李佳汶 李鑫月 鄒金池 劉銘 肖馨懿 趙曦 買文麗 劉華△

（1．川北醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，四川 南充 637000；2. 川北醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系，四川 南充 637000；3. 川北醫(yī)學(xué)院機(jī)能中心，四川 南充 637000）

荷葉為睡蓮科蓮屬蓮的干燥葉，夏、秋二季采摘，是藥食兩用性植物。荷葉具有清暑化濕、升發(fā)清陽、涼血止血的功效[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究顯示，荷葉提取物具有降脂、保肝和抑菌等作用[2，3]，但荷葉提取物對小腸平滑肌的影響的研究較少。本研究用不同濃度的荷葉水煎劑灌流家兔小腸平滑肌，觀察其對小腸平滑肌收縮的影響，并探討其影響機(jī)制，為探索荷葉的藥用價(jià)值，對其進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、儀器與試劑

健康家兔20只（川北醫(yī)學(xué)院機(jī)能中心提供），體重2～2.5 kg，雌雄不限。儀器主要為恒溫平滑肌實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（四川成都泰盟科技有限公司），BL-420生物記錄系統(tǒng)（四川成都泰盟科技有限公司），荷葉（湖北金貴中藥飲片有限公司，批號(hào)：A191101），乙酰膽堿（華夏化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：2017032301），阿托品（湖北興華制藥有限公司，批號(hào)：20160303），維拉帕米（上海禾豐制藥有限公司，批號(hào)：43200101）以及多巴胺（亞邦醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)：1911011）。

1.1.2 荷葉煎劑的制備

用荷葉生藥100 g洗凈切碎，加入蒸餾水1000 mL，浸泡60 min，煮沸30 min，過濾。重復(fù)煎煮一次，過濾。將兩次濾液合并煎煮濃縮至100 mL，荷葉水煎劑的濃度為1000 g·kg-1。

1.1.3 家兔離體腸肌的制備

實(shí)驗(yàn)前家兔禁食12 h，正常飲水。用木槌擊兔頭延髓部致昏，迅速剖開腹腔，取靠近胃部約10 cm腸段置于裝有37 ℃臺(tái)式液的培養(yǎng)皿中輕輕漂洗，并將離體腸管分段，每段長1.5-2 cm。將腸段固定在恒溫平滑肌灌流槽中。

1.2 方法

1.2.1 荷葉水煎劑對小腸平滑肌收縮的影響

記錄用藥前腸管收縮波形5 min后，向恒溫灌流槽中依次加入不同劑量的荷葉水煎劑，使浴管內(nèi)臺(tái)氏液含藥量按0.2、0.4、0.6、0.8、1 g·kg-1的梯度依次增加，同一濃度分別作用于不同的腸管，重復(fù)10次，分別記錄腸管的收縮張力和頻率變化情況。

1.2.2 探究荷葉水煎劑與鈣離子通道的關(guān)系

記錄用藥前的腸管收縮波形 5 min后，向浴槽內(nèi)加入維拉帕米使浴管內(nèi)臺(tái)氏液含藥量達(dá)到5 g·kg-1，待腸管穩(wěn)定后加入0.8 g·kg-1的荷葉水煎劑，重復(fù)10次，分別記錄腸管收縮張力變化情況。

1.2.3 探究荷葉水煎劑與多巴胺受體的關(guān)系

記錄用藥前的腸管收縮波形5 min后，向浴槽內(nèi)加入多巴胺使浴管內(nèi)臺(tái)氏液含藥量達(dá)到2 g·kg-1，待腸管穩(wěn)定后加入0.8 g·kg-1的荷葉水煎劑，重復(fù)10次，分別記錄腸管收縮張力變化情況。

1.2.4 探究荷葉水煎劑與M受體的關(guān)系

記錄用藥前的腸管收縮波形5 min后，先向浴槽加入乙酰膽堿使浴管內(nèi)臺(tái)氏液含藥量達(dá)到0.5 g·kg-1，待腸管穩(wěn)定后加入阿托品5 g·kg-1，待波形穩(wěn)定后加入的荷葉水煎劑0.8 g·kg-1，重復(fù)10次，分別記錄腸管收縮張力變化情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，頻率和張力用配對樣本和t檢驗(yàn)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（± SD）表示，組間比較用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 荷葉水煎劑對小腸平滑肌收縮的影響

與正常組相比，荷葉水煎劑濃度在0.2-0.8 g·kg-1時(shí)的收縮張力均明顯增加（P＜0.05），而且隨著荷葉水煎劑濃度的增加收縮力逐漸增強(qiáng)，在濃度為0.8 g·kg-1組更為顯著（P＜0.05）；但各組收縮頻率無明顯變化（P＞0.05），見圖1、表1。

表1 不同濃度荷葉水煎劑對家兔胃腸道平滑肌收縮張力和收縮頻率的影響（SD，n=10)

表1 不同濃度荷葉水煎劑對家兔胃腸道平滑肌收縮張力和收縮頻率的影響（SD，n=10)

注：與正常組比較，*P＜0.05。

荷葉水煎劑濃度(g·kg-1) 用藥后收縮張力(g) 用藥后收縮頻率(Hz) 正常組(0) 1.87±0.19 0.18±0.43 0.1 1.95±0.24 0.21±0.41 0.2 2.07±0.28* 0.20±0.39 0.4 2.15±0.25* 0.18±0.50 0.6 2.24±0.27* 0.19±0.50 0.8 2.33±0.26* 0.21±0.37

圖1 代表性小腸平滑肌收縮波形圖

2.2 荷葉水煎劑與鈣離子通道的關(guān)系

與干預(yù)前相比，維拉帕米組的收縮張力明顯降低（P＜0.01）；而與維拉帕米組相比，維拉帕米+荷葉水煎劑組的收縮張力無明顯變化（P＞0.05），見圖2、表2。

表2 對家兔小腸平滑肌依次加入維拉帕米和荷葉水煎劑后其平均收縮力的變化（±SD，n=10）

表2 對家兔小腸平滑肌依次加入維拉帕米和荷葉水煎劑后其平均收縮力的變化（±SD，n=10）

注：與正常組組比較，#P＜0.01。

分組 收縮張力(g)正常組3.02±1.00維拉帕米1.85±0.67# 維拉帕米+荷葉水煎劑1.78±0.63#

圖2 代表性與鈣離子通道關(guān)系收縮波形圖

2.3 荷葉水煎劑與多巴胺受體的關(guān)系

與正常組相比，多巴胺組的收縮張力明顯降低（P＜0.01）；而與多巴胺組相比，多巴胺+荷葉水煎劑組的收縮張力無明顯變化，見圖3、表3。

表3 對家兔小腸平滑肌依次加入多巴胺和荷葉水煎劑后其平均收縮力的變化（X±SD，n=10)

圖3 代表性與多巴胺受體關(guān)系收縮波形圖

2.4 荷葉水煎劑與M受體的關(guān)系

與正常組相比，乙酰膽堿組的收縮張力升高（P＜0.01）；與乙酰膽堿組相比，乙酰膽堿+阿托品組的收縮張力降低（P＜0.01）；而與乙酰膽堿+阿托品組相比，乙酰膽堿+阿托品+荷葉水煎劑組的收縮張力明顯升高（P＜0.01），見圖4、表4。

圖4 代表性與M受體關(guān)系收縮波形圖

表4 對家兔小腸平滑肌依次加入乙酰膽堿、阿托品和荷葉水煎劑后其平均收縮力的變化（SD，n=10)

表4 對家兔小腸平滑肌依次加入乙酰膽堿、阿托品和荷葉水煎劑后其平均收縮力的變化（SD，n=10)

注：相鄰組間組比較，#P＜0.01。

分組 收縮張力(g)正常組1.74±0.39 乙酰膽堿4.17±1.49# 乙酰膽堿+阿托品1.19±0.46# 乙酰膽堿+阿托品+荷葉水煎劑1.52±0.41#

3 討論

荷葉是我國傳統(tǒng)的一種養(yǎng)生保健食材，其主要化學(xué)成分為荷葉生物堿、荷葉苷、揮發(fā)油、多糖以及有機(jī)酸[4，5]，但荷葉對消化道的作用的相關(guān)研究較少。本研究通過不同濃度的荷葉水煎劑灌流家兔離體小腸平滑肌發(fā)現(xiàn)，灌流濃度在0.2 g·kg-1-0.8g·kg-1范圍內(nèi)，小腸平滑肌的收縮力增強(qiáng)，并有劑量依賴性，而收縮節(jié)律無明顯變化。

Cajal間質(zhì)細(xì)胞（Interstilial cell of Cajal，ICC）是胃腸運(yùn)動(dòng)的起搏細(xì)胞。目前認(rèn)為，當(dāng)ICC內(nèi)Ca2+濃度升高可激活細(xì)胞膜上鈣激活的氯通道，Cl-外流，膜電位去極化，形成慢波電位[6，7]。慢波電位引起平滑肌電壓門控性鈣通道開放，Ca2+內(nèi)流到達(dá)閾電位，引發(fā)動(dòng)作電位，導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞收縮。并且慢波的頻率和數(shù)量決定了腸平滑肌運(yùn)動(dòng)的頻率和強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)中荷葉水煎劑濃度在0.2 g·kg-1-0.8 g·kg-1時(shí)，隨著濃度的增加，小腸平滑肌的收縮能力增強(qiáng)，而頻率變化不大。說明荷葉水煎劑對ICC細(xì)胞的去極化和復(fù)極化過程影響較小，而對平滑肌的Ca2+內(nèi)流影響較大。在實(shí)驗(yàn)中，加入Ca2+通道抑制劑維拉帕米后，腸平滑肌收縮幅度出現(xiàn)明顯下降；此后加入荷葉水煎劑腸肌收縮力并無明顯升高。

由此可知，荷葉水煎劑并不能改善鈣通道抑制劑維拉帕米對平滑肌活動(dòng)的抑制作用，說明荷葉水煎劑對鈣通道并無直接的興奮作用。多巴胺（Dopamine，DA）可以調(diào)節(jié)腸道運(yùn)動(dòng)。Auteri 等發(fā)現(xiàn)，DA和D1體結(jié)合，誘導(dǎo)腸肌運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)；而與D2受體結(jié)合，使腸肌肉松弛[8-9]。一氧化氮是消化道內(nèi)重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，通過cGMPPKG途徑使平滑肌超極化，從而抑制平滑肌的收縮活動(dòng)[10]。多巴胺可激活一氧化氮神經(jīng)元上的多巴胺受體，抑制胃腸運(yùn)動(dòng)[11]。本文研究發(fā)現(xiàn)加入多巴胺后平滑肌收縮被明顯抑制，而荷葉水煎劑對該抑制無緩解作用，說明荷葉水煎劑對一氧化氮神經(jīng)元的作用無影響。

Cajal肌內(nèi)間質(zhì)細(xì)胞（Intramuscular interstitial cells of Cajal，ICC-IM）中鈣激活的氯離子通道蛋白1（Anoctamin，Ano1）是胃腸運(yùn)動(dòng)的基礎(chǔ)。Ano1的缺失會(huì)引起Ca2+瞬變和慢波持續(xù)時(shí)間縮短，導(dǎo)致胃腸收縮減弱[12]。膽堿能神經(jīng)纖維緊貼ICC-IM，膽堿能纖維末梢釋放乙酰膽堿，可激活I(lǐng)CC-IM的M受體，引起Ano1激活，Cl-外流。Sung TS等發(fā)現(xiàn)膽堿能神經(jīng)傳遞能加強(qiáng)Ca2+瞬變[15]，表明ICCIM是膽堿能神經(jīng)傳遞的主要介質(zhì)。乙酰膽堿可通過激動(dòng)腸平滑肌上M受體使胞內(nèi)三磷酸肌醇和二酰基甘油濃度上升，促使Ca2+釋放和底物蛋白磷酸化，從而增加小腸平滑肌的收縮幅度、收縮力及蠕動(dòng)。阿托品為競爭性M受體阻斷藥，可阻斷乙酰膽堿與受體結(jié)合，從而拮抗其對M受體的激動(dòng)效應(yīng)。本文結(jié)果顯示加入阿托品后，家兔離體小腸平滑肌收縮力降低，再加入荷葉水煎劑后小腸平滑肌收縮力增強(qiáng)，說明荷葉水煎劑可以增強(qiáng)乙酰膽堿的作用，改善阿托品對乙酰膽堿的對抗作用；但其是否通過興奮M受體，還是通過興奮膽堿能神經(jīng)纖維發(fā)揮作用，還需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，荷葉水煎劑能增強(qiáng)家兔小腸平滑肌的運(yùn)動(dòng)，其機(jī)制主要是與乙酰膽堿對腸平滑肌上M受體作用增強(qiáng)有關(guān)。