姜 璐，陳 婷，郭良清，郭 棟△

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南 250011；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，濟(jì)南 250011；3.山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南 250355)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種特發(fā)性的慢性炎癥性腸道疾病，其病變通常起于直腸，逐漸向近端結(jié)腸延伸，可累及整段結(jié)腸[1-3]，嚴(yán)重者可能會(huì)出現(xiàn)皮膚、肝臟、眼睛或關(guān)節(jié)的腸外表現(xiàn)[4]。該病可能在任何時(shí)間和所有年齡出現(xiàn)，但主要的發(fā)病年齡在15～30歲之間達(dá)到峰值[5]。UC的治療目前多通過局部或全身性類固醇或氨基水楊酸制劑等經(jīng)典療法緩解急性炎癥，在中度至重度UC中，硫唑嘌呤或6-巰基嘌呤甚至環(huán)孢素A、他克莫司的免疫抑制有助于維持緩解，對(duì)于無法通過經(jīng)典療法緩解的患者，多通過生物學(xué)方法治療，如抗腫瘤壞死因子制劑(英夫利昔單抗、阿達(dá)木單抗以及戈利木單抗)[4,6]。但是，藥物治療失敗者和因長(zhǎng)期炎癥狀態(tài)需要手術(shù)治療者仍可達(dá)15%[7]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，到2025年，UC在全球的流行率預(yù)計(jì)將影響到3000萬人[8]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為UC以大腸濕熱證最為多見，大腸濕熱證多為脾胃中焦虛弱而無以運(yùn)化，水谷失運(yùn)日久而生濕，濕邪易挾熱，濕熱蘊(yùn)結(jié)腸道日久而致腸道黏膜受損，而濕熱蘊(yùn)結(jié)日久又可使氣血失和，故見下利赤白相間膿血、腹痛泄瀉。故治療常需氣血兼顧、攻補(bǔ)兼施，注重寒熱共濟(jì)，方可氣調(diào)血安，清熱利濕而不傷正氣，邪去則正安。愈潰涼血顆粒(yu kui granules, YKG)是由白頭翁湯和烏梅丸、黃芩湯加減結(jié)合臨床藥物療效化裁而成，主治以下痢膿血、里急后重為臨床特點(diǎn)的厥陰熱毒血痢。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從生物分子網(wǎng)絡(luò)的角度研究藥物和疾病的作用機(jī)制[9-11]，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以將計(jì)算、實(shí)驗(yàn)和臨床研究相結(jié)合，為探索中草藥的特性并聯(lián)系現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的前沿。故本文以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法為研究手段，對(duì)YKG治療UC的具體作用機(jī)制進(jìn)行分析挖掘，為YKG的進(jìn)一步臨床及實(shí)驗(yàn)研究提供理論證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)與軟件

主要包括中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)及分析平臺(tái)(TCMSP，https://www.tcmspw.com/)、UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.uniprot.org/)、人類基因數(shù)據(jù)庫(kù)(GeneCards，https://www.genecards.org/)、功能性蛋白質(zhì)聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)(STRING，https://string-db.org/)、cytoscape 3.7.2軟件和DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)[12]。

1.2 槐花散化合物及靶點(diǎn)的鑒定

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索該方中組成中藥藥物成分白頭翁、黃連、白及、地榆、黃柏、秦皮、烏梅、炮姜、肉桂、黃芪、白芍、椿皮、黃芩、炙甘草14味中藥的有效化合物?？诜锢枚?oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18是YKG在化合物篩選過程中必須遵循的條件[12]，獲取YKG的有效化合物后，將所得到的化合物通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步得到其對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)。將所獲靶點(diǎn)通過UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化名稱轉(zhuǎn)換。通過Cytoscape 3.7.2軟件建立“YKG-所含化合物-對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。

1.3 UC的靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)的獲取

關(guān)鍵詞(key word)是“ulcerative colitis”，從GeneCards中獲取與UC有密切聯(lián)系的靶基因。

1.4 YKG與UC共同靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction, PPI)的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將YKG與UC的作用靶點(diǎn)做映射處理，篩選后得到的靶點(diǎn)被視為YKG治療UC的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，然后導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取它們之間的關(guān)系數(shù)據(jù)，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2，構(gòu)建YKG與UC的PPI網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步通過Cyto NCA插件實(shí)施網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觥?/p>

1.5 富集分析

將所獲YKG與UC的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路富集分析和基因本體論(gene ontology, GO)分析，其中GO分析主要通過對(duì)生物學(xué)過程(biological process, BP)、細(xì)胞組成部分(component of cell, CC)、分子功能(molecular function, MF)的分析來完成。在Image GP網(wǎng)站和Microsoft Excel 2010軟件對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 YKG的成分、靶點(diǎn)及UC靶點(diǎn)篩選結(jié)果

以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為篩選標(biāo)準(zhǔn)將從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)獲取的化合物進(jìn)行篩選(其中肉桂以DL≥0.14為篩選標(biāo)準(zhǔn))共獲得YKG中209個(gè)化合物。進(jìn)一步得到對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)160個(gè)，160個(gè)靶點(diǎn)主要與187個(gè)化合物有關(guān)(見表1)，并構(gòu)建含有YKG的14味中藥187個(gè)化合物160個(gè)靶點(diǎn)的中藥-化合物-靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)圖(見圖1)。此外，在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中共獲得了4622個(gè)與UC密切相關(guān)的靶點(diǎn)。

表1 愈潰涼血顆粒(YKG)的化合物信息表

2.2 YKG-UC的PPI網(wǎng)絡(luò)

對(duì)上述所獲YKG的160個(gè)靶點(diǎn)以及UC的4622個(gè)作用靶點(diǎn)做交叉映射處理，最終得到90個(gè)YKG-UC的共同靶點(diǎn)(如圖2)。通過STRING獲取90個(gè)靶點(diǎn)的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)后導(dǎo)入Cytoscape 3.6.2，構(gòu)建一個(gè)含有90個(gè)節(jié)點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)(如圖3-a)。由于網(wǎng)絡(luò)涉及節(jié)點(diǎn)較多，進(jìn)一步以CytoNCA插件進(jìn)行拓?fù)浞治觯鶕?jù)中介中心性(betweenness centrality，BC)>5.15、接近中心性(closeness centrality，CC)>0.54、度值(Degree)>20為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選出45個(gè)靶點(diǎn)(見圖3-b)，構(gòu)建45個(gè)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)一步根據(jù)BC>7.33，CC>0.74，Degree>29為篩選標(biāo)準(zhǔn)，在45個(gè)靶點(diǎn)中篩選出23個(gè)核心靶點(diǎn)，并依照核心靶點(diǎn)的Degree大小繪制PPI網(wǎng)絡(luò)(見圖3-c)。通過PPI網(wǎng)絡(luò)最終發(fā)現(xiàn)抑癌基因P53(tumor suppressor gene P53,TP53)、轉(zhuǎn)錄因子和蛋白(transcription factors and proteins, JUN)、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(prostaglandin endoperoxide synthase 2，PTGS2)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP2)、表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)、白介素2(interleukin 2, IL-2)等靶點(diǎn)的度值處于較高水平，所以本研究認(rèn)為以上靶點(diǎn)可能為YKG治療UC的有效靶點(diǎn)(如圖3)。

圖2 愈潰涼血顆粒(YKG)-潰瘍性結(jié)腸炎(UC)的靶點(diǎn)映射

圖3 愈潰涼血顆粒(YKG)-潰瘍性結(jié)腸炎(UC)的靶點(diǎn)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D

2.3 GO富集分析

GO富集分析發(fā)現(xiàn)，90個(gè)靶點(diǎn)主要涉及260個(gè)GO條目，進(jìn)一步以P<0.01為篩選標(biāo)準(zhǔn)，共獲得199個(gè)GO條目，其中BP 包括144個(gè)，CC包括24個(gè)，MF包括31個(gè)，根據(jù)P值分別取前10的條目進(jìn)行可視化處理(見圖4)，其中BP以藍(lán)色條形表示，有細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、基因表達(dá)的調(diào)控、信號(hào)傳導(dǎo)、氧化還原、老化、低氧應(yīng)答等；CC以綠色條形表示，有胞外區(qū)、質(zhì)膜、胞漿、細(xì)胞表面等；MF方面以橙色條形表示，有蛋白結(jié)合、蛋白質(zhì)同二聚體活性、酶結(jié)合、類固醇激素受體活性等。

2.4 KEGG通路富集分析

在DAVID 6.8對(duì)YKG和UC的90個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行分析，大約得到105條KEGG通路，以P<0.01為篩選標(biāo)準(zhǔn)共獲得79條KEGG通路，其中主要涉及細(xì)胞增殖、氧化應(yīng)激、激素調(diào)節(jié)等，選擇關(guān)聯(lián)性最高的20條繪制氣泡圖，圖中通路富集的靶點(diǎn)數(shù)量越多氣泡越大，P值越小氣泡顏色越紅(見圖5)。同時(shí)結(jié)合UC的疾病特點(diǎn)可知，YKG對(duì)UC的治療作用主要與磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidyl inositol 3 kinase, PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia-inducible factor-1, HIF-1)信號(hào)通路有關(guān)。

圖5 愈潰涼血顆粒(YKG)-潰瘍性結(jié)腸炎(UC)的靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析

3 討論

YKG是參照中醫(yī)治療“下利”經(jīng)典名方組成思路并結(jié)合藥物現(xiàn)代藥理學(xué)分析組方而成，方中白頭翁為君藥，味苦而能清熱，性寒而能涼血，入大腸經(jīng)而能止痢疾，《藥性論》中謂其可止腹痛及赤毒痢，現(xiàn)代用之于UC之黏液膿血便甚效。方中黃連、黃柏、黃芩、秦皮同為苦寒之藥走氣分，合而用之在清熱的基礎(chǔ)上燥濕濁厚腸道。由于UC的活動(dòng)期見大量血便，故予之地榆、白及，二者皆為收斂之品，可斂瘡又可斂泄痢而生?。粸趺吠枋侵委熦赎幉≈鞣?，其基本病機(jī)為“上熱下寒、寒熱錯(cuò)雜”，方中重用烏梅厥陰之陰，兼以酸斂止痢，烏梅丸原方熱性藥物太多，考慮UC主要病理因素為濕熱之毒所主，所以化裁后用炮姜取其味苦而性辛溫陽，可溫中止瀉，又可止血?。蝗夤鹉芤裏o根之火以歸元，通一身之上下，性熱而能散寒止痛，《普濟(jì)方》中謂其可治下痢赤白而腹痛不能食；黃芪升提下利之氣，而防止大劑量清熱之品耗傷中氣；白芍為緩急而止痛的要藥，用之以緩解腹痛且能斂陰養(yǎng)血和營(yíng)，白芍、甘草與黃芩配伍，取止痢名方黃芩湯之意專治血痢。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究表明，YKG中含有丁子香萜、槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇等化合物187個(gè)。YKG防治UC的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)有TP53、JUN、PTGS2、TNF、MMP2、EGFR、IL-2等90個(gè)，其中TP53的陽性表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[13，14]。UC是結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)的高危因素。多項(xiàng)研究對(duì)UC結(jié)腸黏膜組織進(jìn)行免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，P53蛋白呈陽性表達(dá)[15，16]。一項(xiàng)大樣本的研究結(jié)果表明，患有CRC的UC患者中P53蛋白表達(dá)顯著高于有不典型增生UC患者，P53的表達(dá)與UC-CRC的癌變以及不典型增生的UC的發(fā)展密切相關(guān)。JUN是具有多種細(xì)胞因子和趨化因子的多能轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)UC的炎癥狀態(tài)的調(diào)控具有重要作用[17]。由于UC的長(zhǎng)期上皮潰瘍可導(dǎo)致CRC的發(fā)生，故UC患者可表現(xiàn)出P53與JUN的水平變化。PTGS2與潰瘍形成、炎性狀態(tài)密切相關(guān)，PTGS2的表達(dá)是由細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的，在UC的炎癥過程中被上調(diào)，且PTGS2激活會(huì)產(chǎn)生前列腺素E2，其作用于許多細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑，包括細(xì)胞增殖、血管生成、凋亡、侵襲和免疫抑制等[18-20]。TNF是一種機(jī)體內(nèi)極重要的多效性細(xì)胞因子，其中TNF-α是TNF家族的多向性的促炎性細(xì)胞因子，與本研究的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)IL-6、IL-1β在UC中均存在高表達(dá)[22-24]。MMP2在細(xì)胞外基質(zhì)降解和蛋白水解酶破壞中起重要作用，能夠影響結(jié)腸黏膜細(xì)胞之間的連接，增加腸黏膜通透性并加重黏膜屏障功能的損害[25-27]，因此有效控制MMP2的表達(dá)對(duì)于UC的治療很重要。EGFR對(duì)結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞具有生長(zhǎng)、防御、損傷修復(fù)的作用[28]，學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)UC結(jié)腸黏膜上皮EGFR的表達(dá)水平與炎癥程度呈負(fù)相關(guān)，且上皮EGFR表達(dá)的降低能夠加速潰瘍的進(jìn)展[29]。

GO富集分析顯示，YKG治療UC的作用主要與細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、基因表達(dá)的調(diào)控、信號(hào)傳導(dǎo)、氧化還原等生物學(xué)過程有關(guān)；分子功能方面，與蛋白結(jié)合、蛋白質(zhì)同源二聚活性等方面。

KEGG通路富集分析表明，PI3K-Akt信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路是YKG治療UC的主要通路，其中PI3K/Akt信號(hào)通路是與細(xì)胞增殖、炎癥發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的通路[30]，UC患者可通過阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路來治療[31]。YKG治療UC的90個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)中有13個(gè)靶點(diǎn)與TNF信號(hào)通路有關(guān)，TNF家族中包括30種活性因子，如TNF-α，TNF-α與預(yù)測(cè)靶點(diǎn)中的IL-2、IL-1β、IL-6都是調(diào)節(jié)炎癥發(fā)生進(jìn)展的重要細(xì)胞因子，而UC的遷延不愈與此類細(xì)胞因子之間的穩(wěn)態(tài)失衡密切相關(guān)[32-34]。HIF-1通路涉及組織缺氧的疾病狀態(tài)(炎性、缺血性和腫瘤性疾病)[35]，學(xué)者通過研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1通路不僅能對(duì)UC的炎癥狀態(tài)引起的缺氧做出反應(yīng)，而且對(duì)缺氧的敏感性還可通過PHD1的炎癥依賴性轉(zhuǎn)錄來調(diào)節(jié)，炎癥還可促進(jìn)組織中的保護(hù)性HIF-1反應(yīng)激活[35]。NOD樣受體(NOD-like receptor, NLRs)是由適應(yīng)性和先天免疫細(xì)胞共同表達(dá)的細(xì)胞質(zhì)受體，稱為炎性小體，負(fù)責(zé)釋放成熟的IL-1β和IL-18，NLRs也參與細(xì)菌成分的識(shí)別和形成腸道菌群，在UC腸道菌群穩(wěn)態(tài)中起保護(hù)作用[36，37]。

故本文以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為研究手段，發(fā)現(xiàn)YKG對(duì)UC的干預(yù)機(jī)制涉及多個(gè)化合物、作用靶點(diǎn)、通路，研究結(jié)果初步闡明了YKG治療UC的作用機(jī)制，與目前國(guó)內(nèi)外的研究結(jié)果基本一致，證明網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法的科學(xué)性與可靠性，為進(jìn)一步臨床及實(shí)驗(yàn)研究提供了證據(jù)。