潘美玲 朱 菲 黃芳媛 陶 益※

[1.浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310014，2.滴可安（杭州）生物技術(shù)有限公司，浙江 杭州 310014]

銀屑病是一種皮膚病，也就是我們所熟知的牛皮癬[1，2]。該疾病發(fā)生以青壯年為主，對(duì)患者的生理以及心理健康均會(huì)產(chǎn)生比較惡劣的影響。目前，銀屑病并無(wú)特效療法，主要通過(guò)外用藥、內(nèi)用藥、物理療法以及中醫(yī)中藥對(duì)該疾病進(jìn)行一定程度上的控制。外用藥一般為維生素D3類、糖皮質(zhì)激素類，而維生素D3類藥物不適用于患有骨質(zhì)疾病和鈣代謝障礙者[3]，激素類藥物常常會(huì)發(fā)生“反跳”現(xiàn)象[4-6]。內(nèi)用藥以甲氨蝶呤、維A酸類藥物為主[7]，但是長(zhǎng)期服用此類藥物會(huì)對(duì)肝臟造成損傷。近年來(lái)，有不少學(xué)者采用中醫(yī)中藥學(xué)方法對(duì)銀屑病進(jìn)行治療，并對(duì)諸多相關(guān)研究成果進(jìn)行報(bào)道。例如中藥麻黃通過(guò)降低尋常型銀屑病小鼠血清IFN-γ、IL-17水平，從而治療尋常型小鼠銀屑病[8]；復(fù)方黃連膏顯著降低小鼠皮膚組織中IL-9、IFN-γ含量，小鼠銀屑病模型治療效果顯著，能夠明顯改善小鼠皮膚增厚、鱗屑癥狀，降低角質(zhì)層和表皮層增厚、角質(zhì)化程度，減少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)與血管數(shù)量[9]。

DKA芍藥植萃精華液（代稱為DKA01噴霧劑）是新一代中藥外用噴霧劑，由甘草、杭白芍、梔子、金銀花、香茶菜及蒲公英6味中藥組成。該制劑主要有效成分包括甘草酸、光甘草定、異甘草素及芍藥苷等，分別針對(duì)JAK/STAT、MAPK、PI3K/Akt等眾多信號(hào)通路[10，11]，可以有效調(diào)節(jié)TNF-α、IL-17、IL-10、IL-22、IL-23等細(xì)胞因子[12]，覆蓋面廣、應(yīng)答率高，對(duì)牛皮癬、濕疹、特異性皮炎等問(wèn)題皮膚具有良好的修復(fù)作用。本文通過(guò)建立大鼠銀屑病模型，給藥DKA01噴霧劑，觀察大鼠皮膚的改善情況，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，為DKA01噴霧劑對(duì)銀屑病的臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠，SPF級(jí)，雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g，數(shù)量48只，來(lái)源：上海吉輝實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)有限公司，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：20170012014802。飲水：將自來(lái)水進(jìn)行滅菌處理并裝于已高壓滅菌的塑料瓶中供大鼠飲用。普通飼料：經(jīng)Co60輻照滅菌后的顆粒飼料。飼養(yǎng)方式：自由飲食，將大鼠放置于獨(dú)立通氣籠盒中，加滿水和飼料，每籠4只大鼠。整個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作期間，動(dòng)物飼養(yǎng)及各項(xiàng)操作均按照3R原則進(jìn)行并給予人道關(guān)懷。

1.1.2 試劑 戊巴比妥鈉，含量≥95.0%，Mer ck進(jìn)口分裝，批號(hào)：20 200112；配制蘇木素染液：精密稱取15 g硫酸鋁鉀置于燒杯中，加入一定量蒸餾水進(jìn)行加熱溶解。稱取1 g蘇木素加入10 mL無(wú)水乙醇溶解，將其倒入硫酸鋁鉀溶液中，煮1 min，待其稍微冷卻，緩慢加入紅色氧化汞0.5 g，繼續(xù)加熱直至染液變?yōu)樽霞t色，用冷水進(jìn)行降溫，然后用紗布包裹瓶口，濾紙過(guò)濾之后，滴加5 mL乙酸備用；0.5%伊紅染液配制：精密稱取0.5 g水溶性伊紅，將其加入100 mL蒸餾水中，攪拌均勻后過(guò)濾，然后加入1滴乙酸（1滴/100 mL染液）即可。DKA01噴霧劑由上海美磐化妝品有限公司生產(chǎn)，備案號(hào)為：滬G妝網(wǎng)備字2021508892。

1.1.3 儀器 組織脫水機(jī)（MICROM公司，型號(hào)：STP120）；包埋機(jī)（Leica公司，型號(hào)：Arcadia H）；RM2265切片機(jī)（Leica公司，型號(hào)：RM2265）；冰凍切片機(jī)（Leica公司，型號(hào)：CM1950）；生物顯微鏡（Leica公司，型號(hào)：DM1000LED）；病理切片掃描儀（Hamamatsu公司，型號(hào)：Nanozoomer S360）；生化培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司，型號(hào)：SPX-150B-Z）；數(shù)字切片掃描儀（濱松光子公司，型號(hào)：S210C13239-01）；圖像軟件采集和分析系統(tǒng)（濱松光子公司，NDP）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物造模 取雌雄各半SD大鼠48只，體質(zhì)量150～220 g。使用脫毛膏脫除背部被毛，在每日涂抹適量5%咪喹莫特乳膏（四川明欣藥業(yè)有限責(zé)任公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20030129）1次，連續(xù)涂抹1周。出現(xiàn)皮屑、角質(zhì)增生和皮膚破潰表明造模成功。參照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[13-15]，根據(jù)大鼠銀屑病模型特性加以改良，從以下3個(gè)方面進(jìn)行評(píng)分。見(jiàn)表1。

表1 銀屑病面積和嚴(yán)重程度指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)以上得分，算出每只大鼠的總得分，分為正常組、模型組、DKA01噴霧低劑量（0.05%）組、DKA01噴霧高劑量（0.2%）組和卡泊三醇乳膏組（陽(yáng)性對(duì)照組1）和本維莫德組乳膏組（陽(yáng)性對(duì)照組2），每組8只。DKA01噴霧劑低劑量與高劑量均為噴涂給藥，卡泊三醇乳膏（重慶華邦制藥有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H20113541）和本維莫德乳膏（廣東中昊藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20190026）為涂抹給藥。

1.2.2 樣本采集 取大鼠背部破損處皮膚，用鑷子去除皮下脂肪和肌肉組織，經(jīng)生理鹽水清洗干凈，用4%多聚甲醛固定。

1.3 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.3.1 一般情況觀察 各實(shí)驗(yàn)組每日均給予足夠的飼料量以及水量，自由活動(dòng)。每日觀察并記錄動(dòng)物活動(dòng)情況和精神狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)期間對(duì)皮損部位進(jìn)行拍照保存（0 d、3 d、7 d、14 d），共給藥14 d。對(duì)大鼠皮損部位的紅斑、鱗屑、浸潤(rùn)進(jìn)行從無(wú)（0分）到重度（4分）的等級(jí)評(píng)分，取銀屑病面積和嚴(yán)重程度指數(shù)（PASI）總分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.2 病理學(xué)觀察 處死動(dòng)物，取皮損部位進(jìn)行常規(guī)HE染色[11]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，所有數(shù)據(jù)以（±s）表示，應(yīng)用ANOVA進(jìn)行計(jì)量資料方差分析，采用LSD法進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 皮損部位大體觀察結(jié)果 造模過(guò)程中大鼠沒(méi)有出現(xiàn)傷口感染、死亡等異常情況，正常組大鼠背部備皮區(qū)皮膚光滑，未出現(xiàn)紅腫鱗屑等癥狀；模型組大鼠在備皮區(qū)出現(xiàn)浸潤(rùn)性紅斑、厚層銀白色鱗屑和明顯的紅斑和出血點(diǎn)，一段時(shí)間后，銀屑病所具有的癥狀如紅斑、鱗屑等日漸加重，DKA01噴霧低劑量、高劑量組和本維莫德乳膏組經(jīng)給藥后，紅斑、鱗屑癥狀顯著改善，尤其是給藥14 d時(shí)，DKA01噴霧高劑量組與本維莫德乳膏組大鼠皮膚僅有少量出血點(diǎn)，鱗屑和破潰癥狀幾乎消失；卡波三醇乳膏組在給藥7 d和14 d時(shí)出現(xiàn)輕微的改善情況。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠的皮膚觀察比較

2.2 皮損部位的PASI評(píng)分結(jié)果 由PASI評(píng)分結(jié)果可見(jiàn)，給藥前各組大鼠在紅斑、鱗屑、斑塊隆起及評(píng)分總分方面差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；給藥3 d后，與模型組比較，DKA01噴霧高劑量組PASI評(píng)分顯著下降（P＜0.05），DKA01噴霧低劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；給藥7 d后，與模型組比較，DKA01噴霧高、低劑量組與本維莫德乳膏組PASI評(píng)分均顯著下降（P＜0.05，P＜0.01），卡泊三醇乳膏組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；給藥14 d后，DKA01噴霧高、低劑量組與本維莫德乳膏組PASI評(píng)分均顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠的PASI 評(píng)分比較

2.3 皮損部位病理觀察結(jié)果 正常組大鼠皮膚組織相比于模型組和DKA01 給藥組，結(jié)構(gòu)完整清晰，角化層明顯，復(fù)層扁平上皮層較薄，細(xì)胞排列較為整齊緊密；真皮內(nèi)膠原纖維交錯(cuò)排列，胞質(zhì)紅染、均勻；結(jié)締組織與脂肪層結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)；皮下肌層肌纖維排列整齊，體積大小均一，細(xì)胞核形態(tài)正常，核仁多分布四周；未見(jiàn)明顯病理變化。模型組大鼠皮膚可見(jiàn)復(fù)層扁平上皮層增厚，細(xì)胞排列紊亂，表皮外層覆蓋一層痂皮；真皮淺層部分膠原纖維壞死，壞死區(qū)域內(nèi)可見(jiàn)少量的單個(gè)圓形深染的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，較多長(zhǎng)橢圓形的成纖維細(xì)胞和長(zhǎng)梭形的纖維細(xì)胞增生，真皮內(nèi)出血，可見(jiàn)較多紅細(xì)胞滲出于纖維組織之間。經(jīng)DKA01 噴霧劑或本維莫德乳膏治療后，大鼠的皮膚、復(fù)層扁平上皮層增厚、細(xì)胞排列紊亂、真皮淺層部分膠原纖維壞死、真皮淺層部分內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和真皮內(nèi)出血情況等均有所改善，表明DKA01 噴霧劑能明顯抑制咪喹莫特誘導(dǎo)的大鼠局部皮膚損傷。見(jiàn)圖3。

圖3 各組大鼠皮損部位的病理觀察

3 討論

本實(shí)驗(yàn)主要研究中藥制劑DKA01 噴霧劑對(duì)銀屑病大鼠的治療作用。DKA01 噴霧劑能夠顯著改善銀屑病大鼠紅斑、鱗屑癥狀，能夠較好地修復(fù)局部皮膚損傷。PASI 評(píng)分顯示：DKA01 噴霧劑組大鼠的評(píng)分顯著下降，說(shuō)明對(duì)于銀屑病癥狀的治療效果比較好。HE 染色結(jié)果說(shuō)明：DKA01 噴霧劑與本維莫德乳膏治療后，大鼠皮膚、復(fù)層扁平上皮層增厚、細(xì)胞排列紊亂、真皮淺層部分膠原纖維壞死、真皮淺層部分內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和真皮內(nèi)出血情況等均有所改善，表明DKA01 噴霧劑能明顯抑制咪喹莫特誘導(dǎo)的大鼠局部皮膚損傷。本實(shí)驗(yàn)可以為DKA01 噴霧劑的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。