方春鳳 潘靜巧 李丹英 狄朋桃

（1.云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院/云南省中醫(yī)醫(yī)院兒科，云南 昆明 650021；2.楚雄州中醫(yī)醫(yī)院/云南省彝醫(yī)醫(yī)院兒科，云南 楚雄 675000；3.玉溪市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，云南 玉溪 653300；4.云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院/云南省中醫(yī)醫(yī)院風(fēng)濕科，云南 昆明 650021）

抽動障礙（Ticdisorder，TD），是起病于兒童和青少年時期，主要表現(xiàn)為不自主的、反復(fù)的、快速的、突發(fā)的一個或多個部位肌肉運(yùn)動抽動，伴或不伴發(fā)聲抽動的綜合征，并可伴有注意力不集中、多動、強(qiáng)迫動作和思維以及其他行為癥狀[1]。TD病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確，但諸多實(shí)驗(yàn)表明，TD發(fā)病主要與多巴胺（Dopamine，DA）、去甲腎上腺素（Nor epinepherine，NE）、腎上腺素（Epinepherine，E）等胺類物質(zhì)的改變有關(guān)[2]。在體內(nèi)E和NE及NE的前體DA通過兒茶酚-O-位甲基轉(zhuǎn)換酶（Cat echol-O-methyl transferase，COMT）及單胺氧化酶（Monoamine oxidase，MAO）的作用而滅活。孫錦華等[3]研究發(fā)現(xiàn)COMT基因Val 158met多態(tài)性與抽動障礙，尤其是共患注意缺陷多動障礙的發(fā)病有關(guān)。MAO因其代謝底物不同分為A型和B型，在紋狀體內(nèi)DA的代謝主要依靠MAO-B，而MAO-A的作用僅占20%[4]。Teo K C等[5]在研究MAO-B抑制劑治療帕金森時發(fā)現(xiàn)MAO-B可以代謝大腦中的多巴胺。可見COMT和MAO-B可通過降解E、NE、DA等胺類神經(jīng)遞質(zhì)而影響抽動障礙的發(fā)生發(fā)展。

多巴胺通過與神經(jīng)元細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體結(jié)合發(fā)揮功能。多巴胺受體（Dopamine receptor DR）根據(jù)其結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)的差異分為D1類受體（包括D1和D5受體）和D2類受體（包括D2、D3和D4受體）[6]。STEEVES T D L等[7]研究發(fā)現(xiàn)，多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞突觸后多巴胺受體D1（DRD1）親和力升高與TD發(fā)病有關(guān)。另有研究發(fā)現(xiàn)，抽動障礙患者紋狀體內(nèi)多巴胺受體D2（DRD2）的含量與內(nèi)源性多巴胺的水平呈負(fù)相關(guān)[8]。上述研究提示TD患者腦內(nèi)多巴胺受體D1表達(dá)升高，而D2受體降低。

本實(shí)驗(yàn)旨在觀察針刺治療對亞氨基二丙腈（Iminodipropionitrile，IDPN）誘導(dǎo)的抽動障礙大鼠模型腦內(nèi)COMT、MAO-B、DRD1、DRD2表達(dá)的影響，以探討針刺治療抽動障礙可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量（160±20）g，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SYXK（滇）K2013-008。實(shí)驗(yàn)在云南省高校中醫(yī)藥分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室實(shí)施，飼料和飲用水消毒后由動物自由攝取。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與藥物 總RNA提取試劑盒（上海生工生物工程有限公司，批號：B518651）；PrimeScript RT Master Mix（日本TaKaRa公司，批號：DRR036A）；SYBR Premix Ex TaqⅡ（日本TaKaRa公司，批號：DRR820A）；β-actin內(nèi)參引物（上海生工生物工程有限公司）。引物合成，上海生工生物工程有限公司。IDPN（Sigma-Aldrich中國，批號：317306）；氟哌啶醇片（寧波大紅鷹藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H33020585）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 水平電泳儀（美國BIO-RAD公司）；CTK150R型離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；Nano-600+超微量核酸蛋白檢測儀（北京眾力挽生物科技有限公司）；ABI 7900 PCR儀（美國ABI公司）；0.25 mm×13 mm針灸針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 抽動模型制備 動物購進(jìn)飼養(yǎng)于SPF級動物實(shí)驗(yàn)室，溫度（22±1）℃，濕度（55±5）%，12 h明暗循環(huán)，隨機(jī)分為4組，每組10只，分別標(biāo)注為空白組、模型組、針刺治療組和對照組。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，飼料和飲用水消毒后由動物自由攝取。模型制備當(dāng)日，除空白組外，亞氨基二丙腈（IDPN）溶解于生理鹽水，稀釋成濃度為35 mg/mL溶液，腹腔注射，劑量為350 mg/（kg·d）。

1.4.2 治療方法 針刺大鼠百會、合谷、內(nèi)關(guān)和大椎穴，平針法，與皮膚呈15°夾角進(jìn)針，每日1次，每次留針30 min，以40下/min捻針3次，每連續(xù)治療5 d，休息2 d，總療程4周。對照組予氟哌啶醇片（寧波大紅鷹藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H33020585）2 mg/d，按臨床等效劑量法換算，大鼠劑量0.67 mg/（kg·d）。氟哌啶醇片研末溶于蒸餾水灌胃給藥，模型組和空白組予等體積生理鹽水灌胃，每日1次，治療4周，治療結(jié)束后取腦組織檢測。

1.4.3 組織檢測 實(shí)驗(yàn)結(jié)束，取腦組織50～100㎎，用液氮冰凍后將組織塊研磨成粉末，再移入離心管反復(fù)震蕩、冰敷、離心。把焦碳酸二乙酯（DEPC）處理水加入離心管，使RNA溶解析出組織外，液氮保存。將提取的RNA置于核酸蛋白檢測儀中測定待檢RNA的濃度、純度（A260 nm/A280 nm在1.8～2.0之間）。取總RNA按照RT-reagent逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得cDNA，反應(yīng)體系為：Prime Script RTM aster Mix 2μL。以SYBR Green為熒光標(biāo)記物，β-actin為內(nèi)參對照。取cDNA加入聚合酶鏈反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：SYBR Premix Ex TaqⅡ 10μL，Primer F 0.3μL，Primer R 0.3μL，cDNA 1μL，ddH2O 8.4μL擴(kuò)增條件：95℃ 30 s；95℃ 5 s；62℃ 30 s；共40個循環(huán)。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后觀察到銳利單一的基因熔解曲線，提示擴(kuò)增序列有明顯特異性，所做實(shí)驗(yàn)定量準(zhǔn)確。引物序列見表1。

表1 引物序列表

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 PCR擴(kuò)增反應(yīng)完成后，結(jié)果采用相對定量法2-??Ct。通過融解曲線可得知，無外源性的污染和引物二聚體的存在，擴(kuò)增是特異性的。統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 18.0軟件包，計量資料用（±s）表示，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 針刺對IDPN模型大鼠腦內(nèi)COMT、MAO-B mRNA的影響 與空白組比較，模型組腦中COMT、MAO-B的mRNA表達(dá)量明顯降低（P ＜0.05）；與模型組比較，針刺治療組腦中COMT、MAO-B的mRNA表達(dá)量明顯升高（P ＜0.05）；與對照組比較，針刺治療組腦中COMT、MAO-B的mRNA表達(dá)量明顯升高（P ＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠COMT、MAO-B 的mRNA 表達(dá)水平比較（±s）

表2 各組大鼠COMT、MAO-B 的mRNA 表達(dá)水平比較（±s）

注：與空白組比較，1）P＜0.05；與TD 模型組比較，2）P＜0.05；與對照組比較，3）P＜0.05。

2.2 針刺對IDPN 模型大鼠腦內(nèi)DRD1、DRD2 mRNA的影響 與空白組比較，模型組腦中DRD1 mRNA表達(dá)量明顯升高，而DRD2 mRNA明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）；與模型組比較，針刺治療組腦中DRD1 的mRNA表達(dá)量降低（P ＜0.05），但不低于對照組（P ＞0.05）；與模型組比較，針刺治療組腦中DRD2 的mRNA表達(dá)量升高（P ＜0.05），但未高于對照組（P ＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠DRD1、DRD2 的mRNA 表達(dá)水平比較（±s）

表3 各組大鼠DRD1、DRD2 的mRNA 表達(dá)水平比較（±s）

注：與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)除空白組外的30 只大鼠刻板行為和運(yùn)動行為評分均＞2 分，提示造模成功，且針刺治療后大鼠抽動行為明顯改善，其腦內(nèi)DA、NE 表達(dá)減少，治療有效，且療效優(yōu)于對照組[9]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M動物腦內(nèi)COMT、MAO-B、DRD2 的mRNA表達(dá)量明顯低于空白組（P ＜0.05），而DRD1 的mRNA表達(dá)量明顯高于空白組（P ＜0.05），提示I DPN模型大鼠胺類神經(jīng)遞質(zhì)降解酶和多巴胺受體表達(dá)趨勢與前人的研究結(jié)論相符[10，11]。治療4 周后，針刺治療組大鼠腦內(nèi)COMT、MAO-B的mRNA表達(dá)量較模型組和對照組均明顯上升（P ＜0.05），提示針刺治療使大鼠腦內(nèi)胺類遞質(zhì)降解酶含量明顯升高，且高于對照組。針刺治療組大鼠腦內(nèi)DRD2 mRNA表達(dá)量較模型組明顯上升（P ＜0.05），DRD1 mRNA較模型組明顯降低（P ＜0.05），但均未優(yōu)于對照組（P ＞0.05），提示針刺治療對大鼠腦內(nèi)DRD1、DRD2 的表達(dá)有影響，但未優(yōu)于氟哌啶醇片的作用。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)顯示針刺治療對I DPN模型大鼠腦內(nèi)兒茶酚胺降解酶的表達(dá)有明顯影響，這可能是針刺治療抽動障礙的分子生物學(xué)機(jī)制之一。而針刺治療對多巴胺受體的表達(dá)有影響，但干預(yù)作用不如氟哌啶醇片。

4 結(jié)語

近年來，針刺治療抽動障礙以臨床研究多見，均取得較好效果，百會、合谷、內(nèi)關(guān)、大椎等穴位使用頻率較高[12]。然而，針刺治療抽動障礙的實(shí)驗(yàn)研究還較少，尤其在分子生物學(xué)水平。本實(shí)驗(yàn)從兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)的代謝途徑和多巴胺受體表達(dá)入手，選取近期研究較熱門的COMT、MAO-B、DRD1、DRD2 為檢測指標(biāo)，探討針刺治療抽動障礙的分子生物學(xué)機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)對I DPN大鼠模型治療4 周后，取大鼠腦組織提取RNA，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄、PCR 等處理后獲得COMT、MAO-B、DRD1、DRD2 mRNA，可直接反映兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)換酶、單胺氧化酶B、多巴胺受體D1、多巴胺受體D2 在腦內(nèi)的表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，針刺組大鼠腦內(nèi)COMT、MAO-B mRNA表達(dá)量較模型組明顯升高，且高于對照組，提示大鼠經(jīng)過針刺治療后腦內(nèi)兒茶酚胺類物質(zhì)分解代謝活躍，從而使胺類神經(jīng)遞質(zhì)DA、NE等含量降低。這可能是針刺治療使抽動障礙大鼠模型抽動行為減少的分子機(jī)制之一。而DRD1 mRNA表達(dá)量較模型組降低，未低于對照組，同時DRD2 mRNA表達(dá)量較模型組升高，未高于對照組，提示針刺治療可通過影響多巴胺受體D1、D2 的表達(dá)量對I DPN模型大鼠達(dá)到治療作用，但影響有限，并未優(yōu)于氟哌啶醇片。綜上所述，針刺治療抽動障礙的效果確切，其作用機(jī)制可能是增加了COMT、MAO-B等胺類代謝酶在腦內(nèi)的表達(dá)，從而增加胺類遞質(zhì)的降解，使抽動行為減少，同時對多巴胺受體的表達(dá)有輕微影響。然而，針刺是一種物理刺激，或許不是使上述物質(zhì)表達(dá)變化的直接原因。故，針刺刺激通過何種機(jī)制使這些酶和受體表達(dá)量改變?nèi)灾档眠M(jìn)一步研究，如電活動方面。