張 斌，杜沈霖，馬 璇，符 甜，柯芷茵，王雪純，劉勇軍*，梁愛玲* （.廣東醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，臨床生物化學(xué)教研室，廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東東莞 2808；2.青島市市立醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)部，山東青島 2660；.東莞市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東東莞 2800；.石家莊新樂市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北石家莊 00700；.湛江市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東湛江 200）

肺癌已經(jīng)成為全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因[1]，其中80%～85%為非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）[2]。目前，放療和化療仍是治療NSCLC 的主要手段。吉西他濱作為最重要的胞嘧啶核苷衍生抗腫瘤藥，一方面作用于DNA 合成期（synthesis，S）；另一方面阻斷細(xì)胞由G1期到S 期進(jìn)展，干擾DNA 的自我復(fù)制，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[3]。外泌體作為一類直徑30～150 nm 雙層膜包裹的囊泡[4]，可攜帶母本細(xì)胞遺傳物質(zhì)到受體細(xì)胞進(jìn)行信息傳遞，在腫瘤細(xì)胞發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移及耐藥方面發(fā)揮重要作用[5]。微小RNA（miRNAs）是一類具有調(diào)控功能的非編碼RNA，可調(diào)節(jié)mRNA 的表達(dá)，改變靶蛋白的表達(dá)水平[6]。腫瘤細(xì)胞的耐藥也與miRNAs 的表達(dá)異常有關(guān)[7]。miRNA 在腫瘤增殖、侵襲和耐藥方面有重要作用，是腫瘤治療的相關(guān)靶點(diǎn)[8]。有研究顯示，miRNA 一方面可以參與腫瘤細(xì)胞的耐藥過程，另一方面還可以干擾上下游信號通路逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥[9]。本課題組前期構(gòu)建了對吉西他濱耐藥的人類肺腺癌細(xì)胞株（A549/G+），分別提取了A549 敏感株（A549/G-）和耐藥株（A549/G+）的外泌體，進(jìn)行miRNAs 芯片檢測和表達(dá)差異分析，發(fā)現(xiàn)let-7i-5p 是兩株細(xì)胞中表達(dá)差異最大的miRNA；同時，生物信息學(xué)預(yù)測提示let-7i-5 發(fā)揮作用可能與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶6（CDK6）有關(guān)[10]。本文旨在研究let-7i-5p 在A549/G+細(xì)胞耐受吉西他濱中所起的作用及機(jī)制，為闡明肺癌耐藥機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

非小細(xì)胞肺癌吉西他濱敏感株A549/G-為本課題組保存；非小細(xì)胞肺癌耐吉西他濱耐藥株A549/G+為本課題組誘導(dǎo)后保存。A549/G+細(xì)胞復(fù)蘇后，常規(guī)消化并傳代。let-7i-5p 及內(nèi)參基因U6 為上海生工生物公司設(shè)計(jì)合成。let-7i-5p RT 引物：5′-GTCGTATCCAG TGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACA ACAGC-3′；上游引物：5′-CGCGCGTGAGGTAGTA GTTTGT-3′；下游引物：5′-AGTGCAGGGTCCGAGG TATT-3′。U6 RT 引物：5′-GTCGTATCCAGTGCAGG GTCCGAGGTATTCGCACTGGATCGACAAAAGC-3′；上游引物：5′-AGAGAAGATTAGCATGGCCCCTG-3′；下游引物：5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為NC 組（轉(zhuǎn)染let-7i-5p mimics NC）和let-7i-5p mimics 組（轉(zhuǎn)染let-7i-5p mimics）；let-7i-5p NC 組（轉(zhuǎn)染 inhibitor NC）和let-7i-5p inhibitor 組（轉(zhuǎn)染let-7i-5p inhibitor）。

1.2.2 細(xì)胞增殖能力試驗(yàn) 各組細(xì)胞在含有不同濃度吉西他濱的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期后分別進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)：首先用CCK-8（cell counting kit-8）進(jìn)行細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)，在450 nm 波長處進(jìn)行單波長測定各組細(xì)胞溶液吸光度，存活率(%)=（A實(shí)驗(yàn)組-A空白組）/（A對照組-A空白組）×100%，計(jì)算IC50值；其次，進(jìn)行細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)計(jì)算細(xì)胞克隆形成率；使用細(xì)胞周期檢測試劑盒（凱基生物科技公司）檢測細(xì)胞周期的變化。在此實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，提取NC 組和let-7i-5p mimics 組細(xì)胞總RNA，交由廣州銳博生物科技有限公司進(jìn)行mRNA 測序，比較兩組中差異表達(dá)的基因，預(yù)測let-7i-5p 發(fā)揮作用的可能通路。

1.2.3 免疫印跡實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染let-7i-5p mimics 后，采用RIPA 法進(jìn)行總蛋白提取，然后進(jìn)行蛋白質(zhì)定量測定，再經(jīng)SDS-PAGE 膠進(jìn)行電泳分離；隨后在250 mA，120 min 將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，室溫封閉90 min，然后進(jìn)行一抗孵育[CDK6 抗體（1∶1 000）、P21 抗體（1∶2 000）、抗體CyclinA（1∶1 000）、CDK2 抗體（1∶1 000）均購自美國CST 科技有限公司]。隨后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶1 000）室溫孵育1 h，最后加ECL 底物發(fā)光液進(jìn)行曝光檢測。同時設(shè)計(jì)let-7i-5p NC 組和let-7i-5p inhibitor 組，重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)操作，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果并統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

1.2.4 抑制P21 表達(dá) 在對A549/G+消化培養(yǎng)24 h后，實(shí)驗(yàn)組同時轉(zhuǎn)染let-7i-5p mimics 和siRNA-P21，對照組轉(zhuǎn)染let-7i-5p mimics 和P21-NC，利用RT-qPCR 技術(shù)檢測兩組細(xì)胞中P21 的表達(dá)情況。同時為確定let-7i-5p 與P21 的關(guān)系，明確let-7i-5p 在S 期到G2期的作用，在共同轉(zhuǎn)染let-7i-5p 的條件下，設(shè)置一組抑制P21 的表達(dá)作為實(shí)驗(yàn)組（let-7i-5p mimics-P21 siRNA 組），另一組作對照（let-7i-5p mimics-NC 組），比較在過表達(dá)let-7i-5p 的前提下，抑制P21 的表達(dá)，let-7i-5p mimics-P21 siRNA 組與let-7i-5p mimics-NC 組細(xì)胞增殖能力以及細(xì)胞周期和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過采用3 次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)得出，結(jié)果用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 let-7i-5p 使A549 細(xì)胞對藥物的耐受性降低

同一濃度下let-7i-5p mimics 組的細(xì)胞存活率低于NC 組（圖1A），IC50 值明顯低于NC 組（34 μmol/L vs.3 330 μmol/L）。轉(zhuǎn)染let-7i-5p 后的細(xì)胞可降低A549/G+細(xì)胞群體依賴性和增殖能力（圖1B、C）。let-7i-5p mimics 組的凋亡率高于NC 組（P＜0.05，圖1D、E）。同一藥物濃度下，let-7i-5p inhibitor 組的細(xì)胞抑制率低于對照組let-7i-5p NC 組（P＜0.05，圖2）。

圖1 不同濃度吉西他濱對let-7i-5p mimics 組和NC 組的作用比較

圖2 不同濃度吉西他濱對let-7i-5p inhibitor 組和let-7i-5p NC 組作用的比較

2.2 mRNA 測序顯示let-7i-5p 發(fā)揮作用與細(xì)胞周期有關(guān)

與NC 組相比，轉(zhuǎn)染let-7i-5p mimics 后，表達(dá)升高的基因有347 個，下調(diào)的基因有333 個；同時，KEGG信號通路預(yù)測在細(xì)胞水平上，let-7i-5p 發(fā)揮作用與細(xì)胞周期通路有極大的相關(guān)性（圖3A）。差異表達(dá)的基因結(jié)果顯示，與NC 組相比，let-7i-5p mimics 組CDK6的表達(dá)升高（圖3B）。

圖3 mRNA 測序結(jié)果

2.3 let-7i-5p 促進(jìn)細(xì)胞周期從G1 期向S 期轉(zhuǎn)變

與對照組相比，A549/G+細(xì)胞在轉(zhuǎn)染let-7i-5p mimics 后細(xì)胞周期G1期細(xì)胞比例下降，S 期細(xì)胞比例升高（圖4A、B、C）；另一方面，與let-7i-5p NC 組相比，let-7i-5p inhibitor 組G1期細(xì)胞占比輕度升高，S 期占比下降，G2-M 期細(xì)胞占比升高（P＜0.05，圖4D、E、F）。表明提高let-7i-5p 表達(dá)水平可促進(jìn)A549/G+細(xì)胞周期從G1期到S 期的進(jìn)展，阻礙S 期到G2-M 的轉(zhuǎn)變。

圖4 let-7i-5p 對細(xì)胞周期變化的影響

2.4 let-7i-5p 促進(jìn)CDK6 和P21 的表達(dá)

let-7i-5p mimics 組的CDK6 和P21 蛋白表達(dá)水平明顯高于NC 組（圖5A、B）；let-7i-5p mimics 組的CyclinA 和CDK2 蛋白表達(dá)水平明顯低于NC 組（圖5C、D），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或0.01，圖5E）。在抑制let-7i-5p 表達(dá)后，A549/G-細(xì)胞Westernblot 結(jié)果顯示let-7i-5p inhibitor 組中CDK6 和P21 表達(dá)低于NC 組，CyclinA 和CDK2 表達(dá)高于NC 組（P＜0.05或0.01，圖5F、G）。

圖5 細(xì)胞相關(guān)周期蛋白在各組的表達(dá)情況

2.5 抑制P21 表達(dá)可抑制let-7i-5p mimics 對細(xì)胞株的致敏性

經(jīng)過不同濃度梯度的吉西他濱處理后測得的let-7i-5p mimics-P21 siRNA 組和let-7i-5p mimics-NC 組的抑制率見圖6。在濃度較低時，吉西他濱對兩組的抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖6A）。let-7i-5p mimics-P21 siRNA 組的IC50值高于let-7i-5p mimics-NC組[35 μmol/L（14～102 μmol/L）vs117 μmol/L（39～1 032 μmol/L），P＜0.05]。吉西他濱0.001 mmol/L 時，兩組克隆數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；吉西他濱0.01 mmol/L 時，let-7i-5p mimics-P21 siRNA 組克隆數(shù)為let-7i-5p mimics-NC 組的138.1%；吉西他濱0.1 mmol/L時，let-7i-5p mimics-P21 siRNA 組克隆數(shù)約為let-7i-5p mimics-NC 組的142.6%（P＜0.05，圖6B、C）。流式細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)顯示，在藥物濃度為0.001、0.01 和0.1 mmol/L 條件下，let-7i-5p mimics-P21 siRNA 組的細(xì)胞凋亡率比let-7i-5p mimics-NC 組低（P＜0.05，圖6D、E）。提示轉(zhuǎn)染P21 siRNA 可以使經(jīng)let-7i-5p mimics 處理后變敏感的A549/G+細(xì)胞重新產(chǎn)生耐藥。

圖6 不同濃度吉西他濱對let-7i-5p mimics-P21 siRNA 組和let-7i-5p mimics-NC 組的作用

2.6 抑制P21 的表達(dá)后促進(jìn)了細(xì)胞從S 期到G2-M 期轉(zhuǎn)變

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示let-7i-5p mimics-P21 siRNA組中S 期所占的比例少于let-7i-5p mimics-NC 組，G2-M 期的比例多于let-7i-5p mimics-NC 組（P＜0.05，圖7A、B、C）。Western-blot 結(jié)果表明let-7i-5p mimics 在轉(zhuǎn)染P21 后細(xì)胞相關(guān)周期蛋白的表達(dá)有差異（圖7D），let-7i-5p mimics-P21 siRNA 組中CDK2 和CyclinA 的表達(dá)高于let-7i-5p mimics-NC 組（P＜0.05），P21 的表達(dá)低于let-7i-5p mimics-NC 組（P＜0.01），CDK6 的表達(dá)兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖7E。

圖7 let-7i-5p mimics-P21 siRNA 組和let-7i-5p mimics-NC 組細(xì)胞周期及其細(xì)胞周期蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

化療是治療肺癌最常用手段之一，耐藥是制約其療效的主要障礙。雖然吉西他濱作為第3 代化療藥物有比傳統(tǒng)化療藥物具有更好的療效，但研究表明，由于腫瘤細(xì)胞快速的耐藥反應(yīng)，吉西他濱在治療肺癌時的總有效率僅約20%[11]。

let-7i-5p 作為let 家族的一員，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系[12]。研究表明，let-7i-5p 對腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展起抑制作用。2018 年，Chhabra[13]發(fā)現(xiàn)let-7i-5p 通過抑制表皮生長因子/ 磷脂酰肌醇-3-羥激酶/SOX2信號通路抑制宮頸癌腫瘤細(xì)胞的發(fā)生。Takamizawa 等[14]也報道了let-7i 表達(dá)降低的非小細(xì)胞肺癌患者中，其手術(shù)后生存期明顯縮短。本文通過CCK-8 細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞術(shù)等實(shí)驗(yàn)表明let-7i-5p 可以降低肺腺癌細(xì)胞A549 對吉西他濱的耐藥性，使A549/G+細(xì)胞對吉西他濱變得敏感。本文從過表達(dá)let-7i-5p 和抑制let-7i-5p 表達(dá)得出的結(jié)果都可說明這一點(diǎn)。

本研究對let-7i-5p mimics 組和NC 組進(jìn)行的mRNA 測序和KEGG 通路分析表明，let-7i-5p 促進(jìn)A549 細(xì)胞發(fā)生耐藥與細(xì)胞周期有關(guān)。同時，兩組間由于let-7i-5p 表達(dá)水平改變引起的CDK6 的變化可能是細(xì)胞周期發(fā)生改變的原因。細(xì)胞周期的改變又會影響細(xì)胞增殖及細(xì)胞對吉西他濱的耐受性。這為完善肺癌細(xì)胞A549 耐吉西他濱機(jī)制提供了啟示。

CDK6 是一種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶，具有促進(jìn)G1 期向S 期進(jìn)展，縮短DNA 復(fù)制周期，促進(jìn)細(xì)胞的增殖的作用[15]。目前，在肺癌、乳腺癌、頭頸癌中均發(fā)現(xiàn)了CDK6 的高表達(dá)[16-17]。Shen 等[18]研究證實(shí)，let-7可以通過調(diào)控CDK6 的磷酸化作用，促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S 期過渡，從而加快細(xì)胞周期過程。流式細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)和Western-blot 結(jié)果表明過表達(dá)let-7i-5p 可提高CDK6 的表達(dá)，CDK6 促進(jìn)了細(xì)胞周期從G1期到S 期進(jìn)展。那么既然let-7i-5p 促進(jìn)G1期向S 期進(jìn)展，為何let-7i-5p mimics 組的細(xì)胞在耐吉西他濱增殖作用中的能力下降了呢？從細(xì)胞周期結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，let-7i-5p mimics 組細(xì)胞S 期比例明顯升高，而調(diào)控S 期至G2/M 期的Cyclin A（細(xì)胞周期蛋白A）是細(xì)胞周期中的正性調(diào)控因子，在G1晚期開始合成，含量在S 期逐漸增加，于G2/M 期達(dá)到高峰[19-20]。有研究證實(shí)，CyclinA 在非小細(xì)胞肺癌[21]、乳腺癌[22]等多種腫瘤中高表達(dá)。而CDK2 作為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶家族（CDKs）的重要成員，激活后與Cyclin A 共同作用，形成CyclinA-CDK2 復(fù)合物，對S 期和G2/M 期過渡具有重要作用，促進(jìn)了DNA 復(fù)制的進(jìn)行[23]。有研究表明，抑制CyclinA-CDK2 復(fù)合物的表達(dá)，可有效阻止腫瘤細(xì)胞的增殖[24]。結(jié)合外泌體芯片miRNA 差異表達(dá)分析，用差異表達(dá)最大的5 種miRNAs 進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測其下游基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)P21/CDKN1A 基因具有很大的指向性。P21 屬于抑癌基因產(chǎn)物，是細(xì)胞周期的負(fù)調(diào)控蛋白[25]，可與相應(yīng)的Cyclin-CDK 復(fù)合物結(jié)合，使CDK 失去蛋白激酶活性，阻止細(xì)胞周期的進(jìn)行[26-27]。目前已知P21 可以結(jié)合作用的底物有CyclinACDK2[28]、CyclinD-CDK4[29]、CyclinE-CDK2[30]等。

鑒于此，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為let-7i-5p 可能是通過P21 影響CyclinA-CDK2 復(fù)合物的表達(dá)，間接影響細(xì)胞的周期，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的增殖。為了驗(yàn)證上述推測，在A549/G+細(xì)胞中過表達(dá)let-7i-5p 后，我們發(fā)現(xiàn)P21 在let-7i-5p mimics 組中是高表達(dá)的，隨后又檢測了CDK2 及CyclinA 的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，let-7i-5p mimics 組中CyclinA 及CDK2 的表達(dá)量均低于NC 組（P＜0.05），由此可見，let-7i-5p mimics 組中低表達(dá)的CyclinA 和CDK2 阻滯了細(xì)胞周期從S 期到G2-M期的轉(zhuǎn)化，使細(xì)胞復(fù)制周期停滯在S 期，影響細(xì)胞的增殖。這與我們之前細(xì)胞的增殖行為的改變及流式細(xì)胞周期檢測的結(jié)果都是一致的。隨后，在A549/G-細(xì)胞中抑制let-7i-5p 的表達(dá)從反方面論證了let-7i-5p 對CDK6、P21 的促進(jìn)作用。

另一方面，在轉(zhuǎn)染let-7i-5p mimics 的基礎(chǔ)上，對let-7i-5p mimics-P21 siRNA 組的P21 進(jìn)行抑制表達(dá)，與let-7i-5p mimics-NC 組相比，let-7i-5p mimics-P21 siRNA 組中CCK-8 增殖能力增強(qiáng)，平板克隆形成能力升高，細(xì)胞凋亡率降低，原本在轉(zhuǎn)染let-7i-5p mimics 后對藥物敏感的A549/G+細(xì)胞對吉西他濱的作用又表現(xiàn)出抵抗性。說明P21 表達(dá)水平的降低，一定程度上促進(jìn)了細(xì)胞的增殖與耐藥。

細(xì)胞周期結(jié)果表明在抑制P21 表達(dá)后，細(xì)胞S 期比例降低，G2-M 期比例明顯升高，說明降低P21 的表達(dá)促進(jìn)了細(xì)胞由S 期向G2-M 期的進(jìn)程。同時，Westernblot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示降低P21 表達(dá)后，CDK2 和CyclinA的表達(dá)水平升高；而他們表達(dá)水平升高會促進(jìn)細(xì)胞周期從S 期到G2-M 期的進(jìn)程，促進(jìn)了細(xì)胞的DNA 復(fù)制，增強(qiáng)了細(xì)胞的增殖能力，也促進(jìn)了細(xì)胞對吉西他濱的抵抗性。而Zhu 等[31]曾在研究肺癌細(xì)胞耐吉非替尼的機(jī)理中證實(shí)了P53/P21 凋亡通路的激活，可以誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯在G2期/M 期，從而增強(qiáng)肺癌細(xì)胞對吉非替尼的敏感性。Li 等[32]在對乳腺癌細(xì)胞增殖的研究中也發(fā)現(xiàn)P21 的高表達(dá)可以誘導(dǎo)G2/M 期的阻滯，從而有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。2021 年，黃淵鋒等[33]研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期的負(fù)調(diào)控因子P21 可以阻滯細(xì)胞G2/M 期，從而增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌對吉非替尼的敏感性。綜上，在A549/G+細(xì)胞中l(wèi)et-7i-5p 可以提高吉西他濱敏感性，一定程度上解釋了let-7i-5p 可以降低A549/G+細(xì)胞對吉西他濱耐受性的原因。let-7i-5p 高表達(dá)引起CDK6 的表達(dá)升高，促進(jìn)了細(xì)胞周期從G1期到S 期的進(jìn)展；同時，也促進(jìn)P21 表達(dá)水平升高，P21 又抑制了CyclinACDK2 復(fù)合物的表達(dá)，間接地引起了S 期到G2-M 期的進(jìn)展受阻，細(xì)胞周期停滯在S 期，引起細(xì)胞DNA 復(fù)制減慢，造成A549/G+在吉西他濱的作用下增殖能力的減弱，降低了A549/G+細(xì)胞對吉西他濱的耐受性。

總之，本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了let-7i-5p 表達(dá)水平可能通過影響細(xì)胞周期改變對A549/G+細(xì)胞對吉西他濱的耐藥性，為肺癌耐吉西他濱機(jī)制的深入研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。