狀病毒治療藥物的干擾物參考物，重復(fù)測(cè)定2 次，兩種試劑的結(jié)果均為陽性，如圖5所示，抗干擾驗(yàn)證合格。

圖5 抗干擾實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增曲線（左為試劑A，右為試劑B）

3 討論

新型冠狀病毒核酸檢測(cè)作為新型冠狀病毒肺炎的確診手段，在臨床上為快速診斷和療效評(píng)估發(fā)揮重要作用[8]，在疫情防控中，是落實(shí)“四早”防控要求的重要手段，能發(fā)揮疫情防控中的“排雷”作用。分子診斷檢測(cè)項(xiàng)目在應(yīng)用于臨床之前，需要進(jìn)行嚴(yán)格的性能評(píng)估，確保檢測(cè)質(zhì)量[9]。

國(guó)內(nèi)外使用的新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑盒非常多，報(bào)道過利用不同的方法驗(yàn)證檢測(cè)試劑的性能評(píng)價(jià)[10]。使用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋，驗(yàn)證新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑，發(fā)現(xiàn)需要選擇配套的核酸提取試劑，才能得到較良好的性能驗(yàn)證結(jié)果[11]。使用少量臨床新型冠狀病毒陽性標(biāo)本及參考品對(duì)核酸檢測(cè)試劑進(jìn)行性能驗(yàn)證評(píng)價(jià)[12]。同時(shí)也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)部分核酸檢測(cè)試劑盒對(duì)弱陽性標(biāo)本的檢出能力欠佳的情況[13]。因此，在自身實(shí)驗(yàn)室條件下，較為全面地進(jìn)行性能驗(yàn)證評(píng)估，才能較好地保障檢測(cè)質(zhì)量的可靠性和準(zhǔn)確性。

本研究使用第三方的新型冠狀病毒核酸性能驗(yàn)證參考品，以及廣東省臨床檢驗(yàn)中心頒發(fā)的室間質(zhì)評(píng)標(biāo)本，對(duì)兩種國(guó)產(chǎn)的新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑盒性能驗(yàn)證。驗(yàn)證內(nèi)容包括靈敏度、精密度、準(zhǔn)確度、特異性和抗干擾能力5 個(gè)方面，確保對(duì)新冠病毒核酸檢測(cè)做好質(zhì)量控制。

靈敏度是指檢測(cè)試劑對(duì)待測(cè)標(biāo)本的檢測(cè)能力，若靈敏度過低，則可能導(dǎo)致假陰性出現(xiàn)[14-15]。靈敏度高的檢測(cè)試劑，能夠較好地檢測(cè)出病毒拷貝數(shù)較低的標(biāo)本。試劑A 的檢出限可達(dá)125 copies/mL，試劑B 的檢出限可達(dá)250 copies/mL，均優(yōu)于廠家聲稱的檢出限：500 copies/mL。使用檢出限較低的檢測(cè)試劑在檢測(cè)病毒低拷貝數(shù)的標(biāo)本更具優(yōu)勢(shì)，有利于避免假陰性的發(fā)生；提高新型冠狀病毒肺炎患者的早期檢出率，有利于快速確定傳染源。

精密度對(duì)同一標(biāo)本進(jìn)行多次重復(fù)測(cè)量所得到的結(jié)果的一致程度，通常以CV 表示。兩種檢測(cè)試劑在中值R2 水平和臨界值R1 水平，檢測(cè)結(jié)果的CV 值均小于5%，符合試劑說明書要求標(biāo)準(zhǔn)，試劑A 和試劑B 的精密度驗(yàn)證合格。精密度高的檢測(cè)，能較好地保障檢測(cè)的穩(wěn)定性。

檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度是指檢測(cè)結(jié)果與真值之間的一致性[16]。利用廣東省頒發(fā)的室間質(zhì)評(píng)品和第三方的陽性參考品來驗(yàn)證兩種檢測(cè)試劑的準(zhǔn)確度，室間質(zhì)評(píng)檢測(cè)結(jié)果與真實(shí)結(jié)果一致，陽性參考品的檢測(cè)結(jié)果也均為陽性，準(zhǔn)確度為100%。表明這兩種檢測(cè)試劑盒能夠滿足準(zhǔn)確度的要求。

本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)16 種分別含有與新型冠狀病毒種屬相近或引起癥狀相似的其他病原體及2 個(gè)含人類基因組的DNA。兩種試劑的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，沒有發(fā)生交叉反應(yīng)，表明兩種檢測(cè)試劑的特異性好，有利于避免假陽性的發(fā)生，提升臨床的辨別判斷能力。

使用抗干擾能力好的檢測(cè)試劑，可以避免臨床樣本可能存在的內(nèi)源性物質(zhì)或治療藥物對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，造成檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陰性的現(xiàn)象。兩種試劑在檢測(cè)中分別加入14 種常見干擾物質(zhì)的弱陽性標(biāo)本，也能得出準(zhǔn)確結(jié)果，說明兩種檢測(cè)試劑抗干擾能力好。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)針對(duì)靈敏度、精密度、準(zhǔn)確度、特異性和抗干擾性5 個(gè)方面驗(yàn)證兩種國(guó)產(chǎn)新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑盒的效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均符合要求，可用于臨床。