萬(wàn)紅霞，毛小曉，江津津，王歡，陳慶

（廣州城市職業(yè)學(xué)院食品科學(xué)與美食養(yǎng)生學(xué)院，廣東 廣州 510405）

神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的再生修復(fù)與功能重建一直是神經(jīng)科學(xué)研究者亟待探索解決的重大課題。 與中樞神經(jīng)［1］相比，外周神經(jīng)結(jié)構(gòu)更為簡(jiǎn)單，且本身具有一定的再生能力，因此其被修復(fù)的潛力也更大。 當(dāng)前，臨床上對(duì)于周圍神經(jīng)缺損的治療方法主要分為以下幾類：對(duì)于短距離的神經(jīng)缺損，采用顯微外科手術(shù)將離斷的神經(jīng)對(duì)接后進(jìn)行端對(duì)端外膜縫合，可以恢復(fù)神經(jīng)功能；對(duì)于更為常見(jiàn)的長(zhǎng)距離神經(jīng)缺損（≥5mm），通常采用自體神經(jīng)移植或異體神經(jīng)移植進(jìn)行治療。 自體移植是神經(jīng)修復(fù)的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”，具有理想的修復(fù)效果，但存在供區(qū)神經(jīng)功能受損、取材長(zhǎng)度受限、神經(jīng)粘連、組織壞死等問(wèn)題，無(wú)法滿足長(zhǎng)距離的周圍神經(jīng)缺損修復(fù)［2］。而同種異體神經(jīng)移植雖然不受取材和距離的限制，卻存在倫理爭(zhēng)議和免疫排斥的問(wèn)題［3］。 近年來(lái)，人工神經(jīng)導(dǎo)管的出現(xiàn)為周圍神經(jīng)缺損提供了較好的修復(fù)方法，其不受倫理和損傷距離的限制，是周圍神經(jīng)修復(fù)的一種重要方式，目前越來(lái)越受到人們的關(guān)注［4］，具有廣闊的應(yīng)用前景。

絲素蛋白（Silk fibroin，SF）作為一種用于構(gòu)建人工神經(jīng)導(dǎo)管的天然高分子材料，是經(jīng)FDA 批準(zhǔn)可植入體內(nèi)的生物材料，它主要是從家養(yǎng)蠶絲中提取的，具有良好的生物相容性、機(jī)械性能且提取方便，免疫原性低，廉價(jià)安全，來(lái)源廣泛［5］。 過(guò)去幾十年絲素蛋白在周圍神經(jīng)修復(fù)中發(fā)揮了重要的作用，這種材料可以滿足人工神經(jīng)導(dǎo)管的抗扭結(jié)和耐縫合性等特點(diǎn)［6-7］。 而作為早在2001 年便開(kāi)始應(yīng)用的定向冷凍技術(shù)則使導(dǎo)管凝膠中所形成的微孔結(jié)構(gòu)有沿冷凍溫度梯度方向的取向，使導(dǎo)管內(nèi)壁具有定向排列的微孔，可以起到控制軸突生長(zhǎng)分布的特點(diǎn)。 因此，本文對(duì)近年來(lái)有關(guān)具有定向微孔結(jié)構(gòu)的絲素蛋白神經(jīng)支架的制備方法與對(duì)周圍神經(jīng)修復(fù)的作用進(jìn)行分析，指出潛在的不足并對(duì)絲素蛋白神經(jīng)導(dǎo)管的未來(lái)臨床應(yīng)用進(jìn)行展望。

一、絲素蛋白及其衍生物的生物學(xué)特性

絲素蛋白是一種從蠶絲中提取的天然高分子纖維蛋白，主要由輕鏈（26 kDa）和重鏈（390 kDa）組成，分子鏈中含有18 中氨基酸，其中大部分是甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸［8］。 在溶液中，絲素蛋白以無(wú)規(guī)則卷曲的構(gòu)型為主，但在一定外界因素作用下如溫度、濃度、pH 值等，無(wú)規(guī)則卷曲會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)槟芰康颓医Y(jié)構(gòu)穩(wěn)定的β-折疊構(gòu)象［9］，這些結(jié)構(gòu)使SF具有良好的機(jī)械性能和優(yōu)異的生物相容性，可以與新生組織形成相匹配的速度進(jìn)行降解，從而有利于組織再生和細(xì)胞外基質(zhì)的沉淀。

研究表明，絲素蛋白具有以下幾個(gè)特性：（1）良好的生物相容性。 絲素蛋白作為一種天然高分子物質(zhì)，具有良好的生物相容性。 Hu 等［10］通過(guò)靜電紡絲制備了一種絲素蛋白纖維支架，發(fā)現(xiàn)其能夠促進(jìn)雪旺細(xì)胞的粘附、生長(zhǎng)和增殖，具有良好的生物相容性。 （2） 有利于促進(jìn)組織再生。 Wei等［11］使用分光光度法和掃描電子顯微鏡分析絲素蛋白結(jié)構(gòu)和功能，首次在體外評(píng)估了絲素蛋白水凝膠神經(jīng)導(dǎo)管對(duì)活細(xì)胞的活性、生長(zhǎng)的影響，并通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜏y(cè)定其是否具有增強(qiáng)神經(jīng)再生的潛力，結(jié)果是積極樂(lè)觀的；Gu 等［12］使用由絲素和殼聚糖制備并經(jīng)過(guò)雪旺細(xì)胞種植的人工神經(jīng)導(dǎo)管修復(fù)周圍神經(jīng)缺損，結(jié)果顯示該神經(jīng)導(dǎo)管的再生修復(fù)效果接近自體神經(jīng)移植，表明該神經(jīng)導(dǎo)管具有良好的促進(jìn)外周神經(jīng)損傷后修復(fù)與再生的能力。 （3）孔隙率高和良好的生物降解性。 Meinel等［13］分別以絲素蛋白和膠原為原料制成軟骨修復(fù)支架，研究不同支架骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSC）黏附、增殖、代謝等行為的影響，研究發(fā)現(xiàn)hMSC 在緩慢降解的SF 支架上的黏附、增殖和代謝活性明顯優(yōu)于在快速降解的膠原支架上，而且hMSC 在SF支架上成軟骨程度比膠原支架更高，這是因?yàn)镾F支架具有高孔隙度、緩慢的生物降解和結(jié)構(gòu)完整性的緣故。 （4）具有抗炎、抗氧化以及止血等性能。 Rodriguez-Nogales 等［14］構(gòu)建了一種RGD 修飾的絲素納米顆粒（RGD-SFNs）用于炎癥性腸病的治療，結(jié)果顯示SFN 治療改善了結(jié)腸損傷，減少了中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，改善了結(jié)腸受損的氧化狀態(tài)；RGD-SFNs 處理的大鼠顯著降低促炎細(xì)胞因子（IL-1β，IL-6 和IL-12）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的表達(dá)，具有明顯的腸道抗炎特性。 Passi 等［15］通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SF 納米顆粒可以有效減少過(guò)氧化氫介導(dǎo)的氧化應(yīng)激引起的ROS 水平升高；Wei 等［16］通過(guò)構(gòu)建肝臟損傷的動(dòng)物模型得出SF 可有效止血的結(jié)論。 總而言之，這些研究表明SF 蛋白具有良好的生物相容性和生物活性，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

二、具有定向微孔絲素蛋白支架的制備方法

神經(jīng)導(dǎo)管是由天然的或者人工合成材料制成的具有特定立體結(jié)構(gòu)和生物活性的管狀結(jié)構(gòu)，可將斷裂神經(jīng)的遠(yuǎn)端殘端和近端殘端連接起來(lái)，承擔(dān)橋接體的角色并起到引導(dǎo)神經(jīng)生長(zhǎng)的作用。 神經(jīng)導(dǎo)管的結(jié)構(gòu)在神經(jīng)修復(fù)中發(fā)揮重要的作用，在神經(jīng)導(dǎo)管中引入拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)已經(jīng)被證明具有良好的促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)效果，目前對(duì)于神經(jīng)導(dǎo)管的內(nèi)部結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)多為模仿天然神經(jīng)的束狀解剖結(jié)構(gòu)，在神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)部構(gòu)建定向的有序孔道，例如溝槽型結(jié)構(gòu)、填充型結(jié)構(gòu)、多通道型結(jié)構(gòu)等，這些結(jié)構(gòu)可以為細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和遷移提供引導(dǎo)，促進(jìn)雪旺細(xì)胞的黏附和增殖，有利于軸突的再生。 因此，在神經(jīng)導(dǎo)管中引入具有方向性的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)被越來(lái)越多的研究者關(guān)注。

對(duì)于絲素蛋白基神經(jīng)導(dǎo)管，通過(guò)梯度冷凍，冷凍干燥，顆粒瀝濾或氣體泡沫作用的方法均可使絲素溶液形成三維多孔的海綿狀支架［17］。 為了賦予絲素蛋白支架良好的定向微孔結(jié)構(gòu)，在原來(lái)冷凍干燥方法的基礎(chǔ)上，利用定向冷凍的方法構(gòu)建定向結(jié)構(gòu)。 定向冷凍法目前已經(jīng)被廣泛運(yùn)用在仿生多孔結(jié)構(gòu)材料和組織工程中，簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，就是將混合溶液在固定的方向上進(jìn)行冷凍，從而將溶質(zhì)在晶層間沿著一定的方向生長(zhǎng)多孔排列的結(jié)構(gòu)，定向的微孔結(jié)構(gòu)可以促進(jìn)神經(jīng)軸突朝著指定的方向進(jìn)行生長(zhǎng)，為神經(jīng)再生提供拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)引導(dǎo)。 定向冷凍技術(shù)能夠形成微通道結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)能夠提供形貌和物理線索，可以較好地模擬神經(jīng)內(nèi)膜管的微通道。 Rao 等［18］使用定向梯度冷凍技術(shù)構(gòu)建了具有沿中軸縱向排列孔道的導(dǎo)管。 Hibbitts等［19］開(kāi)發(fā)出了一種快速冷卻冷凍工藝，使得所形成孔道的結(jié)構(gòu)與排列最適合軸突的再生。

在定向冷凍技術(shù)中，通過(guò)溫度梯度提供定向效果較為常用。 梯度冷凍可以使導(dǎo)管凝膠中所形成的微孔結(jié)構(gòu)有沿冷凍溫度梯度方向上的取向。這樣制備出來(lái)的基質(zhì)具有大量排列整齊的微孔，這些微孔可以控制軸突的分布和定向生長(zhǎng)。 具體技術(shù)過(guò)程是將金屬（不銹鋼或銅等）制成的板置于液氮中，再將裝有導(dǎo)管溶膠材料的模具置于金屬板上，這樣上下溫度不均一，形成了溫度上的梯度，導(dǎo)管溶膠中溶劑凍結(jié)的方向是單向的，冰晶將在特定的方向上生長(zhǎng)，從而形成單向氣孔。 如Zhang 等［20］利用溫度梯度定向冷凍技術(shù)構(gòu)建了具有定向多孔道結(jié)構(gòu)的絲素蛋白支架，與無(wú)定向結(jié)構(gòu)的絲素蛋白支架相比，具有定向多孔道結(jié)構(gòu)的絲素蛋白支架能夠顯著促進(jìn)海馬神經(jīng)元軸突沿多孔道方向定向生長(zhǎng)。 Asuncion 等［21］利用溫度梯度定向冷凍技術(shù)制備了絲素蛋白-明膠復(fù)合支架，發(fā)現(xiàn)BMSCs 在普通冷凍支架上散亂生長(zhǎng)，而在定向冷凍支架上沿定向孔道生長(zhǎng)。 Bhardwaj 等［22］以絲素蛋白作為原料，聯(lián)合梯度冷凍凝膠法制備了SF多孔結(jié)構(gòu)的支架，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)的冷凍干燥法相比，該技術(shù)制備的支架具有分布更均衡、極性更強(qiáng)、連通性更優(yōu)的微孔，且孔隙率可達(dá)90%。

三、具有定向微孔結(jié)構(gòu)的絲素蛋白支架對(duì)神經(jīng)細(xì)胞行為和功能的影響

（一）對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞黏附、遷移、增殖的影響

接觸引導(dǎo)理論認(rèn)為，神經(jīng)的連通性很大程度上取決于生長(zhǎng)中的再生軸突朝向其真正目標(biāo)的方向性。 如果再生軸突不能成功適當(dāng)伸長(zhǎng)，神經(jīng)就不會(huì)成熟，導(dǎo)致其長(zhǎng)期退化和功能喪失。 引導(dǎo)神經(jīng)軸突延伸和神經(jīng)元分化的一種有效方法是通過(guò)創(chuàng)建高度有序的微／納米結(jié)構(gòu)表面形貌，在細(xì)胞水平上提供物理支持和引導(dǎo)。 先前很多研究表明，神經(jīng)細(xì)胞能夠?qū)υS多取向結(jié)構(gòu)產(chǎn)生響應(yīng)，如通道和微溝槽形式的取向結(jié)構(gòu)能夠顯著增強(qiáng)細(xì)胞排列和神經(jīng)軸突生長(zhǎng)。 Shula 等［23］使用定向冷凍法制備了具有單軸線性孔的神經(jīng)引導(dǎo)支架，該支架可促進(jìn)PC12 細(xì)胞神經(jīng)軸突生長(zhǎng)。 Zhang 等［24］制備了具有定向脊和負(fù)載生物活性分子的多通道／層粘連蛋白絲素支架，研究發(fā)現(xiàn)再生軸突在通道方向上以有組織和線性的方式分布。 這些研究表明，具有特殊定向通道的神經(jīng)引導(dǎo)導(dǎo)管對(duì)于神經(jīng)損傷修復(fù)中軸突的延伸具有重要意義。

神經(jīng)修復(fù)支架的微孔尺寸也會(huì)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的行為產(chǎn)生影響。 理論上，為引導(dǎo)軸突再生而創(chuàng)建的支架應(yīng)該具有足夠小的孔，以物理對(duì)齊和限制軸突生長(zhǎng)的方向，但又足夠大以允許血管形成和支持再生的細(xì)胞浸潤(rùn)。 例如，Christopherson 等［25］發(fā)現(xiàn)納米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的尺寸會(huì)影響神經(jīng)元干細(xì)胞的分化；材料表面脊／溝圖案陣列可有效誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)元譜系，而無(wú)需使用任何分化誘導(dǎo)劑。 這可能是因?yàn)樵谕負(fù)浣Y(jié)構(gòu)引起的細(xì)胞形態(tài)變化期間，細(xì)胞骨架的伸長(zhǎng)導(dǎo)致張力傳遞到細(xì)胞核，影響基因表達(dá)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［26］。 此外，也有研究表明納米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)可以通過(guò)細(xì)胞骨架在細(xì)胞膜和核膜之間通過(guò)機(jī)械耦合使細(xì)胞核在納米尺度上變形，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞行為［27］。 對(duì)于周圍神經(jīng)修復(fù)用導(dǎo)管，基于神經(jīng)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，僅僅提供定向通道或脊／溝模式是不夠的，具有特殊定向多通道的支架將具有更大的神經(jīng)再生潛力。 有研究表明具有單向排列多孔微結(jié)構(gòu)的絲素蛋白支架可以有效調(diào)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞的行為，促進(jìn)神經(jīng)元分化［28］。

（二）對(duì)雪旺細(xì)胞成髓鞘的影響

雪旺細(xì)胞（SCs）在周圍神經(jīng)損傷后的軸突再生和修復(fù)中起著重要作用。 有研究發(fā)現(xiàn)，負(fù)載神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的絲素蛋白支架能夠促進(jìn)小鼠模型中SCs 的定向生長(zhǎng)、增殖和擴(kuò)散，以及周圍神經(jīng)再生和新生血管形成［29］。 此外，用靜電紡絲法制備的具有定向纖維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白支架也被證實(shí)了可以有效促進(jìn)雪旺細(xì)胞的粘附、增殖和遷移，并且能通過(guò)神經(jīng)突形成復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，從而幫助引導(dǎo)軸突的再生［30］。 Wang等［31］利用靜電紡絲技術(shù)構(gòu)建了絲素蛋白／聚左旋乳酸己內(nèi)酯納米纖維支架，研究其在4 周和8 周時(shí)對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)10 mm 缺損的修復(fù)效果，對(duì)再生神經(jīng)進(jìn)行電生理評(píng)估、組織學(xué)和免疫組織學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)具有平行排列結(jié)構(gòu)的納米纖維支架具有更好的再生神經(jīng)功能恢復(fù)且再生神經(jīng)更為成熟，雪旺細(xì)胞髓鞘化程度更高。

在病理生理學(xué)上，當(dāng)周圍神經(jīng)發(fā)生損傷時(shí)，軸突會(huì)出現(xiàn)損傷，雪旺細(xì)胞與遠(yuǎn)端殘端失去了接觸而出現(xiàn)脫髓鞘。 此時(shí)，雪旺細(xì)胞會(huì)大量增殖并定向排列，成熟后的雪旺細(xì)胞膜作為髓鞘的組成部分，為軸突的再生提供空間，從而促進(jìn)軸突的伸長(zhǎng)。 有關(guān)背根神經(jīng)節(jié)外植體的研究也發(fā)現(xiàn)，軸突的成熟與DRG 外植體中髓鞘的形成有關(guān)［32］。 絲素蛋白支架表面功能化各向異性微納拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)可通過(guò)Apelin 通路進(jìn)一步激活PI3K-Akt 和磷脂酰肌醇信號(hào)通路，通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)SCs 的增殖、分化以及促進(jìn)SCs 的取向和DRG 的軸突延伸［33］。 這些研究均顯示，具有定向微孔結(jié)構(gòu)的絲素蛋白支架在募集雪旺細(xì)胞，促進(jìn)雪旺細(xì)胞成熟、成髓鞘方面具有優(yōu)異的表現(xiàn)，表明了具有定向微孔結(jié)構(gòu)的絲素蛋白神經(jīng)導(dǎo)管在周圍神經(jīng)修復(fù)領(lǐng)域上具有較好的應(yīng)用潛力。

四、展望

綜上所述，絲素蛋白是一種制備神經(jīng)導(dǎo)管的合適材料，能夠?yàn)橹車窠?jīng)損傷修復(fù)提供優(yōu)良橋接體。 但是，單一的絲素蛋白材料存在降解速度慢的問(wèn)題，通過(guò)將絲素蛋白與其他天然高分子或者合成高分子材料復(fù)合可以調(diào)節(jié)絲素蛋白在體內(nèi)的降解速度，使其與組織再生速度相匹配，所以將絲素蛋白與其他材料復(fù)合成為神經(jīng)導(dǎo)管材料研究的熱門，如將絲素蛋白與膠原復(fù)合，構(gòu)建膠原／絲素蛋白導(dǎo)管有望成為未來(lái)修復(fù)周圍神經(jīng)損傷的理想人工神經(jīng)導(dǎo)管。 同時(shí)，為了提高絲素蛋白支架的促神經(jīng)再生能力，對(duì)絲素蛋白進(jìn)行表面功能化修飾如RGD 修飾等，或負(fù)載神經(jīng)細(xì)胞因子、富血小板血漿（PRP）、外泌體等，或者通過(guò)復(fù)合壓電材料、導(dǎo)電材料賦予絲素蛋白神經(jīng)導(dǎo)管良好的電活性，這些方法都可以有效提升絲素蛋白神經(jīng)導(dǎo)管的促周圍神經(jīng)修復(fù)的能力。 此外，對(duì)于絲素蛋白基導(dǎo)管的內(nèi)部結(jié)構(gòu)的仿生化構(gòu)建依然是一個(gè)研究的重點(diǎn)，選擇不同分子量和不同超微結(jié)構(gòu)的絲素蛋白，利用定向梯度冷凍技術(shù)并聯(lián)合物質(zhì)填充、納米纖維仿生技術(shù)、靜電紡絲技術(shù)、3D 打印技術(shù)等改善神經(jīng)導(dǎo)管結(jié)構(gòu)，最大限度還原組織再生的微結(jié)構(gòu)，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞黏附和定向遷移以及引導(dǎo)神經(jīng)軸突定向生長(zhǎng)，改善再生神經(jīng)的功能，從而構(gòu)建具有良好修復(fù)效果的功能化神經(jīng)導(dǎo)管。 這樣的導(dǎo)管市場(chǎng)應(yīng)用前景廣闊，可緩解我國(guó)神經(jīng)修復(fù)材料嚴(yán)重不足和部分依賴歐美進(jìn)口的局面。