錢石兵 ，孟明耀 ，于鴻濱 ，段開文 ，李昌全 ，夏志剛

（1）昆明醫(yī)科大學附屬延安醫(yī)院 口腔科，云南 昆明 650051;2）中心實驗室，云南 昆明 650051）

根尖牙乳頭干細胞（stem cells from apical papilla，SCAPs）源自于根尖孔尚未閉合的恒牙牙根末端軟組織，被發(fā)現(xiàn)含有一群大量未分化的細胞并且證實屬于間充質干細胞來源，因為hSCAPs 同樣能夠自體更新、增殖以及多系分化。而且被視作是口腔再生醫(yī)學療法更具前景和優(yōu)勢的一類牙源性干細胞[1-4]。三七是一味傳統(tǒng)中藥，主要成分為三七總皂苷（Panax notoginseng saponins，PNS），臨床上可治療全身系統(tǒng)的多種疾病。多年來研究發(fā)現(xiàn)PNS 具有抗癌、降脂、保護神經(jīng)元與內(nèi)皮細胞、促進骨損傷修復以及抗纖維化等作用，而且PNS 對多種細胞的增殖都有積極的作用[5-7]。但關于PNS 對hSCAPs 增殖的影響尚未見報道。因此，設計本實驗初步探究PNS 對hSCAPs 增殖的影響，進一步拓展PNS 的藥用價值，以期為hSCAPs 治療口腔硬組織缺損疾病等提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

0.25 %胰蛋白酶（BI，德國）；磷酸鹽緩沖液（PBS，索萊寶）；α-MEM 培養(yǎng)基（Gibco，美國）；胎牛血清（BI，德國）；CCK-8（Proteintech，美國）；Human MSC Analysis Kit（BD，美 國）；Human MesenCult? Osteogenic Differentiation Kit（Stemcell，加拿大）；Human MesenCult? Adipogenic Differentiation Kit（Stemcell，加拿大）；三七總皂苷（索萊寶）；茜素紅（索萊寶）；油紅O（索萊寶）；細胞周期和細胞凋亡檢測試劑盒（碧云天）；酶聯(lián)免疫檢測儀（Thermo，美國）；流氏細胞儀（BD，美國）。

1.2 hSCAPs 的分離、培養(yǎng)及鑒定

經(jīng)昆明醫(yī)科大學附屬延安醫(yī)院倫理委員會審批通過，患者監(jiān)護人簽字同意，在口腔外科收集新鮮拔除、無牙體牙髓及牙周疾病且根尖未發(fā)育完全的第3 磨牙。迅速用含2%雙抗的α-MEM培養(yǎng)基保存放入冰盒中，隨即在細胞工作間中處理標本。用含2%雙抗PBS 沖洗徹底清除血凝塊并刮除根面軟組織，切取根尖牙乳頭放入培養(yǎng)皿中，眼科剪和鑷子配合下將組織剪成微小的組織塊，分散組織塊倒置放入37 ℃細胞培養(yǎng)箱中溫育15 min，加入含20%FBS 的培養(yǎng)基，動作輕柔勿使組織塊浮起，每3 d 換液，待細胞大量爬出后消化細胞傳代擴大培養(yǎng)。

流式細胞術鑒定：取第4 代hSCAPs 消化、離心，PBS 重懸，制備成單細胞懸液計數(shù)備用。以每管5×105個細胞數(shù)加入流式管內(nèi)，根據(jù)試劑操作說明，加入CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR、CD73、CD90、CD105 抗體，避光孵育30 min。加入鞘液清洗一遍，棄上清，然后加入200～300 μL 的鞘液上機，檢測細胞表面抗原，進行免疫表型分析。

1.3 hSCAPs 成骨、成脂向分化

取第4 代hSCAPs，每孔5×105個細胞接種于6 孔板內(nèi)，待細胞融合在80%以上時更換成骨誘導液和成脂誘導液，對照組正常培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)3 周后吸棄培養(yǎng)基并用PBS 漂洗，加入70%乙醇固定細胞2 h，PBS 洗3 遍，加入茜素紅和油紅O 染色5 min，倒置顯微鏡下觀察染色的面積大小以及顏色深淺。

1.4 CCK-8 檢測不同濃度PNS 對hSCAPs 增殖能力的影響

將10 mg PNS 溶于10 mL 完全培養(yǎng)基配制濃度為1 mg/mL 的PNS 母液，將培養(yǎng)基稀釋為25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L，未 加PNS 為空白對照組。取第3 代細胞按每孔2 000 個細胞數(shù)接種于96 孔板，每組設置6 個復孔，α-MEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)5 h，待細胞基本貼壁后，實驗組更換含不同濃度的PNS 培養(yǎng)液，對照組正常培養(yǎng)，2 d 換液。在第l、3、5、7 天固定時間取出一板細胞，PBS 漂洗兩次，CCK-8 液與培養(yǎng)基按照1∶9 配制，每孔加入100 μL 孵育液，37 ℃避光孵育2 h，酶標儀450 nm 波長下檢測OD 值，繪制hSCAPs 的增殖曲線。

1.5 最適濃度下檢測PNS 對細胞周期的影響

標準條件下用6 孔板培養(yǎng)對照組和25 mg/L組，第4 天時用胰酶消化細胞并收集到離心管內(nèi)，1 000 g 離心5 min 后棄液，加入1 mL 預冷的PBS 混勻細胞后轉移至1.5 mL 離心管。第2 次離心棄液，加入1 mL 預冷的70%乙醇混勻細胞，4 ℃條件下充分固定12 h。第3 次離心棄液，加入1 mL 預冷的PBS 重懸細胞。最后一次離心，棄上清。按照試劑盒操作流程配制碘化丙啶染色液，每管加入0.5 mL 碘化丙啶染色液，緩慢吹打充分混勻轉移至流式管中。37 ℃避光溫浴30 min 后上機檢測，488 nm 激發(fā)波長處檢測紅色熒光。流式圖采用modfit 軟件分析。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 hSCAPs 的培養(yǎng)及多向分化能力鑒定

根尖牙乳頭組織采用組織塊法貼壁培養(yǎng)5 d后鏡下可見類成纖維樣的細胞沿著組織塊邊緣呈放射狀爬出（圖1A），傳代后細胞生長速度加快（圖1B）。細胞連續(xù)誘導成骨3 周后茜素紅染色后可見大量明顯紅色的顆粒（圖1C），對照組則無紅色的顆粒（圖1D）。細胞向成脂誘導3 周后油紅O染色后可見有脂滴被染紅（圖1E），對照組則未見染紅的脂滴（圖1F）。表明hSCAPs 具有多向分化潛能，屬于間充質干細胞來源。

圖1 hSCAPs 的培養(yǎng)及多向分化能力鑒定Fig.1 Culture of hSCAPs and identification of multi-directional differentiation ability

2.2 hSCAPs 表面標記物的檢測

流式細胞術檢測顯示間充質干細胞表面標志物CD73 占99.03%，CD90 占99.94%、CD105 占99.47%，均呈陽性高表達，而造血細胞標記物CD34、CD45 以及免疫細胞表面標記物CD19、CD11b、HLA-DR 則呈陰性（0.77%），證明屬于間充質干細胞家族，排除造血來源的干細胞（圖2）。

圖2 hSCAPs 流式細胞鑒定結果Fig.2 Identification of hSCAPs surface antigen by flow cytometry

2.3 PNS 對hSCAPs 增殖的影響

圖3 不同濃度PNS 下hSCAPs 的生長曲線Fig.3 The growth curve of hSCAPs under different concentrations of PNS

表1 不同濃度PNS 下hSCAPs 增殖的差異Tab.1 Differences in HSCAPS proliferation under different concentrations of PNS

2.4 PNS 對hSCAPs 周期的影響

25 mg/L 組的細胞和空白對照組進行的細胞增殖指數(shù)（proliferation Index，PI）分析。PI=G2/M+S，對照組PI=5.82%+5.43%=11.25%（圖4），25 mg/L 組PI=12.17%+3.46%=15.63%（圖5），且P＜ 0.05，差異有統(tǒng)計學意義，見圖6。進一步證明25 mg/L 的PNS 顯著促進hSCAPs 的增殖。

圖4 對照組細胞周期分布Fig.4 Cell cycle distribution of control group

圖5 25 mg/L 組細胞周期分布Fig.5 Cell cycle distribution of 25 mg/L group

圖6 細胞增殖指數(shù)差異Fig.6 Difference in cell proliferation index

3 討論

口腔門診中存在著大量頜面骨組織缺損的患者，對患者的生理功能和美觀功能影響極大，甚至危害全身生理健康和心理健康[8]。目前臨床主流的診療手段難以完美恢復缺損組織的生理功能。組織工程以間充質干細胞為中心要素，其研究和發(fā)展正方興未艾，是一種新興的治療手段。hSCAPs 屬較晚發(fā)現(xiàn)的牙源性干細胞，其增殖速度快、分化能力強且在不同的誘導分化條件下能夠向成骨細胞、成牙本質細胞、神經(jīng)細胞、脂肪細胞、軟骨細胞和肝細胞等分化[1,3]。課題組自行分離培養(yǎng)的原代細胞經(jīng)過流式細胞檢測以及多向分化能力鑒定，具有間充質干細胞的生物學特性，而且增殖和分化能力強，可作為種子細胞進行后續(xù)實驗。有報道稱hSCAPs 的增殖速率、遷移能力和多向分化能力較同一牙齒來源的牙髓干細胞（dental pulp stem cells，DPSCs）和牙周膜干細胞明顯更強，hSCAPs 抵抗感染的能力更強，還能夠保留一部分活性[9-10]。因此，hSCAPs 可作為頜面骨缺損骨組織再生治療具有巨大潛力的干細胞。

干細胞治療領域的文獻表明，單純將干細胞移植到損傷組織中，由于移植細胞的存活能力差，再生活性降低，治療效果較差。因此提高移植干細胞的細胞活力、分化和治療效果是一個棘手的問題[11-12]。PNS 被廣泛應用于臨床，在心腦血管疾病、骨關節(jié)疾病上具有良好的療效，研究發(fā)現(xiàn)PNS 可以對多種干細胞的增殖起到積極的作用。PNS 在適宜濃度下能夠促進大鼠BMSCs 的增殖，同時VEGFmRNA 的表達和分泌升高[13]。另外，PNS 還可以上調VEGF、bFGF、VE-鈣粘蛋白、WNT3a、β-連環(huán)蛋白和 TCF4 mRNA 的表達，促進內(nèi)皮祖細胞增殖和血管形成[14]。同時，PNS 還可以上調抗凋亡基因Bcl-2 和Bcl-xl 的表達，降低 Bax/Bcl-2 比值，從而抑制大鼠BMSCs 的凋亡[15]。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)在第1 天時三七總皂苷對于hSCAPs 的增殖均顯示具有一定的抑制作用，說明hSCAPs 對外源性的物質需要一個適應的過程。而從第3 天開始25 mg/L 和50 mg/L 2 組對于hSCAPs 均有明顯的促進作用，呈指數(shù)生長，第5天以后生長逐漸達到平臺期，第7 天以后又開始進入下個增殖周期。但25 mg/L 組的促進增殖作用更加明顯。而在100 mg/L 組和200 mg/L 組則發(fā)現(xiàn)在3 d 內(nèi)細胞數(shù)目有增多，而在3 d 以后細胞的增殖被抑制，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細胞數(shù)目逐漸變少，時間越長則死亡的細胞越多，說明高濃度的PNS不僅抑制細胞增殖，更可以促進細胞的死亡。

細胞周期是一次細胞分裂的完整歷程，包括細胞間期（G0 期、G1 期、S 期、G2 期）和細胞分裂期（M 期）[16]。由于G0 和G1 期時DNA 含量均保持二倍體狀態(tài)，所以G0 與G1 期難以區(qū)分。S期是整個細胞周期中功能最為活躍的階段，DNA開始合成含量增加，處于G1 期和G2 期的過渡階段，還有合成DNA 所需要的各種蛋白和酶參與到此階段。G2 期是DNA 合成后期，介于S 期和M期的之間，G2 期與M 期DNA 均是四倍體狀態(tài)，因此無法在DNA 含量上直接區(qū)分。G1 到S 和G2到M 是最為重要的兩個階段，因其DNA 含量變化，所以S 期和G2/M 期也被視作細胞增殖的標志[17]。因為此時分子水平變化非?；钴S且復雜，外界環(huán)境條件的改變非常容易影響細胞的增殖狀態(tài)，若能夠給與適當?shù)母深A措施，則對于調控細胞的生長與增殖周期具有非常積極的生理意義[18-19]。經(jīng)流式細胞分析后顯示，25 mg/L 組處于S 期和G2/M 期的細胞數(shù)占比明顯高于對照組，進一步說明PNS 濃度為25 mg/L 時可以顯著促進細胞增殖的生長，三七作為常見且經(jīng)濟的藥物，其藥理作用對于組織工程具有積極的意義。

綜上所述，hSCAPs 作為一類生長能力強的干細胞，狀態(tài)可能更為接近原始干細胞，相對脆弱，對于PNS 具有很高的敏感性，即25 mg/L 的濃度即可以顯著促進hSCAPs 的增殖和分化。三七作為一種已經(jīng)成熟使用的藥物，安全性得以保證，hSCAPs 作為良好的種子細胞顯示出很大的臨床應用前景。但是本實驗僅是初步探明了PNS 對hSCAPs 具有顯著的促進增殖作用，對于其具體的機制以及對細胞凋亡的影響需要進一步探究。