何昱霖,林心君

(1.福建中醫(yī)藥大學 中西醫(yī)結(jié)合研究院,福建 福州 350122;2.福建中醫(yī)藥大學 中西醫(yī)結(jié)合學院,福建 福州 350122)

隨著經(jīng)濟社會的發(fā)展和人口老齡化的加重,糖尿病患病率逐年增高,2020年流行病學調(diào)查顯示,中國公民糖尿病患病率為12.8%[1]。糖尿病心肌病(Diabetic Cardiomyopathy,DCM)是糖尿病常見的并發(fā)癥之一,獨立于原發(fā)性心肌病(如肥厚性心肌病、擴張性心肌病)和繼發(fā)性心肌病(如高血壓、冠心病),致死致殘率高,主要誘導因素是糖尿病糖脂代謝失調(diào)[2]。心肌線粒體在心肌糖代謝功能中發(fā)揮重要作用,線粒體功能障礙在DCM發(fā)病中起關(guān)鍵作用[3]。線粒體外膜70轉(zhuǎn)位酶(Tom70)主要功能為促進線粒體前體蛋白的導入,大量研究表明,通過Tom70抗氧化和抗凋亡特性可以改善DCM進程[4]。中醫(yī)學理論認為,脾主運化,人體一切水液代謝、聚集、輸布都與脾有關(guān)。《素問· 至真要大論》中“病機十九條”提到:“諸濕腫滿,皆屬于脾”,指脾主運化水谷和水液,脾氣健運將水谷精微上輸心肺,充養(yǎng)全身;若脾失健運和傳輸功能失常,導致痰飲水濕停聚而產(chǎn)生“諸濕腫滿”的臨床癥狀。脾之散精功能正常發(fā)揮,可以維持機體糖代謝的協(xié)調(diào)與平衡。通過臨床與實驗研究發(fā)現(xiàn),中醫(yī)脾虛證能夠在消化系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)表現(xiàn)出線粒體結(jié)構(gòu)與功能的異常[5]。以線粒體外膜上的 Tom70為切入點探討脾主運化與DCM發(fā)病關(guān)系,揭示“諸濕腫滿,皆屬于脾”與DCM發(fā)生發(fā)展的關(guān)系,為研究DCM病因病機和治療提供新思路。

1 脾的中醫(yī)生理功能與DCM之間的聯(lián)系

1.1 脾主運化與DCM的關(guān)系

《素問·陰陽應(yīng)象大論篇》云:“中央生濕,濕生土,土生甘,甘生脾…… 其在天為濕,在地為土,在體為肉,在藏為脾……”脾在陰陽學說中屬陰土,五行學說中屬中土,三焦理論中屬中焦。生理功能是主運化,主統(tǒng)血,主升清。脾胃同居中焦,關(guān)系密切,共同構(gòu)成核心的消化系統(tǒng);脾胃協(xié)同轉(zhuǎn)化水谷精微為血脂、血糖等營養(yǎng)物質(zhì)為身體供能。《靈樞·營衛(wèi)生會》中提到:“中焦泌糟粕,蒸津液,受氣取汁,變化而赤是為血?！比羝⑽负蛣t升清降濁功能正常,則水谷精微可以“奉心化赤”,通過心、肺化生氣血參與體循環(huán),濡養(yǎng)全身。脾的生理特性為喜燥惡濕,濕邪最易傷及脾陽,脾陽不足會內(nèi)生濕邪,外界濕邪加重內(nèi)濕,困厄脾陽,脾病不能為胃行其津液,不得秉水谷氣,郁積形成痰濕、瘀血。痰濕和瘀血郁而化熱,閉阻心氣和脈道成瘀。

中醫(yī)學認為,DCM根據(jù)其癥狀和體征,可以歸為“消渴”“胸痹”“驚悸”和“怔忡”范疇;明代戴思恭《證治要訣》中記載:“消心之病,往往因欲飲食過多,及食啖辛熱,飲引既多,小便亦多?！盵6]DCM臨床癥狀與“消心”基本一致。《醫(yī)宗必讀·痰》云:“脾土虛濕,清氣難升,濁氣難降,留中滯膈,瘀而成痰?！逼㈥柌蛔?難以運化水液,氣不化津而聚之生“諸濕腫滿”,水濕停留則浮腫,津液不布則口干,痰濁阻遏致心慌胸悶,胸陽不振加重痰瘀內(nèi)阻心脈[7]。糖脂代謝過程中微血管晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)沉積、炎癥因子、細胞外基質(zhì)(ECM)累積都屬于“痰濁和瘀血”累積在心肌細胞中;糖脂代謝紊亂、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)引起心肌功能和心血管功能障礙就屬于“痰瘀內(nèi)阻心脈”。

1.2 脾主運化與線粒體的關(guān)系

線粒體是身體的能量工廠,其通過三羧酸循環(huán)氧化磷酸化讓攝入身體的糖、脂肪和蛋白質(zhì)(水谷精微物質(zhì))轉(zhuǎn)化為ATP提供能量(精、氣、神);其中關(guān)鍵環(huán)節(jié)琥珀酸單酰Co-A 與甘氨酸相結(jié)合生成血紅素(即氣能生血)[5]。線粒體存在于除紅細胞以外所有組織細胞中,且線粒體mtDNA疾病會影響所有組織器官產(chǎn)生不同的疾病[8]?！镀⑽刚摗て⑽甘⑺フ摗吩?“百病皆脾胃衰而生也?！斌w現(xiàn)出脾胃與線粒體功能相似,皆為氣血生化之源,精、氣、神產(chǎn)生之原動力。

心肌能量的來源主要為線粒體呼吸鏈氧化磷酸化的反應(yīng),心肌細胞線粒體的功能和結(jié)構(gòu)直接影響心功能。研究表明脾氣虛時,心肌線粒體損傷導致ATP合成不足,造成線粒體發(fā)生DNA突變和缺失,導致呼吸鏈酶復合物活性下降和線粒體產(chǎn)能減少導致心肌收縮功能障礙[9-10]。同時,有學者研究發(fā)現(xiàn),脾失運化與痰瘀互結(jié)會導致心肌線粒體膜通透性下降,釋放出過多的細胞內(nèi)活性氧(ROS)與其細胞色素C(Cyt-c),引發(fā)細胞凋亡導致心臟收縮能力和舒張能力降低,泵血功能異常[11]。ROS來源于線粒體,通過健脾化濁法可減少心肌線粒體氧化應(yīng)激產(chǎn)生,從而改善血管內(nèi)皮損傷來緩解DCM。裴宇鵬等[12]通過運用健脾化痰祛瘀方激活心肌線粒體自噬來維持心肌細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。所以,線粒體為心肌供能的功能與中醫(yī)的“脾”有共同之處;而脾為心之子,脾病可及心,脾與心肌線粒體更是有密不可分的聯(lián)系。

1.3 脾失運化-線粒體功能障礙導致DCM發(fā)生

DCM的發(fā)病機制尚未完全明確,代謝紊亂、心肌細胞自噬、心肌纖維化、心肌細胞凋亡、微血管病變、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、脂肪毒性和線粒體結(jié)構(gòu)功能改變等因素都參與DCM發(fā)生發(fā)展過程[13-14]。線粒體損傷在DCM發(fā)病時可引起線粒體能量代謝障礙、線粒體氧化應(yīng)激增強、線粒體分裂與融合紊亂、心磷脂變化以及Ca2+紊亂等發(fā)生,進一步導致心肌舒縮功能障礙、冠狀動脈微血管病變和心臟結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[15]。有學者通過線粒體有絲分裂吞噬作為DCM治療靶點,通過線粒體移植、服用抗氧化劑和生物燃料來對抗活性氧不足引起的DCM[16]。

中醫(yī)基礎(chǔ)理論中的“脾”涵蓋了“脾系臟器”,“脾系臟器”除中焦之脾胃,還包括胰腺、肝臟和大小腸。營養(yǎng)物質(zhì)通過胃腸道吸收后進入腸系膜靜脈再進入門靜脈,在肝臟內(nèi)轉(zhuǎn)化為人體所需營養(yǎng)物質(zhì)進入心臟,進而供應(yīng)全身臟器。當脾主運化功能出現(xiàn)異常時,脂膏傳輸功能失常,濕熱痰濁、毒邪郁結(jié)、血脈寒凝血瘀便產(chǎn)生,阻塞于心脈。有研究證明,高脂引起的冠狀動脈粥樣硬化(AS)主要由于脂質(zhì)沉積動脈內(nèi)皮(毒邪郁結(jié)于血脈),引起慢性炎癥,導致冠狀動脈狹窄(寒凝血瘀內(nèi)阻血脈),且與心肌線粒體呼吸功能失常密切相關(guān)[11]。樊一波等[17]選用歸脾經(jīng)補脾氣的藥物葛根為君藥干預DCM模型大鼠心肌線粒體,損傷的線粒體膜電位和心肌ATP濃度都有所提高。以上研究可表明,脾失運化的功能失常從微觀引起心肌線粒體功能受損,ROS產(chǎn)生從而引發(fā)心肌細胞凋亡,同時引發(fā)冠狀動脈血管病變,導致心臟舒縮功能障礙誘發(fā)DCM;宏觀上會引起水濕、痰濁和瘀血內(nèi)生而出現(xiàn)各種濕病、浮腫和脹滿以及口干、納呆、便溏、舌苔白膩、齒痕重等臨床特征。

2 Tom70參與調(diào)節(jié)DCM的機制研究

2.1 Tom70與DCM的關(guān)系

心肌組織中線粒體極為豐富,Tom70在線粒體外膜上分布較多,最早發(fā)現(xiàn)鑒定釀酒酵母中Tom70是1983年[18]。Tom70作為胞質(zhì)伴侶蛋白和輔伴侶蛋白對接位點,參與線粒體生物體內(nèi)新合成的伴侶結(jié)合蛋白形成,同時也是新合成線粒體內(nèi)膜代謝物載體的主要連接受體,Tom70能夠識別大量代謝物載體[19]。近年來對mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平篩查顯示,Tom70在人類病理性心肌肥厚樣本和高脂誘導DCM大鼠心肌模型表達都下降[20]。在動物實驗中有研究發(fā)現(xiàn),Tom70能夠降低DCM心肌線粒體中ROS的產(chǎn)生,高水平ROS和線粒體融合的重要介質(zhì)——內(nèi)膜蛋白光學萎縮-1(Opa1)的輸入減少,會引起線粒體功能異常,這種異常是由于DCM模型小鼠心臟細胞中Tom70的mRNA水平和蛋白質(zhì)表達降低引起的[21]。Tom70的TPR結(jié)構(gòu)域能與熱休克蛋白Hsp70 和Hsp90分子伴侶結(jié)合,當Tom70功能正常時,與Hsp90分子伴侶相結(jié)合參與三羧酸循環(huán),完成檸檬酸合成酶由胞漿向線粒體內(nèi)轉(zhuǎn)運,從而起到對心肌細胞的保護作用[22]。

臨床研究顯示[23],藥物二甲雙胍可通過激活Tom70來減輕線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激水平,進而改善心臟微血管內(nèi)皮細胞損傷(CMECs)。Amanda Lochner[24]研究表明褪黑素對缺血性/再灌注型心肌損傷有治療作用,可能是通過激活褪黑素受體-PGC1alpha-Tom70信號通路來改善氧化應(yīng)激引起的線粒體碎片化的心肌損傷,褪黑素受體作用的發(fā)揮依賴于Tom70對前體蛋白的轉(zhuǎn)運功能正常發(fā)揮。綜上,Tom70有望成為臨床上治療改善DCM線粒體損傷的新靶點。

2.2 Tom70 通過抗氧化調(diào)節(jié)線粒體功能到達改善DCM目的

Tom70主要功能是促進線粒體前體蛋白的導入,這些前蛋白參與氧化應(yīng)激和線粒體功能的調(diào)節(jié),線粒體功能障礙會導致嚴重的氧化應(yīng)激。Tom70過表達可以減輕高脂高糖培養(yǎng)基誘導的心肌細胞的氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙和細胞凋亡;上調(diào)Tom70可改善DCM模型db/db小鼠的心肌肥厚、間質(zhì)纖維化和心室功能障礙等癥狀[25]。同時也被證實,Tom70缺乏會導致線粒體內(nèi)超氧化物產(chǎn)生和線粒體腫脹、線粒體嵴斷裂,以及外膜破碎,從而抑制線粒體呼吸作用,引發(fā)心肌細胞ATP生成減少和ROS上升;通過DHE和MitoSOX實驗分別檢測到,高脂高糖誘導的DCM大鼠心肌細胞線粒體內(nèi)超氧化物水平上升,引起線粒體功能障礙,表現(xiàn)為線粒體膜電位和ATP水平降低;敲除Tom70后,會顯著增強DCM大鼠心肌細胞產(chǎn)生的超氧化物水平,提示Tom70通過減輕線粒體氧化應(yīng)激水平和改善線粒體形態(tài)及呼吸功能達到抗心肌細胞凋亡和改善線粒體功能的作用[26]。在臨床上高糖誘導的人類大血管主動脈內(nèi)皮細胞(HMAECs)中TLR2和TLR4的高表達,DCM中心肌細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞(VSMC)暴露于高糖環(huán)境會通過增加TLR4、髓樣分化因子88(MyD88)和NF-κB的蛋白水平和活性觸發(fā)TLR4信號,從而增加心肌細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生,而高表達TOM70可通過抗氧化應(yīng)激預防心肌肥厚、纖維化和心室功能障礙,同時在維持ATP生成和線粒體膜電位方面保護線粒體功能正常發(fā)揮,其臨床具體機制有待進一步研究[27]。

在與心臟相關(guān)的其他疾病中,Tom70同樣在抗氧化應(yīng)激和保護心肌線粒體功能中發(fā)揮重要作用。在缺血性心肌病中,Tom70減少導致缺血心肌中ROS顯著增加,ROS是心肌梗死后促凋亡的介質(zhì);Tom70通過穩(wěn)定線粒體結(jié)構(gòu)和功能來調(diào)節(jié)梗死心肌的ROS和凋亡[28]。有研究者在人類病理性心肌肥厚性心臟病對已知的Tom復合基因進行了mRNA篩選,研究顯示,Tom70表達降低可能是誘導肥厚性心肌病患者走向終末期心力衰竭的主要原因,同時在動物和細胞試驗中,抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸和過氧化氫酶的應(yīng)用顯著改善了心肌細胞增大以及ANP、BNP和α-MHC的表達,研究證實氧化應(yīng)激可能是血流動力學超負荷和G蛋白偶聯(lián)受體激動劑刺激引起的病理性心肌肥大的共同病理機制,Tom70的減少導致病理性大鼠心肌細胞肥大模型(NRVM)中ROS明顯升高;線粒體內(nèi)膜的Opa1缺陷引起的線粒體融合異常會導致Tom70缺乏,是引起氧化應(yīng)激和線粒體形態(tài)異常的基礎(chǔ),而引起Opa1在線粒體導入功能異常的原因是Tom70在線粒體外膜靶向?qū)肴毕輀29]。

2.3 Tom70 通過抗凋亡調(diào)節(jié)線粒體功能到達改善DCM目的

細胞壞死性凋亡是由特異性死亡受體檢測到細胞外或細胞內(nèi)微環(huán)境紊亂而引發(fā)的調(diào)節(jié)性的細胞死亡形式,與DCM關(guān)系密切。特異性阻斷高糖誘導的DCM心肌細胞壞死性凋亡能夠減輕DCM心肌細胞毒性、線粒體損傷和ROS水平,用ROS清除劑顯示能夠降低DCM心肌細胞毒性、壞死性凋亡下游分子RIP3的表達[30]。說明DCM心肌細胞中ROS水平和心肌細胞凋亡相互影響,對線粒體功能和心肌產(chǎn)生損害。線粒體被認為是細胞“凋亡總部”,它們分裂成比之更小的結(jié)構(gòu)在細胞死亡程序中至關(guān)重要。心肌細胞中的線粒體是心肌缺血的主要靶向亞細胞器,保持線粒體功能和形態(tài)的完整性可以減輕心肌梗死損傷和心肌細胞凋亡。

Tom70具有四個C-末端四三肽重復序列(TPR)基序,用于識別細胞質(zhì)中的線粒體前蛋白的內(nèi)部靶向信號(很多是內(nèi)膜代謝物載體),然后將它們轉(zhuǎn)移至相應(yīng)線粒體內(nèi)部,Tom70基因敲除可能會干擾線粒體蛋白質(zhì)運輸和引發(fā)心肌細胞細胞凋亡,從而加重心肌損傷[28]。有學者在細胞水平上建立高脂高糖介導的DCM心肌細胞模型,通過Tom70 siRNA技術(shù)抑制Tom70表達,結(jié)果顯示凋亡相關(guān)分子Caspase3、Caspase9表達增加,說明Tom70抑制后加重高脂高糖介導的DCM心肌細胞凋亡[26]。高糖誘導下人類視網(wǎng)膜毛細血管內(nèi)皮細胞Tom70基因表達顯著降低,其與線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(TFAM)的結(jié)合也低于正常水平。結(jié)果表明,TFAM向線粒體的運輸而使線粒體損傷,電子傳遞鏈功能失調(diào),導致線粒體運輸系統(tǒng)功能失常可能引細胞凋亡。從以上研究中可以看出,Tom70的抑制會干擾線粒體前蛋白的傳輸,導致DCM心肌細胞損傷和線粒體運輸功能障礙,引發(fā)心肌細胞凋亡。未來以與Tom70相結(jié)合的線粒體轉(zhuǎn)運蛋白為靶點的治療策略有望改善線粒體生物合成功能[31]。

3 Tom70與“諸濕腫滿,皆屬于脾”的關(guān)系

3.1 Tom70缺陷是“諸濕腫滿,皆屬于脾”的物質(zhì)基礎(chǔ)

Tom70缺陷導致心肌細胞線粒體受損,線粒體中葡萄糖轉(zhuǎn)化為游離脂肪酸(FFA)氧化磷酸化后產(chǎn)生ATP的能力減弱,引發(fā)線粒體活性氧增加,心肌線粒體功能異常,直接引起脾胃運化水谷和水液功能失常,形成痰濕、瘀血阻遏心脈;同時Tom70缺陷導致脾失運化,水谷精微物質(zhì)在中焦郁結(jié)不得疏泄,而生瘀毒、濁毒、濕熱毒,導致胰島素抵抗、高胰島素血癥和脂肪毒性增加等,引發(fā)心肌細胞發(fā)生變性、肥大、纖維化及局灶性壞死;心臟血管舒張功能障礙還有炎癥發(fā)生,引發(fā)心臟舒縮功能障礙的DCM。臨床上可表現(xiàn)為心源性水腫、心悸心慌、心肌缺血性心絞痛等癥狀。

3.2 Tom70缺陷導致脾陽受損,運化失司

把Tom70作為闡釋DCM病機“諸濕腫滿,皆屬于脾”的切入點的理論機制在于線粒體外膜上的Tom70的缺陷會干擾線粒體蛋白質(zhì)的向內(nèi)轉(zhuǎn)輸,使線粒體形態(tài)受損,超氧化物生成增多,導致線粒體呼吸鏈酶功能異常生成ATP不足。ATP生成不足的中醫(yī)病機為脾陽受損,引發(fā)水濕停聚,上則不能通過肺氣調(diào)暢三焦氣機,水道不通停而聚為水濕和瘀血,臨床表現(xiàn)為“全身水腫”“胸腹脹滿疼痛”、水濕引起的“咳、喘、哮”等;下則肝腎之氣不能隨脾陽升清而上升,腎氣滯留,膀胱失約,而導致水濕留于下焦,臨床表現(xiàn)為“風水”“皮水”,下肢水腫較為明顯,小便不利。

3.3 Tom70調(diào)節(jié)脾主運化來治療DCM引起的“諸濕腫滿”

從以上研究中發(fā)現(xiàn),抑制Tom70表達會導致心肌細胞凋亡和線粒體損傷,加重DCM發(fā)展;高表達Tom70會減輕心肌細胞線粒體氧化應(yīng)激,緩解DCM進程。而脾與心肌線粒體的功能密不可分,脾運化功能失常,心肌微血管AGEs沉積、炎癥因子、ECM和脂質(zhì)沉積引發(fā)慢性炎癥反應(yīng)(毒邪蘊結(jié)于心脈)則會引起線粒體呼吸功能障礙和產(chǎn)能減少,進一步引發(fā)心肌細胞凋亡,影響心臟舒縮供血功能。因此本研究認為,脾失運化引起的DCM,與心肌線粒體損傷相關(guān),而線粒體外膜上的Tom70表達下降會干擾線粒體蛋白質(zhì)運輸,誘發(fā)心肌細胞氧化應(yīng)激和凋亡發(fā)生,心臟功能障礙引發(fā)心源性水腫、胸悶心慌。而以Tom70和與Tom70相結(jié)合的線粒體轉(zhuǎn)運蛋白為靶點研究,抗凋亡和抗氧化應(yīng)激治療DCM有望成為調(diào)節(jié)脾失運化,改善“諸濕腫滿”的新方向。

4 結(jié)語

綜上,“諸濕腫滿,皆屬于脾”在DCM中的具體病機為脾失運化(脾-心肌線粒體功能失常),導致痰濁、水濕、瘀血(AGEs、ECM、炎癥因子、ROS沉積)閉阻心脈,引發(fā)心肌舒縮功能障礙以及冠狀動脈病變,產(chǎn)生“濕、腫、滿”的臨床癥狀。Tom70可以通過脾主運化(抗氧化和抗凋亡)來改善心肌線粒體的形態(tài)和功能損傷,以期成為治療DCM的新靶點。