徐沖沖 ，王 上 ，魏 巍 ，張 檸 ，黎 寬 ，連心情 ，王詩旭 ，周雪梅 ，盧曉筱 ，鐘樹榮

（1）昆明醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500;2）北京市公安局法醫(yī)中心，北京 100192;3）北京通達(dá)首誠司法鑒定，北京 100089;4）昆明醫(yī)科大學(xué)司法鑒定中心，云南 昆明 650500）

短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat，STR）也稱微衛(wèi)星DNA 或簡單串聯(lián)重復(fù)序列，是由2～6 bp 串聯(lián)重復(fù)單位組成的DNA 片段，約占人類基因組的5%，其中大部分位于非編碼區(qū)[1]。STR 基因座具有遺傳多態(tài)性高等特點，是法醫(yī)DNA 分型的主流遺傳標(biāo)記。目前已開發(fā)了多種包含不同STR 基因座的復(fù)合擴增體系，極大地促進(jìn)了STR 遺傳標(biāo)記在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用[2-3]。

苗族是云南省少數(shù)民族中人口較多的民族之一。根據(jù)《2021 年云南統(tǒng)計年鑒》[4]，2020 年云南省苗族總?cè)丝跒?25.36 萬人，占云南少數(shù)民族總?cè)丝诘?.02%，主要分布在文山、紅河等地區(qū)（http://stats.yn.gov.cn）。文山紅河地區(qū)位于我國西南邊陲云南省東南部，其東鄰廣西壯族自治區(qū)百色市，西臨玉溪和普洱地區(qū)，北接昆明和曲靖市，南部與越南接壤。文山紅河地區(qū)苗族人群極具跨境民族特色，有著獨特的群體遺傳結(jié)構(gòu)特征，與其他群體間存在復(fù)雜的關(guān)聯(lián)，因此研究其遺傳多態(tài)性對該地區(qū)苗族人群的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用和群體遺傳學(xué)研究具有重要意義。本研究采用PowerPlex?21試劑盒對文山紅河地區(qū)苗族人群2 209 例無關(guān)個體20 個常染色體STR 基因座的遺傳多態(tài)性進(jìn)行調(diào)查，旨在了解該地區(qū)苗族群體的遺傳背景和遺傳結(jié)構(gòu)，為法醫(yī)DNA 分析和群體遺傳研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

根據(jù)知情同意原則，收集云南省文山壯族苗族自治州和紅河哈尼族彝族自治州2 209 例無關(guān)健康苗族個體的口腔拭子或血樣。

1.2 DNA 提取、PCR 擴增和STR 分型

采用Chelex-100 法提取樣本DNA，并置于-20 ℃冰箱保存。采用PowerPlex?21 System 試劑盒（Promega 公司，美國），并使用ABIVeriti?PCR 儀（AB 公司，美國）對20 個常染色體STR 基因座（D3S1358、D1S1656、D6S1043、D13S317、Penta E、D16S539、D18S51、D2S1338、CSF1PO、Penta D、TH01、vWA、D21S11、D7S820、D5S818、TPOX、D8S1179、D12S391、D19S433和FGA）進(jìn)行復(fù)合擴增。每批次待測樣本以標(biāo)準(zhǔn)品2800M 作為質(zhì)控的陽性對照，ddH2O 作為陰性對照。用Applied Biosystems?3130 遺傳分析儀（AB 公司，美國）對PCR 擴增產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳分離，采用GeneMapper? ID v3.2 軟件（AB 公司，美國）進(jìn)行基因分型。STR 分型和命名遵循國際法庭科學(xué)遺傳學(xué)會（ISFG）的命名原則。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

使用Modified-Powerstats 軟件計算20 個常染色體STR 基因座的等位基因頻率（allele frequency，AF）、隨機匹配概率（matching probability，Pm）、觀測值雜合度（observed heterozygosity，Ho）、多態(tài)性信息含量（polymorphism information content，PIC）、個體識別概率（discrimination power，DP）、非父排除概率（probability of exclusion，PE）、親權(quán)指數(shù)（paternity index，PI）等法醫(yī)學(xué)參數(shù)，并對各基因座進(jìn)行 Hardy-Weinberg 平衡檢驗，采用Bonferroni 多重校正，以P＜ 0.002 5 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。計算累積個人識別概率（cumulative discrimination power，CDP）和累積非父排除率（cumulative probability of exclusion，CPE）。使用Arlequin v3.5 軟件[5]計算文山紅河地區(qū)苗族與24個已發(fā)表群體[6-29]的遺傳分化指數(shù)（Fst）和P值，經(jīng)Bonferroni 多重校正，P＜ 0.003 3 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。使用Phylip 3.69 軟件包計算Nei's 標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離（http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.html）。基于Nei's 遺傳距離，使用Mega 7.0 軟件[29]構(gòu)建25 個群體的相鄰連接（neighboringjoining，N-J）系統(tǒng)發(fā)育樹，并采用SPSS v24.0 統(tǒng)計軟件（IBM 公司，美國）進(jìn)行多維尺度（multidimensional scaling，MDS）分析。

2 結(jié)果

2.1 等位基因頻率及法醫(yī)學(xué)參數(shù)

文山紅河地區(qū)苗族2 209 例無關(guān)個體20 個常染色體STR 基因座的等位基因頻率及法醫(yī)學(xué)參數(shù)見表1 和表2。共檢出265 個等位基因和1 080 種基因型，等位基因頻率分布范圍為0.000 2～ 0.571 8（D13S317），各基因座等位基因數(shù)目為7（D3S1358）～25（FGA）。對20 個STR 基因座進(jìn)行Hardy-Weinberg 平衡檢驗，經(jīng)Bonferroni 校正，各基因座等位基因頻率和基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg 平衡定律（P＞ 0.05/20=0.002 5）。20 個STR 基因座的法醫(yī)學(xué)參數(shù)如下：Pm 和Ho值的范圍分別為0.013 2（Penta E）～0.232 2（TPOX）和0.571 1（TPOX）～0.903 1（Penta E），PIC 值的范圍為0.521 1（TPOX）～0.910 8（Penta E）。DP 值的范圍為0.767 8（TPOX）～0.986 8（Penta E），CDP值為0.999 999 999 999 999 999 999 932 674 151。PE 值的范圍為0.257 6（TPOX）～0.801 8（Penta E），計算該分型系統(tǒng)的CPE 值達(dá)0.999 999 935 545 335。

表1 文山紅河地區(qū)苗族群體20 個STR 等位基因頻率分布（n=2 209）（1）Tab.1 Allele frequency distribution of 20 STR loci in Miao population from Wenshan and Honghe regions（n=2 209）（1）

表1 文山紅河地區(qū)苗族群體20 個STR 等位基因頻率分布（n=2 209）（2）Tab.1 Allele frequency distribution of 20 STR loci in Miao population from Wenshan and Honghe regions（n=2 209）（2）

表2 文山紅河地區(qū)苗族人群20 個STR 基因座法醫(yī)學(xué)參數(shù)（n=2 209）Tab.2 Forensic parameters for 20 STR loci in Miao population from Wenshan and Honghe regions（n=2 209）

2.2 遺傳關(guān)系分析

文山紅河苗族和24 個其他群體的Fst 值和P值見表3。經(jīng)Bonferroni 校正（P＜ 0.05/15≈0.003 3），文山紅河苗族與新疆喀什維吾爾族、云南佤族、越南京族、印度安得拉人、廣西侗族、西藏昌都藏族、長春漢族、廣東梅州客家人、云南哈尼族、新疆阿勒泰漢族、山東濟寧漢族、重慶漢族和新疆伊犁維吾爾族之間有統(tǒng)計學(xué)差異的基因座數(shù)目最多，有15 個；其次為海南黎族、廣東漢族、愛沙尼亞人、云南漢族和四川漢族，有14 個；與新疆維吾爾族、貴州仡佬族、重慶萬州漢族和云南布朗族在13 個基因座上存在差異；與北意大利人和云南越南人群的差異基因座數(shù)目分別為5 個和4 個。

表3 文山紅河苗族與24 個參考群體的Fst 值和P 值（1）Tab.3 Pairwise Fst and P values between Wenshan and Honghe Miao and 24 reference populations（1）

表3 文山紅河苗族與24 個參考群體的Fst 值和P 值（2）Tab.3 Pairwise Fst and P values between Wenshan and Honghe Miao and 24 reference populations（2）

表3 文山紅河苗族與24 個參考群體的Fst 值和P 值（3）Tab.3 Pairwise Fst and P values between Wenshan and Honghe Miao and 24 reference populations（3）

根據(jù)本研究群體與24 個已報道人群的群體數(shù)據(jù)計算得到Nei's 標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離矩陣，見表4。其中，文山紅河苗族與云南越南人群的遺傳距離最小（0.026 537），與愛沙尼亞人群的遺傳距離最大（0.904 458）。通過構(gòu)建NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)一步剖析這些群體的遺傳關(guān)系，結(jié)果顯示文山紅河苗族與云南越南人群聚為一支，見圖1。基于Nei's 遺傳距離進(jìn)行MDS 分析，同樣觀察到文山紅河苗族與云南越南人群相距較近，而與愛沙尼亞人群相距較遠(yuǎn)。此外，不同地區(qū)的漢族和維吾爾族分別聚為一簇，見圖2。

圖1 基于Nei’s 遺傳距離構(gòu)建的文山紅河苗族與24 個參考群體的NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 The phylogenetic tree based on Nei’ s genetic distances between Wenshan and Honghe Miao and 24 reference populations

圖2 基于Nei’s 遺傳距離對文山紅河苗族與24 個參考群體的MDS 分析Fig.2 Multidimensional Scaling（MDS）analysis based on Nei’ s genetic distances between Wenshan and Honghe Miao and 24 reference populations

表4 文山紅河苗族與24 個參考群體的Nei's 遺傳距離Tab.4 Nei’s standard genetic distances between Wenshan and Honghe Miao and 24 reference populations

3 討論

本研究報告了文山紅河地區(qū)苗族人群20 個常染色體STR 基因座的等位基因頻率和相關(guān)法醫(yī)學(xué)參數(shù)，評估了PowerPlex?21 系統(tǒng)在該人群中的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價值。PowerPlex?21 分型系統(tǒng)是一種廣泛使用的商業(yè)試劑盒，該試劑盒包含DNA 聯(lián)合索引系統(tǒng)（CODIS）推薦的17 個位點，還增加了Penta E，D6S1043和Penta D基因座。DP 和PE 值反映STR 分型系統(tǒng)在個體識別和親權(quán)鑒定中的能力，一般認(rèn)為DP ＞ 0.80、PE ＞ 0.50 的基因座具有高鑒別能力。本研究中，Penta E，D6S1043和Penta D3 個基因座的DP 和PE 值分別為0.986 8，0.971 1，0.932 7 和0.801 8，0.715 7，0.585 5，可見這些基因座屬于高度多態(tài)性。在所有20 個基因座中，Penta E的Pm 值最小，DP、PIC、PE、Ho 值最大。分析國內(nèi)外其他群體發(fā)現(xiàn)，該基因座具有極高的鑒別力和多態(tài)性，法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價值較高[6-11]。本研究群體在20 個STR 基因座的CDP和CPE 分別高達(dá)0.999 999 999 999 999 999 999 932 674 151 和0.999 999 935 545 335，這表明PowerPlex?21 復(fù)合擴增體系在文山紅河苗族人群中具有極高的系統(tǒng)效能，可用于該地區(qū)苗族人群的個體識別和親權(quán)鑒定。

遺傳距離是表征群體間遺傳異質(zhì)性或遺傳分化的重要指標(biāo)，本研究通過計算群體間遺傳分化指數(shù)Fst 值和Nei's 遺傳距離，構(gòu)建N-J 系統(tǒng)發(fā)育樹和MDS 分析，探索了文山紅河苗族人群與其他24 個群體之間的遺傳關(guān)系。結(jié)果表明文山紅河地區(qū)苗族與云南越南人群的親緣關(guān)系較近。文山紅河地區(qū)的馬關(guān)、金平、屏邊、河口等縣與越南北部的河江、老街、萊州等?。ㄊ校┙尤?。在邊境線上跨界而居的民族很多，包括文山紅河地區(qū)的苗、彝、壯等民族，以及越南北部的越（京）、赫蒙（苗）等民族[29]。由于長期跨界而居，中越邊境民族互相通婚，彼此形成了“民族共宗，文化同源，江河同流”等特點[29]。這可能是文山紅河苗族與云南越南人群親緣關(guān)系較近的原因之一。方玲等[30]分析了不同民族線粒體DNA 中9 bp 重復(fù)序列的缺失頻率，結(jié)果表明中國南方苗族人群與越南人群在遺傳上有較為密切的關(guān)系，本研究從常染色體STR 的角度驗證了前人的研究結(jié)果。此外，不同地區(qū)的漢族群體（云南漢族、重慶漢族、四川漢族、廣東漢族、山東漢族、新疆漢族和長春漢族）以及3 個維吾爾族群體（新疆伊犁維吾爾族、新疆維吾爾族和新疆喀什維吾爾族）分別聚為一簇，彼此間遺傳關(guān)系較為密切，證明了不同地區(qū)同一民族在共同起源上的潛在關(guān)聯(lián)，說明常染色體STR 遺傳標(biāo)記在評價群體遺傳結(jié)構(gòu)和族源推斷方面具有一定作用[31-33]。

本研究報告了文山紅河地區(qū)苗族人群2 209例無關(guān)個體20 個常染色體STR 基因座的等位基因頻率及法醫(yī)學(xué)參數(shù)。結(jié)果表明，20 個常染色體STR 基因座在文山紅河苗族人群中具有較高的遺傳多態(tài)性和較好的系統(tǒng)效能，可滿足法醫(yī)學(xué)個體識別和親權(quán)鑒定，亦可為群體遺傳學(xué)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。