鄭景丹,金 星,萬 朋,邱德來,金文哲

(延邊大學附屬醫(yī)院1. 藥劑科、2. 疼痛科,吉林 延吉 133000;3. 吉林醫(yī)藥學院基礎醫(yī)學院生理學與病理生理學教研室,吉林 吉林 132013)

依托咪酯(etomidate,ET)是一種作用強,且在臨床麻醉中得到廣泛應用的短效非巴比妥類靜脈麻醉藥,其麻醉機制與抑制多個腦區(qū)神經(jīng)元活動與突觸傳遞環(huán)路功能有關。ET抑制在體小鼠小腦浦肯野細胞放電活動,下調(diào)顆粒細胞感覺信息傳遞,提示ET影響小鼠小腦皮層神經(jīng)環(huán)路突觸傳遞長時程可塑性,但其影響機制尚不清楚。因此,本研究應用在體細胞貼附式技術結合神經(jīng)藥理學手段,研究ET對在體小鼠小腦皮層分子層中間神經(jīng)元-浦肯野細胞(molecular layer interneuron-Purkinje cell,MLI-PC)突觸可塑性的影響,探討其影響的受體機制與信號通路途徑,為闡明ET影響小腦皮層神經(jīng)環(huán)路的突觸機制提供可靠的實驗基礎及理論依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物HA/ICR小鼠32只,♀或♂,購自延邊大學實驗動物中心,許可證號:SYXK (Ji) 2011-006。小鼠飼養(yǎng)在(23±1)℃、濕度(50±5)%環(huán)境中,在12 h光照和12 h黑暗循環(huán)下,自由獲取食物和水。

1.2 藥物與試劑ET、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)A型受體阻斷劑SR95531、大麻素1型受體(cannabinoid receptor type 1,CB1)阻斷劑AM251、蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)抑制劑H-89、腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase,AC)激動劑Forskolin,均購自Sigma-Aldrich公司。所有藥物與試劑全部溶解在人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid,ACSF)中,通過蠕動泵(0.5 mL·min-1)灌注于小腦表面。

1.3 儀器Picospritzer Ⅲ微量噴射器(Park,美國)、Multi-clamp700B雙通道膜片鉗放大器(Molecular Devices,美國)、體視顯微鏡及膜片鉗專用顯微鏡(Nikon,日本)、SSC-G213數(shù)字圖像系統(tǒng)(索尼中國廣東有限公司)、MP-385電動微操縱器(Sutter,美國)、Clampex10.4數(shù)據(jù)采集與分析軟件(Molecular Devices,美國)、1440AD/DA轉換器(Molecular Devices,美國)。

2 方法

2.1 動物模型的制備模型制備方法依據(jù)參考文獻[1-2]進行,將1.3 g·kg-1的烏拉坦腹腔注射進行麻醉,同時植入并固定好自制氣管導管,之后在特制的腦立體定位儀上將小鼠妥善固定,使用兩側耳棒穩(wěn)定頭部,開顱手術在小腦CrusⅡ小葉以1～1.5 mm開孔直徑進行,在顯微鏡下同時固定小鼠和腦立體定位儀,明確需要記錄的部位并進行電生理記錄。

2.2 細胞貼附式記錄依照參考文獻[2]的記錄方法,小腦浦肯野細胞使用Multi-clamp700B膜片鉗放大器進行細胞貼附式記錄。用自動電極拉制儀將細玻璃管拉制成記錄電極。通過移液槍將ACSF注入記錄電極內(nèi),記錄電極電阻為3～5 MΩ。緩慢刺入軟腦膜下200～300 μm,徑直抵達浦肯野細胞層,浦肯野細胞有規(guī)律的簡單峰電位放電和不規(guī)律的復雜峰電位放電,根據(jù)其特點找到浦肯野細胞。吹風刺激(10 ms,60 psi)穩(wěn)定10 min后,小腦表面灌流相關藥物與試劑,記錄并分析所有實驗數(shù)據(jù)。

2.3 統(tǒng)計學分析應用Clampfit 10.4軟件分析電生理學數(shù)據(jù),所有的數(shù)據(jù)采用mean±SEM表示,同時應用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析(post hoc multiple comparison)檢驗,檢驗水準α=0.05。

3 結果

3.1 1 Hz的面部感覺刺激誘發(fā)小腦皮層MLI-PC長時程壓抑(long-term depression,LTD)在浦肯野細胞貼附式記錄模式下,吹風刺激(10 ms,60 psi)小鼠同側觸須墊,可以誘發(fā)小腦皮層CrusⅡ區(qū)的浦肯野細胞,產(chǎn)生一系列電位反應,表現(xiàn)為負極性波(N1)和正極性波(P1),并伴有簡單峰電位放電活動的暫停,加入GABAA受體阻斷劑SR95531(GABAzine,20 μmol·L-1)后,P1消失,反轉成動作電位,表明面部吹風刺激誘發(fā)的P1為MLI-PC的GABA能突觸傳遞。

給予1 Hz(240 pulse)的感覺刺激后,導致刺激后的P1振幅明顯減小(n=8,P<0.05),并伴有簡單峰電位放電暫停時間明顯增加,可持續(xù)50 min以上,表明1 Hz的面部吹風刺激可以誘發(fā)MLI-PC LTD。

3.2 ET對1Hz面部吹風刺激誘導的MLI-PC突觸可塑性影響在小腦表面持續(xù)灌流低濃度的ET(10 μmol·L-1)的條件下,給予1 Hz(240 pulse)的感覺刺激后,導致1 Hz的面部吹風刺激誘發(fā)的MLI-PC LTD明顯增強(n=8,P<0.05),40～50 min后,P1的振幅較ACSF組明顯增加(n=8,P<0.05),簡單峰電位放電暫停時間明顯減少。

3.3 CB1受體阻斷劑存在下ET對吹風刺激誘發(fā)MLI-PC突觸可塑性的影響在CB1阻斷劑(AM251)存在下,給予1 Hz(240 pulse)的感覺刺激不能誘發(fā)MLI-PC LTD,40～50 min后,P1的振幅較刺激前無明顯變化(n=8,P>0.05),表明1 Hz面部吹風刺激誘發(fā)的MLI-PC LTD依賴于CB1受體。在AM251和ET共同存在下,1 Hz(240 pulse)的感覺刺激依然不能誘發(fā)MLI-PC LTD,40～50 min后,P1的振幅無明顯變化(n=8,P>0.05),表明在阻斷CB1依賴的MLI-PC LTD后,ET的存在不能介導1 Hz面部刺激誘導產(chǎn)生LTD。

3.4 應用Forskolin情況下ET對吹風刺激誘發(fā)MLI-PC突觸可塑性的影響應用PKA抑制劑H-89孵育30 min,給予1 Hz(240 pulse)的感覺刺激不能誘發(fā)MLI-PC LTD,40～50 min后,P1的振幅較刺激無明顯變化(n=8,P>0.05),表明1 Hz面部吹風刺激誘發(fā)的MLI-PC LTD依賴于PKA信號通路。在PKA和ET共同存在下,1 Hz(240 pulse)的感覺刺激依然不能誘發(fā)MLI-PC LTD,40～50 min后,P1的振幅無明顯變化(n=8,P>0.05),表明在阻斷PKA依賴的MLI-PC LTD后,ET的存在不能促進1 Hz面部刺激產(chǎn)生LTD,提示ET增強1 Hz面部吹風刺激誘發(fā)的MLI-PC LTD通過PKA信號通路。進一步研究發(fā)現(xiàn),應用腺苷酸環(huán)化酶(AC)激動劑Forskolin,可以再現(xiàn)1 Hz(240 pulse)的感覺刺激誘發(fā)的MLI-PC LTD及ET對該LTD的增強作用。

4 討論

在過去幾十年里,平行纖維-浦肯野細胞通路作為興奮性突觸傳遞及可塑性已被廣泛研究,而MLI-PC抑制性突觸傳遞與長時程可塑性的研究較少。最近的實驗證據(jù)表明,MLIs對浦肯野細胞活動的控制也起著重要作用,Bing等[3]研究表明,MLI-PC突觸的GABA能LTD可以被CB1受體阻斷劑阻斷,并可被CB1受體激動劑藥理學誘導產(chǎn)生。阻斷代謝型谷氨酸受體1不影響1 Hz面部感覺刺激誘導MLI-PC LTD,然而,拮抗N-甲基-D天門冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid,NMDA)受體完全阻斷1Hz面部感覺刺激誘導的MLI-PC LTD,表明1Hz感覺刺激誘發(fā)的MLI-PC LTD依賴于NMDA和CB1受體。本研究結果表明,低濃度的ET可以明顯增強1 Hz面部刺激誘發(fā)的MLI-PC LTD,在阻斷CB1依賴的MLI-PC LTD后,ET的存在不能介導1 Hz面部刺激誘導產(chǎn)生LTD,表明ET強化1 Hz面部吹風刺激誘發(fā)的MLI-PC LTD也依賴于CB1受體。

Pan等[1]研究表明,即使特異性GABAA受體拮抗劑存在,ET依舊能使小腦顆粒細胞層中面部刺激引起的反應被抑制,印證小腦皮層顆粒細胞層面部刺激引發(fā)的反應被ET抑制并非完全是由GABAA受體的激活實現(xiàn)。在GABAA受體活性被阻斷時,ET對小腦顆粒細胞層中面部刺激引起的場電位反應的抑制由PKA信號通路激活CB1受體完成。而我們前期研究發(fā)現(xiàn),拮抗GABAA受體后,ET不能使小鼠小腦皮層平行纖維到浦肯野細胞的興奮性傳入增強,說明ET對小腦皮層分子層感覺信息處理的調(diào)節(jié)是通過對GABAA受體的調(diào)節(jié)實現(xiàn)的[2]。本研究結果顯示,抑制PKA可以阻斷MLI-PC LTD,并消除ET對MLI-PC LTD的作用;激動AC可以再現(xiàn)MLI-PC LTD及其對MLI-PC LTD的增強作用,表明ET對面部吹風刺激誘發(fā)的MLI-PC LTD依賴于PKA信號通路實現(xiàn)。

綜上所述,1 Hz的面部吹風刺激可誘發(fā)MLI-PC LTD,而ET對MLI-PC LTD有明顯強化作用,其作用依賴于CB1受體和PKA信號通路,提示低濃度ET影響MLI-PC可塑性的誘導和維持過程。