廖小妹，陳美麗，王璽舜，唐博翔，何文智*

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬長沙市中醫(yī)醫(yī)院，湖南 長沙 410002

非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）是以肝細(xì)胞脂肪變性、蓄積，炎癥性壞死為病理特征，以炎癥反應(yīng)、胰島素抵抗（insulin resistance,IR）為病理機(jī)制，無過量飲酒史的臨床綜合征。NAFLD 作為一種潛在的進(jìn)行性肝病，有25%左右的脂肪變性發(fā)展為肝臟炎癥并進(jìn)展為非酒精性脂肪性肝炎[1]，持續(xù)的肝損傷和細(xì)胞死亡將導(dǎo)致纖維化，最終導(dǎo)致肝硬化和肝癌[2-3]，并且在早期一般不具有臨床治療指征。 目前，疾病發(fā)展過程中得到普遍肯定的NAFLD 發(fā)病機(jī)制是“多次打擊”學(xué)說，它闡述其基本表現(xiàn)為由肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯(triglyceride, TG)的蓄積，逐漸過渡成肝組織壞死性炎癥和纖維化，進(jìn)行性發(fā)展為肝硬化和肝癌，成為NAFLD患者致死的主要因素[4]。 減少炎癥反應(yīng)、降低肝細(xì)胞損害程度、促進(jìn)患者肝功能恢復(fù)、提高生活質(zhì)量是臨床研究NAFLD 的目標(biāo)[5]。目前，治療該疾病主要包括生活方式干預(yù)、手術(shù)、輔助藥物等[6-8]，雖有一定的治療效果[9]，但長期服用效果不佳、肝毒性較大，停藥后的反彈現(xiàn)象使其臨床依從性差[10]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為NAFLD 是膏粱厚味誘發(fā)，導(dǎo)致濕、痰、瘀互結(jié)的病理因素[11]。 中醫(yī)藥治療疑難雜癥，數(shù)千年來積累了很多有效的治療手段。 臨床中醫(yī)運(yùn)用辨證治療NAFLD[12]，針灸[13]、推拿[14]、穴位埋線[15]等治法，均獲得較好療效，中醫(yī)藥治療作用溫和、成本低、治療依從性高等優(yōu)勢，尤其適用于需長期治療的慢性代謝性疾病[16]。綜上所述，臨床更期待從傳統(tǒng)中藥組方中尋找新的NAFLD 治療方法。

加味消脂利肝方是臨床醫(yī)家在丹梔逍遙散及保和丸基礎(chǔ)上加減化裁而組成，具有疏肝解郁、消脂利肝的功效。 前期臨床研究中，明確了丹梔逍遙散降脂的有效性，療效顯著，安全性高[17]。 加味消脂利肝方疏肝軟堅，健脾消積，解毒散瘀；方中黃連抗炎、降血脂、解熱，并通過抑制神經(jīng)氨酸苷酶進(jìn)而影響脂肪變性[18]，屬于NAFLD 臨床辨證用方君藥之一。 但該藥方的藥效作用機(jī)制尚不明確，活性成分及靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)性未知。 基于此，本研究擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探索加味消脂利肝方干預(yù)NAFLD 的機(jī)制，為加味消脂利肝方的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，同時實驗驗證加味消脂利肝方治療NAFLD 的療效。

1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

1.1 加味消脂利肝方藥物靶點(diǎn)篩選

借助TCMSP收集加味消脂利肝方各中藥的化學(xué)成分[19]。設(shè)定口服生物利用度≥30%、類藥性≥0.18[20]為TCMSP 數(shù)據(jù)庫的篩選條件，獲得活性成分及作用靶點(diǎn)后，將化合物作用的靶點(diǎn)轉(zhuǎn)化為UniProt 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫標(biāo)準(zhǔn)化的靶點(diǎn)，限定物種為“Homo sapiens”。

1.2 非酒精性脂肪肝疾病靶點(diǎn)庫建立

用“Non alcoholic fatty liver disease”“Non-alcoholic fatty liver disease”“NAFLD”為疾病關(guān)鍵詞，通過GeneCards、OMIM 數(shù)據(jù)庫篩選NAFLD 的潛在靶點(diǎn)。 在GeneCards 數(shù)據(jù)庫中，Score 值和該靶點(diǎn)與疾病聯(lián)系成正相關(guān)， 選取相關(guān)性分?jǐn)?shù)＞5 的靶點(diǎn)，取兩個數(shù)據(jù)庫信息的并集，建立疾病靶點(diǎn)庫。

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction, PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

疾病與藥方靶點(diǎn)取交集并繪制韋恩圖，并提交至STRING 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)模型[21]，生物種類設(shè)定為“Homo sapiens”，最小互相作用閾值設(shè)定為“highest confidence”（＞0.9），獲得PPI 網(wǎng)絡(luò)，并通過Cytoscape 3.9.0 中的MCODE 插件對PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步分析獲取關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.4 基因本體（gene ontology, GO）分析與京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG）通路富集分析

應(yīng)用MetaScape 數(shù)據(jù)平臺對加味消脂利肝方與NAFLD 交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO、KEGG 通路富集分析。

2 實驗驗證

2.1 材料

2.1.1 動物 SPF 級SD 大鼠，體質(zhì)量(200±20) g，由湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司出售，實驗動物許可證SYXK(湘)2019-0009，湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)倫理編號：XMBH-202110290006。

2.1.2 儀器 Motic 顯微鏡（北京榮興光恒科技有限公司，貨號：BA210T）；SQ2125 石蠟切片機(jī)（金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司，貨號：YD-315）；包埋機(jī)（常州市中威電子儀器有限公司，貨號：BMJ-A）；蓋玻片（貨號：DY89-1）、載玻片（貨號：AY89-2）均購自海門市遠(yuǎn)泰實驗器材廠；全自動樣品快速研磨儀（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司，貨號：JXFSTPRP-48）；PVDF膜（上海玉博生物科技有限公司，貨號：IPVH00010）。

2.1.3 藥物 加味消脂利肝方組成：黃連6 g，柴胡30 g，生白芍10 g，廣郁金15 g，莪術(shù)10 g，山楂10 g，丹參10 g，大黃15 g，炒枳殼10 g，澤瀉10 g，炒白術(shù)15 g，茯苓15 g（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房購買，批號：2110001S、2105004S、2108003S、2104001S、2108005W、2109003S、2109004S、2108017W、2108007C、2109008S、2106028C、2110011C)。 辛伐他汀（成都恒瑞制藥有限公司，批號：211005）。

2.1.4 試劑 血清ALT、AST、TG、TC、HDL-C、LDL-C采用ELISA 試劑盒檢測（廠家：南京建成生物工程研究所有限公司，批號：20220512、20220511、20220513、20220512、20211225、20211225）；中性樹脂（長沙艾碧維生物科技有限公司，批號：20220206）；蘇木素伊紅染色液（長沙艾碧維生物科技有限公司，批號：01A20211223）；PBS（長沙艾碧維生物科技有限公司，批號：20220111）。

2.2 方法

2.2.1 造模及藥物制備 NAFLD 模型：利用HFD誘導(dǎo)法造模[22]：持續(xù)高脂飼料（高脂飼料配方：普通飼料70%，1%膽固醇，10%豬油，10%蔗糖）喂養(yǎng)6周后，隨機(jī)選取4 只解剖，觀察大鼠肝臟脂肪變，判斷模型建立是否成功。 將中藥飲片按劑量比例稱取156 g，水煎煮3 次，每次1 h，合并3 次煎煮濾液，濃縮至200 mL，即加味消脂利肝方生藥濃度0.78 g·mL-1。

2.2.2 分組及給藥 采用SPSS 25.0 以簡單隨機(jī)抽樣法將大鼠分為空白組（n=5），模型組（n=5），加味消脂利肝方低、中、高劑量組（n=5），陽性藥組（辛伐他汀組，n=5）。按大鼠體質(zhì)量每100 g 灌胃1 mL 計算，每天上午加味消脂利肝方低、中、高劑量組分別給予3.9、7.8、15.6 g·kg-1加味消脂利肝方灌胃，陽性藥組給予0.15 mg·kg-1辛伐他?。ò大w質(zhì)量70 kg成人每天10 mg 計算）。 空白組、模型組給予同體積生理鹽水灌胃。 各組均灌胃2 周。

2.2.3 血清脂質(zhì)指標(biāo)及肝功能指標(biāo)檢測 于8 周末實驗結(jié)束后腹主動脈取血，常溫下靜置血液1 h，后離心取上清液，用于測定各組大鼠血清TG、TC、HDL-C、LDL-C、ALT、AST 水平。

2.2.4 HE 染色 實驗結(jié)束后取材，心臟灌注，取肝臟以多聚甲醛固定用于病理染色，將固定的肝組織脫水，石蠟包埋。60 ℃烤片12 h。切片脫蠟至水：先將切片3 次置于二甲苯中，每次20 min，然后依次置于100%、95%、85%、75%乙醇中5 min。 再用蒸餾水浸洗5 min，蘇木素染5 min，蒸餾水沖洗，PBS 返藍(lán)，伊紅染5 min，蒸餾水沖洗，梯度乙醇（95%～100%）脫水，每級5 min（或者直接把切片烤干）。取出后置于二甲苯10 min，2 次，中性樹膠封片，顯微鏡觀察和記錄細(xì)胞形態(tài)的變化。

2.2.5 統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，兩組或多組數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析或秩和檢驗。 P＜0.05 代表差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果

3.1.1 加味消脂利肝方的潛在活性成分及靶點(diǎn) 通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索到加味消脂利肝方的化學(xué)成分1263 個。 通過篩選條件，最終得到加味消脂利肝方的潛在活性成分168 個。 經(jīng)TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索，得到作用靶點(diǎn)996 個，合并后刪除重復(fù)值，得到靶點(diǎn)258 個。將加味消脂利肝方所含的12 味中藥及預(yù)測的258 個相關(guān)靶點(diǎn)蛋白，利用Cytoscape 3.9.0 軟件中的功能對其進(jìn)行分析，構(gòu)建“中藥-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)及可視化。 詳見圖1。

圖1 加味消脂利肝方“中藥-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

3.1.2 NAFLD 疾病靶點(diǎn)的獲取 從GeneCards、OMIM 數(shù)據(jù)庫搜索，得NAFLD 靶點(diǎn)2652 個，合并去重后共得到2552 個NAFLD 疾病靶點(diǎn)。 運(yùn)用Venny平臺將潛在活性成分的作用靶點(diǎn)與NAFLD 疾病靶點(diǎn)合并后取交集，最終獲得148 個加味消脂利肝方治療NAFLD 的潛在靶點(diǎn)。 詳見圖2。

圖2 加味消脂利肝方靶點(diǎn)-NAFLD 靶點(diǎn)韋恩圖

根據(jù)以上信息篩選得到33 個加味消脂利肝方治療NAFLD 的活性成分（表1）。其中君藥預(yù)測得到22 個活性成分，包括黃連3 個、柴胡5 個、丹參8個、大黃6 個；臣藥篩選得到活性成分11 個，包括白芍4 個、郁金2 個、莪術(shù)1 個、山楂葉4 個；佐使藥預(yù)測得到12 個活性成分，包括枳殼5 個、澤瀉3 個、白術(shù)3 個、茯苓1 個。

表1 加味消脂利肝方治療NAFLD 的活性成分

3.1.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果 將148 個潛在靶點(diǎn)信息錄入STRING 平臺構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)。 設(shè)最低要求交互分?jǐn)?shù)：最高置信度為0.900，結(jié)果顯示，該網(wǎng)絡(luò)一共含有靶蛋白節(jié)點(diǎn)數(shù)132 個。詳見圖3。將上述結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0 中進(jìn)行關(guān)鍵靶點(diǎn)分析，根據(jù)MCC 方法選取的加味消脂利肝方治療NAFLD 的關(guān)鍵靶點(diǎn)，預(yù)測關(guān)聯(lián)系數(shù)前10 的靶點(diǎn)為核心靶點(diǎn)。 詳見圖4。

圖3 靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 靶點(diǎn)PPI 關(guān)鍵靶點(diǎn)預(yù)測

3.1.4 GO 分析與KEGG 通路富集分析結(jié)果 對篩選得到的148 個NAFLD 靶點(diǎn)進(jìn)行GO、KEGG 通路分析。 根據(jù)P＜0.01 篩選出2105 條GO 分析結(jié)果，包括生物過程（biological process, BP）1846 個、細(xì)胞組分（cellular component, CC）97 個、分子功能（molecular function, MF）162 個。 根據(jù)靶點(diǎn)富集數(shù)目進(jìn)行篩選，運(yùn)用在線生物網(wǎng)站繪制排名前10 的結(jié)果。 詳見圖5。 同時，以P＜0.01 作為條件進(jìn)行篩選，共富集得到198 條通路，并篩選出靶點(diǎn)富集數(shù)目排名前20 的結(jié)果[23]。 詳見圖6。 分析結(jié)果表明，加味消脂利肝方治療NAFLD 的作用靶點(diǎn)涉及的通路有PI3KAkt 信號通路、MAPK 信號通路、TNF 信號通路、NFκB 通路等。

圖5 GO 分析圖

圖6 KEGG 通路分析富集氣泡圖

3.2 加味消脂利肝方對NAFLD 大鼠模型的作用

3.2.1 模型判定 空白組大鼠肝臟顏色呈均勻紅褐色，邊緣銳利，質(zhì)軟。模型組肝臟體積增大，顏色呈暗土黃色，邊緣圓鈍，包膜緊張，質(zhì)地變脆。 詳見圖7。3.2.2 血清指標(biāo)檢測結(jié)果 模型組血清TG、TC、LDL-C、ATL、AST 水平明顯高于空白組（P＜0.05 或P＜0.01）、HDL-C 水平低于空白組（P＜0.01）。 治療2 周后，與模型組相比，加味消脂利肝方中劑量組血清TG、TC、LDL-C、ATL、AST 水平降低（P＜0.05）， 血清HDL-C 水平升高（P＜0.05）；陽性藥組血清TG、TC、LDL-C、ATL、AST 水平降低（P＜0.05），血清HDL-C水平升高（P＜0.05）。 詳見圖8。

圖7 大鼠肝臟肉眼觀察圖

圖8 各組大鼠血清指標(biāo)

3.2.3 加味消脂利肝方對SD 大鼠肝組織病理學(xué)的影響 與空白組比較，模型組肝臟可見內(nèi)脂滴性空泡及炎癥性浸潤。 與模型組相比，加味消脂利肝方低、中、高組肝臟內(nèi)脂滴性空泡顯著減少，陽性藥組的脂肪變性及炎癥壞死明顯改善。 詳見圖9。

圖9 SD 大鼠肝組織HE 染色結(jié)果（×400）

4 討論

隨著生活飲食習(xí)慣的改變，我國慢性代謝性肝臟疾病發(fā)病率不斷上升，因肝臟炎癥性壞死，脂肪變性造成肝功能損傷最終導(dǎo)致的肝纖維化、肝硬化逐年增加，尤其是中老年更為嚴(yán)重，長期治療使患者承受了極大的心理和經(jīng)濟(jì)壓力[24]。 NAFLD 的全球患病率為25%，據(jù)報道，南美洲為30.45%、亞洲為27.37%、北美洲為24.13%、歐洲為23.71%、非洲為13.48%，其中，中東地區(qū)的患病率最高，為31.79%[25-26]，患病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢。 研究證明肝脂肪沉積是NAFLD 的重要病理改變，其病理改變具有可逆性，常可通過改變生活方式緩解，然而早期NAFLD無特異性診治手段，改變生活方式對患者挑戰(zhàn)性大，因此臨床重點(diǎn)探索潛在的治療藥物[26]。

中醫(yī)學(xué)將脂肪肝歸屬于“脅痛”“積聚”“濕濁”等病的范疇，其發(fā)病可由飲食失調(diào)、過食肥甘厚味、缺少運(yùn)動以及情志所傷引起，本虛標(biāo)實，肝郁為發(fā)病關(guān)鍵環(huán)節(jié)，脾虛為病機(jī)，痰瘀互阻為主要病理因素貫穿疾病始終[27]，臨床中醫(yī)治療以張仲景“見肝之病，知肝傳脾，當(dāng)先實脾”的理論為基礎(chǔ)[28]，中藥方以調(diào)肝兼理脾藥為主。 近年來，隨著飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變，不同患者表現(xiàn)出的疾病征象不盡相同[29]，因此，NAFLD 的早期篩查有利于及時發(fā)現(xiàn)疾病并延緩疾病的進(jìn)展，符合中醫(yī)學(xué)“治未病”理論[30]。

本實驗分析發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，加味消脂利肝方中劑量組TG、TC、LDL-C 水平降低（P＜0.05），HDLC 水平升高（P＜0.05），肝功能ALT、AST 水平改善（P＜0.05），加味消脂利肝方能明顯改善大鼠血清血脂及肝功能，肝臟組織病理得到明顯改善，為后續(xù)進(jìn)一步實驗驗證提供了部分基礎(chǔ)，而改善脂質(zhì)指標(biāo)及肝功能指標(biāo)未成劑量依賴性，可能與肝臟代謝功能受損，無法代謝高濃度藥量有關(guān)，但其肝組織病理學(xué)改變有一定劑量變化趨勢，其結(jié)果具有臨床意義。

對于中藥治療NAFLD 作用機(jī)制，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以較好的預(yù)測[31]。 有研究表明，TCMSP 篩選結(jié)果中活性成分小檗堿已被用于治療代謝綜合征，尤其是通過調(diào)節(jié)腸道菌群治療NAFLD[32]。 小檗堿增加了SCFA 誘導(dǎo)的細(xì)菌增殖，并降低了肥胖和瘦素水平，增加了胰島素敏感性和脂聯(lián)素水平，增加益生菌雙歧桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量。同時小檗堿[33]降低NAFLD肝細(xì)胞活性、IL-6 和TNF 水平[34]，下調(diào)NF-κB活 性，抑制肝臟炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生[35]。 柚皮素可通過EGFRPI3K-Akt/ERK-MAPKinase 通 路，降低NF-κB 活性、抑制肝臟炎癥反應(yīng)[36]，同時，山柰酚可通過抑制Tyk-STAT 信號通路，改善炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的代謝性疾病[37]。

IL-6、TNF、IL-4、IL-10 等炎癥因子誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[38]是NAFLD 發(fā)生發(fā)展中導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變性、脂肪蓄積后肝組織壞死性炎癥和纖維化不可逆轉(zhuǎn)的損傷，引起肝功能受損的物質(zhì)基礎(chǔ)[39]，尤其IL-6 作為一種重要的炎癥因子和脂肪因子，可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生IR[40]。 IL-6、TNF-α 的水平增高是導(dǎo)致疾病發(fā)生的一個重要因素，槲皮素濃度與巨噬細(xì)胞中膽固醇外流和ABCA1 mRNA 及其蛋白質(zhì)的表達(dá)呈正相關(guān)[41]，槲皮素能減輕腸道損傷、改善腸屏障完整性、調(diào)控腸道菌群[32]，進(jìn)而改善脂質(zhì)代謝[42]。 木犀草素能降低巨噬細(xì)胞中總膽固醇水平，并改善脂質(zhì)代謝和抑制炎癥反應(yīng)[43]，這些活性物質(zhì)是中藥方中的常見成分，預(yù)期對疾病治療效果與實驗結(jié)果相互印證。

綜上所述，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合實驗研究，對加味消脂利肝方治療NAFLD 的作用機(jī)制進(jìn)行預(yù)測，證實了加味消脂利肝方發(fā)揮了治療NAFLD 的作用，且具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的作用機(jī)制特征。目前實驗研究進(jìn)一步論證其分子機(jī)制，加味消脂利肝方中君藥黃連含有活性成分小檗堿，小檗堿作為影響腸道菌群治療代謝性疾病的主要活性成分，抑制炎癥因子改變腸道菌群進(jìn)而治療NAFLD，為后續(xù)實驗驗證加味消脂利肝方治療NAFLD 的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供一定的思路，其中腸道菌群在加味消脂利肝方治療NAFLD 中發(fā)揮的作用，期待試驗的進(jìn)一步驗證。