劉明陽，趙翔，張宇，張鍇廣，高延征

(河南省人民醫(yī)院脊柱脊髓科，鄭州大學(xué)人民醫(yī)院，河南大學(xué)人民醫(yī)院，河南 鄭州 450000)

椎間盤退變是肌肉骨骼系統(tǒng)的一種高發(fā)疾病，常導(dǎo)致椎管狹窄、椎間關(guān)節(jié)不穩(wěn)定、疼痛甚至畸形[1]。其作為椎間盤源性腰痛的重要原因，常常給家庭和社會帶來巨大的經(jīng)濟負擔(dān)[2]。椎間盤退變的發(fā)病機制與髓核細胞凋亡、衰老、炎癥、氧化應(yīng)激、細胞外基質(zhì)降解以及異常血管形成密切相關(guān)[2-4]。目前，椎間盤退變的藥物治療旨在緩解癥狀，而不是阻止或逆轉(zhuǎn)椎間盤受損的病理進展。千層紙素A是從黃芩中提取的一種黃酮類化合物，其化學(xué)全名為5，7-二羥基-6-甲氧基-2-苯基-4H-1-苯并呋喃-4-酮[5]。據(jù)報道，千層紙素A具有廣泛的藥理作用，其中抗炎和抗癌作用最受關(guān)注，其他作用包括抗病毒、神經(jīng)保護和抗血管生成作用等[6]。千層紙素A對于包括骨性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和骨質(zhì)疏松在內(nèi)的多種肌肉骨骼系統(tǒng)的疾病均顯示出良好的治療作用[7-9]?？紤]到其顯著的抗炎作用，千層紙素A可能是治療椎間盤退變的潛在選擇。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)將分子化合物與藥理學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)與生物信息學(xué)結(jié)合起來構(gòu)建“化合物-靶點-疾病”的網(wǎng)絡(luò)預(yù)測模型，能夠系統(tǒng)地闡述化合物對于疾病的潛在作用靶點和相關(guān)通路[10]。現(xiàn)階段對千層紙素A治療椎間盤退變的作用靶點以及其發(fā)揮作用的分子機制的研究仍然有限。因此，本研究使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，進一步預(yù)測千層紙素A治療椎間盤退變的作用靶點和其作用機制，為后續(xù)開展千層紙素A相關(guān)的藥理研究及椎間盤退變防治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 千層紙素A靶點基因的篩選在PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)搜索關(guān)鍵字Oroxylin A并下載結(jié)構(gòu)式和SMILES式，然后將結(jié)構(gòu)式導(dǎo)入PharmMapper數(shù)據(jù)庫(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)，SMILES式導(dǎo)入SwissTarget Prediction(STR)數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)和Similarity ensemble approach(SEA)數(shù)據(jù)庫(https://sea.bkslab.org/)以獲取藥物作用靶點。STR數(shù)據(jù)庫使用Probability>0為過濾條件篩選數(shù)據(jù)。PharmMapper數(shù)據(jù)庫使用norm fit score≥0.7為過濾條件篩選數(shù)據(jù)，并使用UniProt數(shù)據(jù)庫(http://www.Uniprot.org/)將從PharMapper數(shù)據(jù)庫下載的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的基因。SEA數(shù)據(jù)庫不設(shè)置過濾條件。3個數(shù)據(jù)庫物種選擇均為人類。隨后將3個數(shù)據(jù)庫獲取的基因合并，去除重復(fù)的基因，即得到千層紙素A的潛在的藥物作用靶點

1.2 千層紙素A在椎間盤退變中相關(guān)靶點的篩選以“Intervertebral disc degeneration”為關(guān)鍵詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)和在線人類孟德爾遺傳(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)數(shù)據(jù)庫(https://omim.org/)中搜索椎間盤退變相關(guān)基因靶點。將2個數(shù)據(jù)庫的靶點合并得到椎間盤退變的潛在致病基因。將椎間盤退變相關(guān)靶點和千層紙素A的藥物靶點取交集，獲得二者的共同基因即為千層紙素A抗椎間盤退變的潛在關(guān)鍵靶點。

1.3 蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建對于研究蛋白質(zhì)功能至關(guān)重要，它可以更加系統(tǒng)、全面地研究疾病分子機制、發(fā)現(xiàn)新藥靶點等。將千層紙素A對應(yīng)的椎間盤退變相關(guān)基因?qū)朐诰€STRING數(shù)據(jù)庫，將物種設(shè)置為“人類(homo sapiens)”，可信度設(shè)置為0.4，選擇“hide disconnected nodes in the network”刪除無相互作用的蛋白質(zhì)。下載蛋白質(zhì)互作的tsv文件并將其導(dǎo)入到Cytoscape 3.8.0軟件中，運用Analysis network工具進行網(wǎng)絡(luò)分析。度值顯示與單個節(jié)點連接的節(jié)點數(shù)，其可作為反映靶點基因關(guān)鍵程度的指標(biāo)。根據(jù)度值的高低調(diào)整節(jié)點的大小和顏色的深淺。節(jié)點度值越高，則節(jié)點越大，顏色越深。邊的粗細根據(jù)combine_score進行調(diào)整。combine_score值越高，則邊越粗。最后利用R語言的“count R”包處理tsv文件，按照度值排列得到蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)相關(guān)核心基因的條形圖。

1.4 基因本體(Gene Ontology，GO)及京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析在R語言中導(dǎo)入千層紙素A抗椎間盤退變相關(guān)的潛在靶點，用“clusterProfile”包進行GO功能富集分析及KEGG通路富集分析并進行可視化展示，篩選條件設(shè)定為P<0.05以及q<0.05。得到千層紙素A抗椎間盤退變的生物學(xué)過程(biological process，BP)、分子功能(molecular founction，MF)和細胞組成(cellular component，CC)以及KEGG信號通路信息。通過“ggplot”包繪制氣泡圖，用Cytoscape 3.8.0軟件對靶點-通路進行網(wǎng)絡(luò)分析，篩選出度值高的靶點。將靶點-通路網(wǎng)絡(luò)和PPI網(wǎng)絡(luò)中篩選出的度值較高的靶點取交集，得到關(guān)鍵基因。

1.5 分子對接分子對接是一種用于預(yù)測生成結(jié)合模型的兩個分子之間的相互作用的方法，可以估算出小分子配體和生物大分子受體的結(jié)合能大小，為藥物設(shè)計提供新的思路。將千層紙素A作為配體，關(guān)鍵基因編碼的蛋白作為受體。在PubChem數(shù)據(jù)庫中下載配體的二維結(jié)構(gòu)文件，利用Chem3D軟件進行化合物結(jié)構(gòu)優(yōu)化并保存為mol2格式。從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中獲得大分子受體的蛋白結(jié)構(gòu)并用PyMol軟件對受體蛋白進行前處理。使用AutoDock軟件給蛋白質(zhì)分子加氫和加電子并將配體和受體文件轉(zhuǎn)換為pdbqt格式，對受體活性口袋進行定義并保存為gpf文件。利用AutoDock vina進行分子對接。一般認為自由能在-4～0 kcal·mol-1之間代表結(jié)合力較弱，-7～-4 kcal·mol-1之間代表結(jié)合力中等；自由能小于-7 kcal·mol-1代表結(jié)合力較強[11]。最后通過PyMol軟件對對接結(jié)果進行可視化。

2 結(jié)果

2.1 靶點篩選將從STR、SEA、PharmMapper數(shù)據(jù)庫中得到的藥物作用靶點去重后共得到202個靶點基因。然后將GeneCards數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫搜索到的椎間盤退變相關(guān)基因靶點去重得到1 212個致病靶點。利用R語言將千層紙素A的藥物作用靶點與椎間盤退變的致病靶點進行匹配取交集，最終得到35個共同靶點。見圖1。

圖1 千層紙素A與椎間盤退變靶點圖

2.2 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)根據(jù)節(jié)點的度值將靶基因分布為2個同心圓，外層靶基因的度值為1～15，內(nèi)層靶基因的度值為16～25，得到千層紙素A與椎間盤退變相關(guān)主要靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖。經(jīng)R語言的“count R”包得到按核心基因度值排列的條形圖。其中排名靠前的核心靶點有白細胞介素-6(interleukin 6，IL-6)、血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、雌激素受體1(estrogen receptor 1，ESR1)、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9，MMP9)等。見圖2。

A為千層紙素A治療椎間盤退變的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)；B為度值排名前15的基因。

2.3 GO與KEGG分析GO分析發(fā)現(xiàn)千層紙素A治療椎間盤退變的靶點在生物過程主要包括對炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、對缺氧的反應(yīng)和細胞對化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)等。在細胞組成主要富集于染色體區(qū)、線粒體基質(zhì)、樹突棘等。在分子功能主要富集于金屬蛋白酶活性、生長因子受體結(jié)合等。見圖3。

圖3 GO功能富集分析

KEGG分析顯示相關(guān)信號通路主要涉及雌激素信號通路、PI3K/AKT信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路以及糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路等。見圖4。隨后將千層紙素A抗椎間盤退變的預(yù)測靶基因以及根據(jù) KEGG通路的富集分析結(jié)果篩選出來的通路導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件進行“靶標(biāo)-通路”分析，展現(xiàn)二者之間的聯(lián)系。見圖5。經(jīng)過與PPI網(wǎng)絡(luò)分析得到的關(guān)鍵靶基因?qū)φ?，篩選出IL-6、VEGFA、EGFR和MMP9共4個關(guān)鍵靶基因用于后續(xù)的分子對接。

圖4 KEGG功能富集分析

圖5 靶點-通路分析

2.4 分子對接為進一步探索千層紙素A與關(guān)鍵靶點之間的相互作用關(guān)系，IL-6(PBD ID：1IL6)、VEGFA(PBD ID：1VPF)、EGFR(PBD ID：1XKK)和MMP9(PBD ID：2OVX)被用來與千層紙素A進行分子對接。選取最低結(jié)合能的組合，結(jié)果表明千層紙素A與IL-6的結(jié)合能為-7.2 kcal·mol-1，與VEGFA的結(jié)合能為-7.8 kcal·mol-1，與EGFR的結(jié)合能為-8.7 kcal·mol-1，與MMP9的結(jié)合能為-10.0 kcal·mol-1。分子對接的結(jié)果顯示千層紙素A與靶基因均具有良好的結(jié)合能力。見圖6。

圖6 分子對接示意圖

3 討論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，探討千層紙素A抗椎間盤退變的潛在分子機制。既往研究顯示，千層紙素A有較強的抗炎和抗血管生成作用[6]。Zhang等[7]發(fā)現(xiàn)千層紙素A可以通過抑制ERK和PI3K/AKT信號通路的激活來減輕IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細胞炎癥反應(yīng)。而另一項研究則證實千層紙素A可以通過抑制NF-κB和Wnt/β-catenin信號通路減輕關(guān)節(jié)軟骨細胞的肥大和炎癥反應(yīng)，從而延緩大鼠模型中骨性關(guān)節(jié)炎的進展[12]。Gao等[13]發(fā)現(xiàn)，千層紙素A通過阻斷VEGF誘導(dǎo)的KDR/Flk-1(VEGFR-2)磷酸化和相關(guān)下游信號分子(包括p38絲裂原活化蛋白激酶、ERK和Akt)抑制血管生成。有關(guān)千層紙素A治療椎間盤退變的研究雖未見報道，但考慮到炎癥與異常的血管生成與椎間盤退變的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]，千層紙素A可能是治療椎間盤退變的潛在選擇。

GO富集分析結(jié)果顯示生物過程主要包括對炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、對缺氧的反應(yīng)和對化學(xué)應(yīng)力的反應(yīng)等。炎癥反應(yīng)直接參與椎間盤退變的進展，還可導(dǎo)致繼發(fā)性腰痛和神經(jīng)根性癥狀。炎癥反應(yīng)參與椎間盤退變的各種病理過程，包括細胞外基質(zhì)降解、髓核細胞的凋亡和衰老[2]。椎間盤患者椎間盤組織中促炎細胞因子如TNF-α、IL-1β和IL-6的表達顯著增加[14-15]。Kwon等[16]發(fā)現(xiàn)缺氧可以增強炎癥反應(yīng)環(huán)境下椎間盤的血管生成能力，并通過抑制細胞外基質(zhì)的合成促進椎間盤退變的發(fā)展。KEGG富集分析結(jié)果顯示與千層紙素A治療椎間盤退變相關(guān)的通路可能包括PI3K/AKT信號通路、雌激素信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路以及糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路等。PI3K/AKT信號通路被證明與椎間盤退變的疾病進程密切相關(guān)。Jiang等[17]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以通過激活PI3K/Akt通路抑制IL-1β誘導(dǎo)的髓核細胞凋亡，而雌激素可以通過激活PI3K/Akt通路來減輕炎癥反應(yīng)，降低氧化應(yīng)激水平從而抑制髓核細胞的凋亡。TNF和IL-17途徑主要通過促進炎癥因子的釋放、髓核細胞的凋亡和細胞外基質(zhì)的降解在椎間盤退變的進展中發(fā)揮協(xié)同作用[18]。此外，AGE-MG-H1的積累與椎間盤退變過程中的軟骨細胞肥大和成骨分化有關(guān)，并且這些與RAGE直接相關(guān)，表明AGE-RAGE可能是一個潛在的治療靶點[19]。

PPI網(wǎng)絡(luò)分析和KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)IL-6、VEGFA、EGFR和MMP9是千層紙素A抗椎間盤退變作用關(guān)聯(lián)度最高的靶點。分子對接結(jié)果表明，千層紙素A與核心靶基因IL-6、VEGFA、EGFR和MMP9均具有良好的親和力。多項研究顯示IL-6的過表達與椎間盤退變密切相關(guān)[20-22]。作為一種重要的炎癥因子，既往研究顯示IL-6可通過PI3K/Akt和Ras通路調(diào)控下游基因的表達從而參與椎間盤退變的進程[20]，與本研究中KEGG富集分析的結(jié)果相符。VEGFA屬于VEGF家族，是促進微血管形成的重要細胞因子[23]。羅堅等[24]發(fā)現(xiàn)VEGF可以促進椎間盤組織新生血管的形成和毛細血管的浸潤從而導(dǎo)致椎間盤組織的吸收退變。本研究結(jié)果表明千層紙素A可能通過靶向作用于VEGFA從而抑制椎間盤組織異常的血管生成從而減緩椎間盤退變的進展。EGFR屬于ErbB受體酪氨酸激酶家族，有研究證實EGFR可以通過Src/ERK/STAT3通路誘導(dǎo)髓核細胞的炎癥反應(yīng)[25]。而千層紙素A則可能通過作用于EGFR從而抑制下游的炎癥反應(yīng)。MMP9屬于MMP家族，其主要水解底物為變性膠原以及Ⅳ、Ⅴ型膠原[26]。Li等[27]發(fā)現(xiàn)退變的椎間盤組織中MMP-9的水平高于正常水平，且升高的水平與退變程度呈正相關(guān)。千層紙素A可通過靶向作用于MMP抑制髓核細胞外基質(zhì)的降解。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法分析千層紙素A與椎間盤退變靶點的相互關(guān)系。IL-6、VEGFA、EGFR和MMP9是潛在的關(guān)鍵靶點。結(jié)合文獻資料，千層紙素A抗椎間盤退變的藥理機制與抑制髓核細胞凋亡、抑制細胞外基質(zhì)降解、抗炎和抗血管生成等相關(guān)通路密切相關(guān)。由于當(dāng)前研究是基于數(shù)據(jù)庫的預(yù)測分析，研究結(jié)果有存在偏差的可能。后續(xù)研究需結(jié)合預(yù)測的靶點及通路，進一步通過實驗驗證千層紙素A抗椎間盤退變的具體機制。盡管如此，本研究仍為探討千層紙素A對于椎間盤退變治療作用的實驗及臨床研究提供了新方向。