李 雪，徐 雅，杜慶紅，白俊杰，王 旭，李 靖

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京 102401；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；3.西藏藏醫(yī)藥大學(xué)，拉薩 850000)

失眠屬于中醫(yī)學(xué)“不寐”范疇，指出現(xiàn)持續(xù)而頻繁的入睡困難、睡眠維持困難，以睡眠滿意度不足為特征的睡眠障礙[1]。中醫(yī)認(rèn)為不寐的病機(jī)為陰陽(yáng)氣血失調(diào)、營(yíng)衛(wèi)失和，可分為肝火擾神證、痰熱擾神證、心膽氣虛證、心腎不交證、心脾兩虛證5種證型，五臟中與心腎的關(guān)系最為密切[2]。長(zhǎng)期的心腎不交使五臟六腑氣血陰陽(yáng)失衡，出現(xiàn)入睡困難、睡眠時(shí)間短、多夢(mèng)等各種不寐癥狀，重者影響神志、臟腑且容易反復(fù)，難以治愈。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)應(yīng)用的鎮(zhèn)靜安神類藥物存在一定的藥物依賴性，濫用亦會(huì)損傷軀體功能并加重失眠[3]。民族醫(yī)藥治療失眠從病機(jī)入手效果良好，副作用小，是臨床重要的治療手段。本文基于中醫(yī)對(duì)心腎不交證失眠的認(rèn)識(shí)，同時(shí)結(jié)合臨床經(jīng)驗(yàn)，選擇藏黃連、肉豆蔻、力噶都、紅花4味藥組成自擬安神方(以下簡(jiǎn)稱安神方)，觀察其對(duì)心腎不交證失眠大鼠的影響及作用機(jī)制，為臨床診療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究通過北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)BUCM-4-2022040102-2025)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)健康雄性SD大鼠60只，6周齡，體質(zhì)量180 g～220 g，購(gòu)于北京斯貝福有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(京)2019-0010。動(dòng)物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物房，正常飲水，普通動(dòng)物飼料，室溫(20±2)℃，濕度30%～40%。

1.2 主要藥物及制備

藏黃連飲片(貨號(hào)19992036)、肉豆蔻飲片(貨號(hào)20000098)、力噶都飲片(貨號(hào)20000567)、紅花飲片(貨號(hào)20000307)，黃連飲片(貨號(hào)20000208)、肉桂飲片(貨號(hào)20000306)，北京上醫(yī)仁家中醫(yī)診所有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)(京)20180032。

安神方高劑量含藏黃連56 g，肉豆蔻56 g，力嘎都84 g，紅花16.8 g，安神方中劑量藥量減半，安神方低劑量再減半，采用水煎法煎煮2次后混合藥液濃縮至安神方高、中、低劑量每1 mL含生藥各0.76 g、0.38 g、0.19 g。交泰丸中黃連、肉桂按照6∶1比例水煎，煎煮2次后交泰丸混合藥液濃縮至每1 mL含生藥6 g。

1.3 主要試劑、配制方法及儀器

DL-4-氯苯基丙氨酸(para-chlorophenylalanine，PCPA)(法國(guó)Acros公司，貨號(hào)157280250)；促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin releasing hormone，CRH)、促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropic hormone, ACTH)、皮質(zhì)醇(cortisol,CORT)的Elisa檢測(cè)試劑盒(上海藍(lán)基生物科技有限公司，貨號(hào)分別為E02C0372、E02A0005、E02C0008)；碳酸氫鈉、無水碳酸鈉(北京百瑞極生物科技有限公司,貨號(hào)分別為BN23023、BN23025)；戊巴比妥鈉(美國(guó)Sigma公司,貨號(hào)20170318)；多巴胺(dopamine，DA)標(biāo)準(zhǔn)品(上海源葉公司,貨號(hào)B60897)；5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)標(biāo)準(zhǔn)品(美國(guó)Sigma公司,貨號(hào)H9523)。

PCPA 注射液的配制：稱取3.392 g無水碳酸鈉溶于320 mL蒸餾水，稱取1.512 g碳酸氫鈉溶于180 mL蒸餾水，攪拌混合后配制成緩沖液，使pH值達(dá)到7.0。稱取6.75 g的PCPA粉末，溶于150 mL緩沖液中,配制成濃度為45 g·L-1的混懸液。

ELX-800型酶標(biāo)儀，美國(guó)BIOTEK公司；QB-9002型微量快速震蕩儀，中國(guó)海門其林貝爾公司；H1850R型離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；TY2018001416型高效液相色譜電化學(xué)分析儀，美國(guó)戴安公司。

2 方法

2.1 動(dòng)物造模及分組

表1示，SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后隨機(jī)分為正常組和PCPA組，依據(jù)Murray N M[4]等提出的PCPA法和郜紅利[5]等提出的多因素方法制備模型。PCPA組造模方法：復(fù)合因素刺激14 d后，腹腔注射PCPA(450 mg·kg-1)，連續(xù)注射3 d。正常組大鼠在前2周里內(nèi)正常喂食飲水，不施加任何刺激因素，第15～17天注射等體積的0.9%氯化鈉溶液。第18天時(shí)應(yīng)用戊巴比妥鈉翻正實(shí)驗(yàn)和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證心腎不交證失眠模型是否成功。將造模成功的PCPA組大鼠隨機(jī)分為模型組，安神方高、中、低劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組，另設(shè)正常組每組10只，分別灌胃相應(yīng)藥物2周。

表1 多因素造模方法比較

2.2 給藥方法

按臨床試驗(yàn)方法計(jì)算安神方高、中、低劑量組給藥濃度分別為0.076 g·kg-1·d-1、0.038 g·kg-1·d-1、0.019 g·kg-1·d-1，陽(yáng)性對(duì)照組給予交泰丸混懸液，給藥濃度為0.6 g·kg-1·d-1，每日1次，連續(xù)14 d。正常組和模型組大鼠給予等量的0.9%氯化鈉溶液。實(shí)驗(yàn)第32天時(shí)所有大鼠再次進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和戊巴比妥鈉翻正實(shí)驗(yàn)。

2.3 一般情況觀察

觀察各組大鼠的行為表現(xiàn)、運(yùn)動(dòng)情況、失眠情況、毛發(fā)光澤、精神狀態(tài)和體質(zhì)量的變化。

2.4 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

于第0天、第18天、第32天早上8∶00進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，將大鼠輕放在曠場(chǎng)箱正中觀察5 min內(nèi)大鼠的活動(dòng)情況。每只大鼠測(cè)試結(jié)束之后，將曠場(chǎng)箱清理干凈并用酒精擦拭。用行為學(xué)分析軟件分析記錄總活動(dòng)距離、修飾次數(shù)、中央格停留時(shí)間、直立次數(shù)、穿中央格次數(shù)。

2.5 戊巴比妥鈉翻正實(shí)驗(yàn)

戊巴比妥鈉翻正實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)模型是否成功以及給藥效果。預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)得翻正實(shí)驗(yàn)大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉劑量為0.40 mg·kg-1。正式實(shí)驗(yàn)分別于第18天和第32天麻醉各組大鼠，記錄腹腔注射藥物時(shí)間、大鼠入睡時(shí)間與大鼠蘇醒時(shí)間，大鼠60 s內(nèi)不翻動(dòng)視為翻正反射消失，檢測(cè)指標(biāo)為大鼠睡眠持續(xù)時(shí)間和睡眠潛伏期。睡眠持續(xù)時(shí)間：大鼠翻正反射消失到蘇醒的時(shí)間；睡眠潛伏期為大鼠開始麻醉到大鼠翻正反射消失的時(shí)間。

2.6 取材

取材前1天禁食不進(jìn)水，第33天時(shí)腹腔注射戊巴比妥鈉注射液(0.45 mg·kg-1)麻醉取材。取動(dòng)脈血后靜置1 h低溫離心取上清，取血清做Elisa實(shí)驗(yàn)。冰上取下丘腦后迅速裝入去酶凍存管，置于-80 ℃低溫冰箱保存。

2.7 Elisa法檢測(cè)大鼠血清中CRH、ACTH、CORT含量

按照Elisa試劑盒說明書測(cè)定各組大鼠血清中CRH、ACTH、CORT含量。

2.8 高效液相色譜-電化學(xué)法測(cè)定下丘腦DA和5-HT的含量

取下丘腦組織冰盒上精密稱重，以1∶5000的比例加入0.1 mol/L的高氯酸裂解液。超聲破碎儀破碎腦組織，離心后取上清，-80 ℃保存。配制單胺類流動(dòng)相、超純水、純乙腈、異丙醇。C18高效液相色譜柱，35 ℃柱溫，標(biāo)準(zhǔn)品10 μL或樣品20 μL的進(jìn)樣量，以0.2 mL/min的流速觀察DA、5-HT的出峰時(shí)間[6]。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 模型評(píng)價(jià)結(jié)果

3.1.1 造模后大鼠一般情況觀察結(jié)果 圖1示，多因素刺激14 d以及注射PCPA混懸液3 d后，PCPA組大鼠體質(zhì)量比正常組明顯減輕(P<0.05)。PCPA組大鼠白天活動(dòng)量增加，白天睡眠時(shí)間減少，精神萎靡不振，鼠毛干枯無光澤、發(fā)黃，尿量減少，顏色發(fā)黃，進(jìn)食、飲水量明顯增加，對(duì)外界刺激敏感、易激惹，容易驚恐，打斗情況增加，攻擊力上升，出現(xiàn)撕咬等情況。

注：與正常組比較：*P<0.05；DL-4-氯苯基丙(para-chlorophenylalanine，PCPA)

3.1.2 造模后大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 圖2示，采用行為學(xué)中的曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)觀察大鼠的緊張和焦慮情緒。與正常組比較，PCPA組大鼠的總活動(dòng)距離明顯增加(P<0.05)，中央格停留時(shí)間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

注：與正常組比較：*P<0.05；DL-4-氯苯基丙氨酸(para-chlorophenylalanine，PCPA)

3.1.3 造模后大鼠睡眠質(zhì)量結(jié)果 圖3示，應(yīng)用戊巴比妥翻正實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠的睡眠質(zhì)量。與正常組比較，PCPA組大鼠的睡眠潛伏期明顯變長(zhǎng)(P<0.01)，睡眠持續(xù)時(shí)間縮短(P<0.01)，證明失眠模型建立成功。PCPA組大鼠晝夜節(jié)律紊亂，白天睡眠時(shí)間減少，精神消極，毛發(fā)枯黃，符合心腎不交證特征。

注：與正常組比較：**P<0.01；DL-4-氯苯基丙氨酸(para-chlorophenylalanine，PCPA)

3.2 安神方對(duì)心腎不交證失眠模型大鼠的影響

3.2.1 安神方對(duì)各組大鼠一般情況的影響 圖4示，治療14 d后模型組大鼠體質(zhì)量增量低于正常組(P<0.05)，模型組大鼠精神差，毛發(fā)枯燥、易掉毛，舌苔紫暗，易激惹。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組與安神方3劑量組2周體質(zhì)量增量顯著增加(P<0.05)，大鼠毛發(fā)脫落減少。陽(yáng)性對(duì)照組大鼠舌苔紫暗情況減輕，打斗次數(shù)減少，白天較給藥前安靜。

注：Z組：正常組；M組：模型組；JT組：陽(yáng)性對(duì)照組；ASFD組：安神方低劑量組；ASFZ組：安神方中劑量組；ASFG組：安神方高劑量組;與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.2.2 安神方對(duì)各組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的影響 圖5示，與正常組比較，模型組大鼠總活動(dòng)距離增加，直立次數(shù)增加(P<0.05)，其余指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組、安神方低、中劑量組大鼠總活動(dòng)距離均縮短(P<0.05)，陽(yáng)性對(duì)照組、安神方3劑量組的直立次數(shù)均減少(P<0.05)。

注：Z組：正常組；M組：模型組；JT組：陽(yáng)性對(duì)照組；ASFD組：安神方低劑量組；ASFZ組：安神方中劑量組；ASFG組：安神方高劑量組；與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.2.3 安神方對(duì)各組大鼠睡眠質(zhì)量的影響 圖6示，與正常組比較，模型組大鼠睡眠潛伏期延長(zhǎng)(P<0.01),睡眠持續(xù)時(shí)間縮短(P<0.01)；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組、安神方中、高劑量組大鼠睡眠潛伏期時(shí)間均顯著縮短(P<0.01)，陽(yáng)性對(duì)照組、安神方3劑量組睡眠持續(xù)時(shí)間均顯著延長(zhǎng)(P<0.01)。

注：Z組.正常組；M組.模型組；JT組.陽(yáng)性對(duì)照組；ASFD組.安神方低劑量組；ASFZ組.安神方中劑量組；ASFG組.安神方高劑量組；與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

3.2.4 安神方對(duì)各組大鼠下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamic pituitary adrenal axis，HPA)功能的影響 圖7示，與正常組比較，模型組大鼠血清CRH含量升高(P<0.05)，ACTH、CORT含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組、安神方3劑量組的CRH含量降低(P<0.05)。

注：Z組：正常組；M組：模型組；JT組：陽(yáng)性對(duì)照組；ASFD組：安神方低劑量組；ASFZ組：安神方中劑量組；ASFG組：安神方高劑量組；促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)，促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin releasing hormone，CRH)，皮質(zhì)醇(cortisol，CORT)；與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.2.5 安神方對(duì)大鼠下丘腦DA和5-HT含量的影響 圖8、9示，與正常組比較，模型組大鼠下丘腦DA含量升高(P<0.05)，5-HT含量下降(P<0.05)；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組、安神方中、高劑量組DA含量降低(P<0.05)，安神方低劑量組5-HT含量升高(P<0.05)。

注：Z組：正常組；M組：模型組；JT組：陽(yáng)性對(duì)照組；ASFD組：安神方低劑量組；ASFZ組：安神方中劑量組；ASFG組：安神方高劑量組;多巴胺(dopamine，DA),5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)；與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

4 討論

心腎不交證不寐表現(xiàn)為心煩不寐、心悸、眩暈、五心煩熱、咽干口燥、消瘦、舌紅、脈細(xì)數(shù)等癥狀。造模后大鼠出現(xiàn)體質(zhì)量下降，舌質(zhì)紫暗，精神萎靡不振，毛發(fā)干枯無光澤、發(fā)黃，尿量變少，容易暴躁易怒，表現(xiàn)出心火亢盛、腎陰虧虛的癥狀，符合中醫(yī)心腎不交證失眠的表現(xiàn)。中醫(yī)治療心腎不交證失眠多交通心腎，調(diào)整臟腑陰陽(yáng)為治，方藥用交泰丸，臨床顯示，交泰丸可改善患者睡眠質(zhì)量，改善神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)和谷氨酸(glutamic acid，Glu)的比值[7]。

藏醫(yī)認(rèn)為失眠的發(fā)生與體內(nèi)“隆”的偏盛有關(guān)，而隆、赤巴和培根是構(gòu)成人體的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是進(jìn)行生命活動(dòng)不可缺少的能量和基礎(chǔ)，隆的失衡必然會(huì)導(dǎo)致赤巴和培根功能的異常，使機(jī)體出現(xiàn)寒熱混雜現(xiàn)象，因而導(dǎo)致陽(yáng)不入陰、陰陽(yáng)失交遂致失眠，其發(fā)病機(jī)理與中醫(yī)的心腎不交證失眠極其相似。根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)，課題組仿交泰丸創(chuàng)立自擬安神方，方中以藏黃連和肉豆蔻為主藥，其中藏黃連清熱解毒，以治五臟有熱；肉豆蔻散寒消隆,二藥相合既清熱又散寒，可調(diào)整寒熱、平衡陰陽(yáng)；力噶都有清熱解毒功效，配入方中以加強(qiáng)藏黃連清熱之功；紅花取其活血化瘀功效，用以疏通“病久入絡(luò)”所致的瘀堵，4味相合共奏調(diào)整寒熱、活血化瘀、安神定志之功。

圖9 各組大鼠下丘腦多巴胺(dopamine，DA)、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)高效液相色譜圖

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)選用戊巴比妥鈉翻正實(shí)驗(yàn)和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)用以檢測(cè)造模結(jié)果和安神方的作用，同時(shí)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)還用以檢測(cè)大鼠焦慮情緒的變化。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的中央格穿越次數(shù)及停留時(shí)間可以反映大鼠的焦慮以及抑郁的程度[8]，直立次數(shù)和修飾次數(shù)反映大鼠在陌生環(huán)境中的活躍程度及探究度[9]。大鼠越緊張總活動(dòng)距離越長(zhǎng)，由此可以反映大鼠的緊張、焦慮程度[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，造模后PCPA組大鼠睡眠潛伏期延長(zhǎng)，睡眠持續(xù)時(shí)間縮短，總活動(dòng)距離增加，說明實(shí)驗(yàn)?zāi)M心腎不交證失眠患者煩躁易怒、精神亢奮的癥狀表現(xiàn)成功，大鼠具有明顯的焦慮行為，與劉瑩[11]等實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，進(jìn)一步說明造模成功。給藥后安神方3劑量組以及陽(yáng)性對(duì)照組均可以縮短睡眠潛伏期，延長(zhǎng)睡眠持續(xù)時(shí)間，并且大鼠的總活動(dòng)距離、直立次數(shù)比模型組減少，說明藥物可以緩解大鼠的焦慮、緊張狀態(tài)，從而改善睡眠。

HPA軸功能紊亂是心腎不交證的生物學(xué)機(jī)制之一。HPA軸是機(jī)體維持體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)和調(diào)控應(yīng)激反應(yīng)的重要生理學(xué)基礎(chǔ)[12]。下丘腦是HPA軸負(fù)反饋調(diào)節(jié)通路的首要環(huán)節(jié)，HPA軸分泌的CRH、ACTH、CORT彼此相互影響。應(yīng)激狀態(tài)下，HPA軸被激活后CRH的分泌隨之增加，ACTH 和CORT 的濃度也同時(shí)升高，從而導(dǎo)致失眠[13]，且HPA軸對(duì)睡眠的影響關(guān)鍵在于CRH[14]。當(dāng)機(jī)體受到刺激時(shí)，HPA軸亢進(jìn)會(huì)誘發(fā)激素級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起分子水平的改變，從而導(dǎo)致失眠[15]。有研究報(bào)道，交泰丸可顯著調(diào)節(jié)失眠大鼠的HPA軸激素水平[16]。本實(shí)驗(yàn)安神方各劑量均能顯著抑制CRH和CORT合成，可能為安神方改善睡眠的機(jī)制之一。

DA和5-HT亦會(huì)參與調(diào)控睡眠-覺醒通路，是腦內(nèi)重要的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)。5-HT含量的減少與失眠有關(guān)[17]。當(dāng)大腦中DA的濃度增加時(shí)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性增加，從而促進(jìn)覺醒。清·陳士鐸[18]認(rèn)為，心腎不交可因腎水過盛太寒，水趨于下不得上升濟(jì)心火，心火獨(dú)亢導(dǎo)致失眠。神經(jīng)遞質(zhì)的失調(diào)會(huì)影響生理活動(dòng)，因此神經(jīng)遞質(zhì)可以作為信號(hào)傳導(dǎo)，為“心腎相交”理論提供現(xiàn)代生物學(xué)依據(jù)[19-22]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，安神方低、高劑量組在降低DA含量、提高5-HT含量、抑制興奮作用方面效果較好，說明安神方對(duì)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)和興奮性神經(jīng)遞質(zhì)具有雙向調(diào)節(jié)作用，故能交通心腎，活血化瘀，安神定志。

綜上所述，自擬安神方可以顯著改善大鼠心腎不交證失眠，其機(jī)制可能與抑制HPA軸相關(guān)激素CRH和CORT合成，調(diào)控腦組織中興奮性神經(jīng)遞質(zhì)和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的合成有關(guān)，其深層次機(jī)制還需進(jìn)一步研究。