劉守才 廖承譜 趙小超▲ 商 勛 丁美婷 吳 玲

地錦草為大戟科植物地錦或斑地錦的干燥全草，記載于歷代版《中國藥典》，具有清熱解毒、涼血止血、利濕退黃的功效?，F(xiàn)代中藥藥理研究[1-5]表明其具有抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、解毒、抗過敏、抗氧化、保肝、止血與止瀉等作用，臨床主要用于痢疾、上呼吸道感染、肺炎、病毒性肝炎、腎盂腎炎、腸炎、皮膚濕疹等疾病。地錦草的民間應(yīng)用也較為廣泛，研究小組在走訪收集民間驗(yàn)方期間發(fā)現(xiàn)有2 名類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis，RA）患者使用地錦草鮮草搗成泥外敷關(guān)節(jié)處，3～5 天換藥一次，1 個月左右關(guān)節(jié)處腫脹已經(jīng)全部消失，疼痛消失，行走自如。關(guān)于地錦草對RA 的作用研究暫無報道，故本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步探討其對RA 的作用機(jī)制，并通過分子對接模擬實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，為進(jìn)一步深入研究開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 方法

1.1 地錦草的活性成分及靶點(diǎn)的收集和篩選通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）、中藥分子作用機(jī)制的生物信息學(xué)分析工具（Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of Traditional Chinese Medicine，Batman-TCM，http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/），再結(jié)合《中國知網(wǎng)》等文獻(xiàn)檢索進(jìn)行地錦草的活性化學(xué)成分收集和靶點(diǎn)預(yù)測工作，設(shè)置條件為生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug likeness，DL）≥0.18，篩選出符合條件的活性成分。

1.2 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病靶點(diǎn)預(yù)測通過基因組注釋數(shù) 據(jù) 庫（genome annotation database platform，GeneCard，https://auth.lifemapsc.com/）、人類孟德爾遺傳 數(shù) 據(jù) 庫（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，https://www.omim.org/）、DisGeNET 數(shù) 據(jù) 庫（https://ngdc.cncb.ac.cn/databasecommons/）、藥物靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫（Therapeutic Target Database，TTD，http://db.idrblab.net/web/），關(guān)鍵詞“Rheumatic Arthritis”，獲得疾病相關(guān)靶點(diǎn)基因，利用Venny 2.1.0 軟件獲得交集靶點(diǎn)。

1.3 地錦草調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建利用cytoscape 3.7.1 軟件將藥物-疾病交集靶點(diǎn)進(jìn)行可視化處理，構(gòu)建藥物-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。

1.4 藥物-疾病靶點(diǎn)蛋白間互作網(wǎng)絡(luò)將交集靶標(biāo)基因復(fù)制到String數(shù)據(jù)庫（http：//stringdb.org/），以人為研究對象，設(shè)置條件為mendium confidence＞0.9，剔除游離的蛋白靶點(diǎn)，構(gòu)建出蛋白相互作用PPI 網(wǎng)絡(luò)。“節(jié)點(diǎn)”代表靶點(diǎn)蛋白，“邊”表示有效成分與靶點(diǎn)之間的聯(lián)系。

1.5 靶點(diǎn)功能和通路富集分析利用Bioconductor軟件，借助clusterprofiler 包、pathview包、Dose包，通過R4.4.1 軟件運(yùn)行獲得基因本體論及通路富集數(shù)據(jù)并可視化，進(jìn)行GO功能富集和KEGG通路分析，P＜0.01為篩選閾值，取校正P值前10的條目。

1.6 分子對接通過有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取小分子數(shù)據(jù)，利用openbabel 轉(zhuǎn)化為mol 2 格式，使用prepare_ligand4.py腳本為小分子添加電荷，分配原子類型，均設(shè)置為半柔性鍵，將小分子保存為pdbqt格式，便于分子對接。PDB 蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）下載蛋白受體數(shù)據(jù)，采用pymol1.7程序?qū)⑹荏w蛋白結(jié)構(gòu)中的結(jié)晶水和其他小分子刪除，并添加氫原子后保存。載入autodocktool 1.5.6程序，添加電荷，分配原子類型，保存為pdbqt 格式，作為分子對接受體，采用vina 1.1.2 軟件進(jìn)行分子對接。對接盒子大小設(shè)置為能夠恰好包含蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，選取對接最佳構(gòu)象作為分子對接結(jié)果，結(jié)合能評分并進(jìn)行排序。結(jié)合能數(shù)值越低，表明結(jié)合越好。

2 結(jié)果

2.1 地錦草的活性成分及靶點(diǎn)的收集和篩選共收集到51種活性成分，經(jīng)篩選獲得15種有效活性成分，包含4',5-二羥基黃酮、槲皮素、鞣花酸、山奈酚、紫云英苷、谷甾醇等，其中，已有研究表明槲皮素、山奈酚對RA作用良好[6-9]。活性成分對應(yīng)的作用靶點(diǎn)共篩選出102個。

2.2 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病靶點(diǎn)預(yù)測共篩選出1184個疾病靶點(diǎn)，通過Venny 軟件最終獲得38 個共同靶點(diǎn)，見圖1。

圖1 藥物-疾病靶標(biāo)圖

2.3 地錦草調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建藥物-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)包含節(jié)點(diǎn)138 個及相互聯(lián)系的邊191 條，其中表現(xiàn)活躍的成分是槲皮素、山奈酚、4',5-二羥基黃酮。見圖2。

圖2 藥物-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 藥物-疾病靶點(diǎn)蛋白間互作網(wǎng)絡(luò)PPI網(wǎng)絡(luò)圖顯示，共有67個節(jié)點(diǎn)及其相互聯(lián)系的277條邊。Degree值排名前20 位的潛在抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)為IL-6、ALB、CASP3、NOS3、PPARG等。見圖3。

圖3 藥物-疾病蛋白間互作網(wǎng)絡(luò)圖（PPI）

2.5 靶點(diǎn)功能和通路富集分析

2.5.1 GO 功能富集分析 通過GO 富集分析，篩選出53 個分子功能條目（P＜0.05），包括DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、核受體活性、核糖核酸聚合酶II 特異性脫氧核糖核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合受體配體活性、組蛋白脫乙酰酶結(jié)合、核激素受體結(jié)合等，其中多個條目均有報道與RA 關(guān)系密切[10-11]，關(guān)聯(lián)度較高的20條分子功能如圖4。

2.5.2 KEGG 通路富集分析 通過KEGG 通路富集分析將38 個核心靶點(diǎn)篩選出89 條信號通路，包括脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、流體切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、腫瘤壞死因子信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、化學(xué)致癌-受體激活、白細(xì)胞介素-17信號通路、細(xì)胞凋亡、NOD樣受體信號通路等，其中多條通路均有報道與RA 關(guān)系密切[11-12]，比較關(guān)鍵的20 條信號通路見圖5。

圖5 地錦草KEGG分析及氣泡圖

2.6 分子對接本研究通過以上綜合評比分析選擇地錦草5 種主要活性成分與5 個關(guān)鍵抗RA 靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行分子對接。如表1 所示，結(jié)合能數(shù)值越低，表明結(jié)合越好。其中，4',5-二羥基黃酮與AR 關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白結(jié)合最優(yōu)，槲皮素、山奈酚與PTGS1、AR、DPP4、HSP90AA1、RELA 關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白結(jié)合評分均較良好，結(jié)合能≤-9的強(qiáng)結(jié)合共有6組。整體結(jié)合評分均較良好，分子對接情況見圖6、圖7。

圖6 槲皮素與5個靶點(diǎn)蛋白分子對接模型圖

圖7 山奈酚與5個靶點(diǎn)蛋白分子對接模型圖

表1 分子對接結(jié)合能評分情況表（kcal/mol）

3 討論

民間資料收集發(fā)現(xiàn)，地錦草對RA 具有明顯的治療作用，兩位RA患者在使用地錦草鮮草搗泥外敷后，RA 癥狀明顯減輕，生活能力有一定的恢復(fù)。為進(jìn)一步證實(shí)其作用，本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接模擬實(shí)驗(yàn)初步探討地錦草對RA 的分子作用機(jī)制，結(jié)果顯示其對RA有一定的治療作用，主要與DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、核受體活性、泛素蛋白連接酶結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、RNA聚合酶II特異性脫氧核糖核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合受體配體活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性等分子功能有關(guān)，涉及脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、化學(xué)致癌-受體激活、流體切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、腫瘤壞死因子信號通路、白細(xì)胞介素-17信號通路、細(xì)胞凋亡、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 等眾多信號通路。

目前，關(guān)于地錦草化學(xué)成分方面的研究較為廣泛，數(shù)據(jù)文獻(xiàn)統(tǒng)計匯總為51 種，其中槲皮素、山奈酚對RA的作用研究較為全面。槲皮素是一種黃酮醇類的天然產(chǎn)物，主要通過抑制血管生成、滑膜增生、炎癥因子浸潤、中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)生成，調(diào)節(jié)破/成骨細(xì)胞和Th17/調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞之間的平衡發(fā)揮治療作用，涉及TNF-α、MCP-1、IL-6、IL-1β、IL-17、IL-10、NF-κB、CXCL1、CXCL5、LTB4、TGF-β、Th17細(xì)胞、中性粒細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞等[13-19]細(xì)胞因子。山奈酚主要通過抑制FGFR3 激酶活性、降低體內(nèi)外破骨細(xì)胞分化、抑制破骨細(xì)胞標(biāo)志物，如抗酒石酸酸性磷酸酶、整合素β3、MMP9等發(fā)揮抗RA作用[6]。另外山奈酚具有較強(qiáng)的抗炎作用，主要涉及MAPK、PKC、PI3K、IL-1、IL-8、IP-10、PGE2、IL-2、TNF-α、NF-κB、AP-1 等[20-22]因子，同時這些因子也均屬于與RA 關(guān)系密切的重要因子，因此其作用可能與調(diào)節(jié)炎癥因子水平有關(guān)。

RA 是一種常見的慢性多系統(tǒng)自身免疫性疾病，周期較長，易造成殘疾，此病可發(fā)生于任何年齡段，常見于青壯年，發(fā)病率高達(dá)0.2%～0.4%，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。其發(fā)病機(jī)制[23]主要包含：①免疫細(xì)胞感染引起炎癥局部產(chǎn)生大量的炎性細(xì)胞、ROS、炎癥因子，從而激活核因子κB、蛋白激酶B、JNK 等信號通路導(dǎo)致RA 形成；②刺激MMPs 促使MMP-2 的產(chǎn)生，導(dǎo)致軟骨、骨骼等損傷加劇RA 的發(fā)展；③氧化應(yīng)激異常；④遺傳和生存環(huán)境等因素。發(fā)病過程主要涉及PGs、IL-2、IL-6、IL-8、IFN-γ、COX-2、LTs、5-LOX、AA、LTB4、TNF-α、IL-1β、ROS、MMPs、MMP-2、NF-κB、T細(xì)胞等因子、蛋白酶、細(xì)胞[24-27]。目前抗RA 藥物主要包括非甾體消炎藥、抗風(fēng)濕藥、糖皮質(zhì)激素、TNF抑制劑、B 細(xì)胞耗竭劑、T 細(xì)胞阻斷劑、IL-6 受體單克隆抗體、IL-1受體拮抗劑、靶向小分子抑制劑等[28]藥物，均存在一定的優(yōu)缺點(diǎn)，療效好的價格昂貴，價格便宜的不良反應(yīng)多等等，尚存在不足，因此需要醫(yī)藥研究者們繼續(xù)深入開發(fā)挖掘，以造福人類。

綜上所述，地錦草活性成分、作用靶點(diǎn)、RA 疾病靶點(diǎn)基因蛋白三者存在著諸多交集與聯(lián)系，可以推斷地錦草具有一定的抗RA 作用，主要與腫瘤壞死因子信號通路、細(xì)胞凋亡、化學(xué)致癌-受體激活、白細(xì)胞介素-17信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路等有關(guān)，可為今后進(jìn)一步研究開發(fā)提供參考。