張 琰,劉佳悅,吳梅金,周家豪,刁洪秀

(福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院),福建省畜禽病原感染與免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福州 350002)

腫瘤性疾病是獸醫(yī)臨床常見的重大疾病,嚴(yán)重危害動(dòng)物生命健康,據(jù)統(tǒng)計(jì),進(jìn)行尸檢的動(dòng)物中有23%死于癌癥[1]。犬作為主要的伴侶動(dòng)物,老齡化程度不斷加重,腫瘤性疾病的發(fā)生也呈上升趨勢,腫瘤惡性程度越高,其危害也就越大,現(xiàn)已成為威脅中老年犬生命健康的主要原因之一,研究發(fā)現(xiàn)10歲及以上的老年犬有45%死于癌癥[2],同時(shí)癌癥也成為41%伴侶動(dòng)物主人最關(guān)心的健康問題[3]。腫瘤的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜,隨著研究不斷深入,非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要調(diào)控作用逐漸凸顯出來。基因組RNA是存在于蛋白質(zhì)之間的信使,絕大多數(shù)RNA分子并不編碼蛋白質(zhì),只有2%左右的基因序列編碼RNA,所占比例不到總RNA的5%,其余均為ncRNA[4-5]。近年來研究發(fā)現(xiàn),ncRNA與腫瘤的關(guān)系較為復(fù)雜,ncRNA不但參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,也參與腫瘤轉(zhuǎn)移的調(diào)控,是一類在腫瘤研究領(lǐng)域中值得關(guān)注的生物分子,特別是微小RNA (microRNA, miRNA)和長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA),無論是在人腫瘤還是犬腫瘤中,其對(duì)腫瘤基因表達(dá)的調(diào)控都為腫瘤診斷和治療提供新的方向。本文圍繞近年miRNA和lncRNA在犬常見腫瘤診斷、預(yù)后評(píng)估等方面的新進(jìn)展進(jìn)行綜述,為犬腫瘤的診斷和治療提供新思路。

1 非編碼RNA的概述

ncRNA按長度大于或小于200個(gè)核苷酸(nucleotide, nt)可以分為長鏈和短鏈非編碼 RNA,短鏈非編碼RNA同時(shí)也常被稱為小非編碼RNA,也簡稱為小RNA[5]。ncRNA是RNA實(shí)現(xiàn)功能的關(guān)鍵分子,參與多種生命活動(dòng)過程,在整個(gè)細(xì)胞生命周期中發(fā)揮重要作用。隨著越來越多的ncRNA被發(fā)現(xiàn),其重要的生物學(xué)功能也逐漸顯露出來,包括翻譯、RNA剪接、參與DNA復(fù)制、反式基因調(diào)控和順式基因調(diào)控等[6]。

1.1 miRNA

miRNA是基因調(diào)控的“微調(diào)器”,在真核細(xì)胞中普遍存在,由一大類非編碼小RNA(約21～23 nt)組成,是一種進(jìn)化保守的ncRNA,廣泛參與真核生物的生物學(xué)調(diào)節(jié)過程[7]。miRNA可作為哺乳動(dòng)物內(nèi)源性翻譯抑制因子,通過與靶mRNA的3′-非翻譯區(qū)的堿基互補(bǔ)配對(duì)而起作用,當(dāng)與mRNA不完全配對(duì)時(shí)抑制翻譯過程,完全配對(duì)時(shí)則切割或降解靶mRNA[8]。但也有一些報(bào)道稱miRNA并非通過結(jié)合靶mRNA的3′-非翻譯區(qū)的堿基來行使轉(zhuǎn)錄后的抑制功能,而是產(chǎn)生該轉(zhuǎn)錄過程時(shí)發(fā)揮了調(diào)控作用[9],同時(shí)miRNA也能通過直接相互作用來調(diào)控其他miRNA。大多miRNA定位在與腫瘤相關(guān)的染色體部位,其異常表達(dá)與特定腫瘤的發(fā)生有關(guān),miRNA能調(diào)控腫瘤相關(guān)基因的表達(dá),并參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲或血管形成等過程[10-11],在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著促癌或抑癌作用。

1.2 lncRNA

lncRNA是一類在多種生物過程中發(fā)揮重要作用的異構(gòu)RNA,最早被發(fā)現(xiàn)的lncRNA是H19和XIST[12-13]。研究證實(shí),lncRNA是激活分子而非轉(zhuǎn)錄“噪音”,其參與腫瘤細(xì)胞相關(guān)生長因子及其受體改變的過程[14],還可以通過表觀遺傳改變、轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控等調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá),影響腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡,在腫瘤增殖、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[15-16]。基因表達(dá)的不穩(wěn)定性和突變是腫瘤產(chǎn)生的一個(gè)重要標(biāo)志,lncRNA可作為癌基因或腫瘤抑制因子在腫瘤發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮復(fù)雜而精確的調(diào)節(jié)功能[17-18]。此外,lncRNA具有高度的組織特異性,其可以通過介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默途徑調(diào)控相關(guān)蛋白的表達(dá)[19]。目前,在犬上發(fā)現(xiàn)超過10 000個(gè)lncRNA,相比于mRNA,這些lncRNA具有更高的組織特異性,其中有44%的lncRNA都以組織特異性的方式表達(dá),進(jìn)一步通過比較轉(zhuǎn)錄組和對(duì)lncRNA與鄰近蛋白編碼基因的共表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),SINEC_Cf TE家族與犬lncRNA關(guān)系密切,SINEC_Cf家族在基因組傳播時(shí)可將具有調(diào)控作用的序列引入lncRNA或其啟動(dòng)子序列中,有助于犬lncRNA的空間表達(dá)[20]。以上研究表明,lncRNA成為腫瘤診斷和預(yù)后標(biāo)志物具有潛在的巨大優(yōu)勢。

2 非編碼RNA作為犬乳腺腫瘤潛在生物標(biāo)志物的進(jìn)展

乳腺腫瘤是母犬最常見的腫瘤之一,而乳腺癌是最常見的癌癥之一。犬乳腺腫瘤的高增殖率和高侵襲能力常導(dǎo)致預(yù)后不良[21]。近年來,犬乳腺腫瘤的發(fā)生率呈上升趨勢,發(fā)病率為16.8%,其中惡性乳腺腫瘤的發(fā)生率為50%[22-23]。犬患乳腺腫瘤的平均年齡為10.18歲,母犬在7～11歲這個(gè)年齡段的發(fā)病率較高[24]。目前,犬乳腺腫瘤治療以切除為主,單純局部切除腫瘤后,58%的病例會(huì)復(fù)發(fā),在同側(cè)長出新的腫瘤,并最終造成死亡[25]。因此,犬乳腺腫瘤是獸醫(yī)臨床腫瘤學(xué)防治領(lǐng)域亟待解決的難題。

2.1 miRNA與犬乳腺腫瘤

與人類癌癥中相關(guān)的miRNA研究相比,犬類miRNA的研究常常由于特異性檢測缺乏而備受阻礙。與人類乳腺癌相關(guān)的9種miRNA,let-7f、miR-15a、miR-16、miR-17-5p、miR-21、miR-29b、miR-125b、miR-155和miR-181b,在犬類中似乎也遵循相同的表達(dá)模式[26]。任曉麗等[27]在犬的乳腺癌研究發(fā)現(xiàn),miR-502在犬乳腺癌組織中高表達(dá),且與癌癥的組織學(xué)分級(jí)與轉(zhuǎn)移有關(guān)。此外,在Bulkowska等[28]的研究中證實(shí),miR-29a、miR-181a和miR-374a靶基因Col4a2、ATM、WlF1的上調(diào)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期控制和細(xì)胞分化紊亂,在犬乳腺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。miRNA表達(dá)差異不僅可以作為腫瘤診斷的標(biāo)志物,還能作為區(qū)分不同但相似細(xì)胞或癌癥類型的工具。與正常乳腺組織相比,miR-210在犬乳腺腫瘤中的高表達(dá),在正常乳腺組織、良性乳腺腫瘤和非轉(zhuǎn)移性惡性乳腺腫瘤,miR-10b、miR-125b、miR-136和let-7f的表達(dá)水平呈下降趨勢[28]。不僅如此,在犬乳腺腫瘤診斷中發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的miRNA-21聯(lián)合miRNA-29b可增加乳腺腫瘤檢測的敏感性[29-30]。Jain等[30]研究也證明miRNA-21過表達(dá)和miRNA-29b下調(diào)是與乳腺腫瘤的臨床分期有關(guān),可作為犬乳腺腫瘤早期診斷和預(yù)后的標(biāo)志物,miRNA-21可通過凋亡途徑參與腫瘤細(xì)胞的增殖,且其啟動(dòng)子能夠與癌蛋白c-Jun結(jié)合,通過JNK-1/c-Jun通路促進(jìn)癌癥的發(fā)生,而miRNA-29b可通過激活P38-STAT1通路促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞活力和轉(zhuǎn)移,這提示miRNA的組織特異性對(duì)于腫瘤的診斷、惡化發(fā)展可能存在潛在影響。此外,有研究發(fā)現(xiàn)乳腺腫瘤患犬血清中miR-19b和miR-125a明顯高于正常犬,且miRNA在轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性腫瘤中的表達(dá)存在顯著性差異,是一種良好的轉(zhuǎn)移生物標(biāo)志物[31]。miRNA作為一種新穎且有效癌癥診斷方式,基于miRNA抗癌藥物研發(fā)前景廣闊,可為犬乳腺腫瘤甚至是人腫瘤的靶向治療提供新方向。

2.2 lncRNA與犬乳腺腫瘤

在哺乳動(dòng)物中,第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的lncRNA是H19,H19具有促進(jìn)癌細(xì)胞生長與血管生成、增加缺氧耐受以及拮抗let-7b的生物學(xué)作用[32-34]。胡鑫等[35]研究顯示乳腺癌細(xì)胞系中l(wèi)ncRNA H19表達(dá)明顯升高,其通過負(fù)向調(diào)控miR-194-5p來促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。第一個(gè)與乳腺腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的lncRNA是同源異形盒基因轉(zhuǎn)錄反義RNA(homeoboxgene transcript antisense RNA, HOTAIR),HOTAIR定位于哺乳動(dòng)物12q13.13,研究發(fā)現(xiàn)HOTAIR在原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移腫瘤中的表達(dá)會(huì)比正常組織高,并與腫瘤不良預(yù)后呈正相關(guān)[36],可作為乳腺腫瘤高度特異性標(biāo)志物。Zhao等[37]研究證實(shí)lncRNA HOTAIR通過miR-20a-5p/HMGA2軸促進(jìn)乳腺腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移,影響細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)移和凋亡。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)激誘導(dǎo)長非編碼轉(zhuǎn)錄本5(long stress-induced noncoding transcript 5, LSINCT5)在人乳腺癌和卵巢癌中的表達(dá)也會(huì)異常升高,這可導(dǎo)致基因CXCR4表達(dá)下降,該基因是多種癌癥常用標(biāo)記物,可作為乳腺癌侵襲與轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物[38]。而在犬乳腺腫瘤中,lncRNA的異常表達(dá)和差異表達(dá)已被頻繁報(bào)道,Lu等[39]通過高通量測序技術(shù)檢測犬乳腺腫瘤組織與鄰近非腫瘤組織中差異表達(dá)的lncRNA,結(jié)果在犬乳腺腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)2 208個(gè)差異顯著的mRNA和68個(gè)差異顯著的lncRNA,其中l(wèi)ncRNA 34977在犬乳腺腫瘤中顯著高表達(dá),而lncRNA 40589、lncRNA 32949和lncRNA 39112顯著低表達(dá),進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),敲除lncRNA 34977能夠顯著抑制犬腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,說明lncRNA 34977可作為犬乳腺腫瘤中的促癌基因,參與腫瘤的增殖和調(diào)控。與之相似,lncRNA 42060可以通過調(diào)控miR-204-5p進(jìn)一步調(diào)節(jié)靶基因SOX4表達(dá)活性而促進(jìn)犬乳腺腫瘤的發(fā)生發(fā)展[40]。以上研究均表明lncRNA與腫瘤發(fā)生發(fā)展有著密不可分的關(guān)聯(lián)。

3 非編碼RNA作為犬黑色素瘤潛在生物標(biāo)志物的進(jìn)展

黑色素瘤是來源于黑色素細(xì)胞的惡性腫瘤,也是一種非常具有侵略性的惡性皮膚癌,占犬皮膚腫瘤的5%～7%[26],其最常發(fā)生部位是口腔,其次為皮膚、眼睛和四肢[41]。卷毛犬、拉布拉多犬和金毛獵犬更易患黏膜黑色素瘤[42],且其中26%的病例發(fā)生在舌頭上,18%發(fā)在上頜骨[43]。黏膜黑色素瘤是犬黑色素瘤中最常見的一種,也是犬最常見口腔癌之一,與皮膚黑色素瘤相比,犬黏膜黑色素瘤具有更強(qiáng)的攻擊性和較高的侵襲性,其在臨床、生物學(xué)和遺傳特征等方面與人類黏膜膜黑色素瘤十分相似[43]。和人類黑色素瘤一樣,犬黏膜膜黑色素瘤對(duì)化療反應(yīng)很差,易轉(zhuǎn)移至其他組織器官[44]。

3.1 miRNA與犬黑色素瘤

人黑色素瘤與犬黑色素瘤之間具有良好的相似性,可能會(huì)是潛在的預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。2013年Wagner等[26]比較了人和犬ncRNA的差異,發(fā)現(xiàn)在人類黑色素瘤細(xì)胞系A(chǔ)2058、Mewo與犬黑色素瘤LMeC細(xì)胞以及惡性黑色素瘤組織中,miR-145、miR-203和miR-205表達(dá)均下調(diào),表明其可能是治療惡性黑色素瘤的治療靶點(diǎn)。為了進(jìn)一步了解miRNA在犬黑色素瘤中的功能,Rahman等[45]運(yùn)用二代測序技術(shù)(NGS)比較正常健康犬和患口腔黑色素瘤犬組織的miRNA譜,通過與人和小鼠黑色素瘤對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)在人和小鼠黑色素瘤中下調(diào)的miR-450b、miR-301a和miR-223在犬口腔黑色素瘤中也下調(diào),其作用靶點(diǎn)分別為PAX9、NDRG2、ACVR2A,miR-450b、miR-301a和miR-223可以分別破壞其靶蛋白PAX9、NDRG2和ACVR2A的腫瘤抑制功能,以維持犬口腔黑色素瘤的致癌特征。同時(shí)miR-450b在犬轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞中的表達(dá)更高,并能通過PAX9-BMP4-MMP9軸調(diào)節(jié)miR-450b表達(dá)[45]。與之相似,Chen等[46]采用相同檢測方法發(fā)現(xiàn)在犬腺癌中上調(diào)的miR-9-5p也在犬惡性黑色素瘤中上調(diào),而在腺癌中顯著下調(diào)的miR-338-3p卻在犬口腔黑色素瘤高表達(dá)。此外,miR-1-3p和miR-133家族miRNA在犬乳腺腫瘤中明顯下調(diào),與其相關(guān)的潛在靶基因可能與Hippo信號(hào)通路有關(guān)[46]。在一項(xiàng)鑒定特異性外泌體miRNA研究中,發(fā)現(xiàn)miR-143、miR-221和miR-210在犬黑色素瘤中顯著過表達(dá),可作為區(qū)分黑色素瘤的生物標(biāo)志物,有助于黑色素瘤的早期診斷[47]。

3.2 lncRNA與犬黑色素瘤

在黑色素瘤中已有多個(gè)lncRNA的功能被驗(yàn)證,不同lncRNA的亞型都含有高度遺傳異質(zhì)性,被認(rèn)為在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。有研究將角質(zhì)細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞同黑色素細(xì)胞進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)417個(gè)差異表達(dá)的lncRNA,其中有272個(gè)lncRNA下調(diào),145個(gè)lncRNA上調(diào),其中l(wèi)ncRNA ZEB2-AS在黑色素腫瘤組織中高表達(dá),相比在正常組織中高了14倍左右[43],提示lncRNA ZEB2-AS可能在犬黑色素瘤中發(fā)揮作用。同時(shí),Hitte等[43]分別對(duì)金毛犬、拉布拉多犬和貴賓犬的口腔黏膜黑色素瘤進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)lncRNA RLOC_00005829在貴賓犬中顯著下調(diào),但在金毛犬中并無變化,反義lncRNA COLCA1僅在貴賓犬黑色素瘤中有差異表達(dá)。值得注意的是,同一個(gè)lncRNA在不同物種間功能可能存在差異,在犬黏膜黑色素瘤的研究中發(fā)現(xiàn),lncRNA SOX21-AS1下調(diào),lncRNA CASC15表達(dá)上調(diào),但二者在人類口腔癌和皮膚黑色素瘤中并無異常[48-49],這又進(jìn)一步論證了lncRNA的組織特異性和物種特異性,提示lncRNA在犬黑色素瘤中具有作為生物標(biāo)志物的潛力。

4 非編碼RNA作為犬骨肉瘤潛在生物標(biāo)志物的進(jìn)展

骨肉瘤是一種高度侵襲性的原發(fā)骨骼惡性腫瘤,起源于間質(zhì)細(xì)胞系,具有顯著的遺傳復(fù)雜性和不穩(wěn)定性,發(fā)生率較高[50-51]。在獸醫(yī)臨床中,犬患骨肉瘤相對(duì)較為常見,據(jù)報(bào)道在美國每年約有1萬例犬骨肉瘤病例[26],其發(fā)病率是人類的27倍且發(fā)展迅速,經(jīng)化療切除后犬生存率只有45%[52]。犬患骨肉瘤在組織學(xué)表現(xiàn)、治療反應(yīng)及轉(zhuǎn)移的發(fā)生和分布等與人類相似[50],有望成為人骨肉瘤研究的理想模型。

4.1 miRNA與犬骨肉瘤

在犬骨肉瘤的治療中,特異性miRNA可作為預(yù)后評(píng)估的標(biāo)志物。Sarver等[53]將人類14q32集群與犬基因組進(jìn)行比對(duì),證實(shí)14q32簇miRNA表達(dá)與犬骨肉瘤呈負(fù)相關(guān),而與健康組織相比,miR-134和miR-544在骨肉瘤中表達(dá)明顯較低。值得注意的是,犬骨肉瘤中miR-223的表達(dá)與正常骨組織相比幾乎低20倍,這與人類醫(yī)學(xué)研究一致,分析發(fā)現(xiàn)其調(diào)控Notch信號(hào)通路是一種在犬骨肉瘤中顯著失調(diào)的通路,提示miR-223可能是犬骨肉瘤治療的重要靶點(diǎn)[54]。與之相似,miR-376a在大多腫瘤中表達(dá)都會(huì)顯著降低,但在骨肉瘤中miR-376a可作為腫瘤抑制因子,過表達(dá)的miR-376a通過調(diào)控靶向FBXO11蛋白從而抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移,促進(jìn)細(xì)胞凋亡[55]。以上研究表明miRNA對(duì)犬骨肉瘤預(yù)后評(píng)估具有重要意義,有望成為犬骨肉瘤治療的新靶點(diǎn)。

4.2 lncRNA與犬骨肉瘤

許多l(xiāng)ncRNA在骨肉瘤中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用,如lncRNA COL11A1和lncRNA SFRP2在骨肉瘤中高表達(dá)[56-57],與骨肉瘤相關(guān)的lncRNA LOC285194是腫瘤抑制基因,在原發(fā)性骨肉瘤樣本和細(xì)胞系中表達(dá)缺失,具有潛在的抑癌作用[58]。lncRNA作為腫瘤調(diào)節(jié)的重要因子,單獨(dú)存在時(shí)即可發(fā)揮顯著的抑癌作用,同時(shí)lncRNA還可直接與miRNA相互作用發(fā)揮生物學(xué)功能。Luo等[59]發(fā)現(xiàn)miR-376a與lncRNA MALAT1之間存在直接相互作用,雙熒光素酶基因檢測顯示miR-376a可以特異性結(jié)合到lncRNA MALAT1上,表明MALAT1可以在骨肉瘤細(xì)胞中調(diào)節(jié)miR-376a,MALAT1下調(diào)能有效抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移,促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡。最新研究指出骨肉瘤細(xì)胞強(qiáng)大的增殖能力和耐藥能力是影響預(yù)后的重要因素[60],氧化應(yīng)激和自噬則是抑制骨肉瘤發(fā)展的重要靶點(diǎn)之一,而MALAT1-miR-376a-Wnt/β-catenin通路能夠促進(jìn)氧化應(yīng)激和自噬,抑制骨肉瘤生長,提示MALAT1-miR-376a-Wnt/β-catenin信號(hào)通路可以作為骨肉瘤診斷和治療靶點(diǎn)[61]。

5 小結(jié)與展望

長期以來,ncRNA一直備受關(guān)注,其在調(diào)控復(fù)雜生物過程中的作用已被證實(shí),在人類腫瘤中的研究取得很大進(jìn)展,這一領(lǐng)域也在獸醫(yī)腫瘤學(xué)中得以發(fā)展。miRNA和lncRNA作為ncRNA研究的熱點(diǎn),控制著腫瘤細(xì)胞的自噬、增殖、侵襲、遷移等生物學(xué)過程[62-63],為ncRNA靶向藥物的研究提供了新方向。迄今為止發(fā)現(xiàn)了數(shù)千種的犬類ncRNA構(gòu)成了廣泛的犬類基因組,且ncRNA具有高度的組織特異性和物種特異性,大量尚未開發(fā)應(yīng)用的miRNA和lncRNA作為腫瘤新型生物標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn)的前景廣闊,同時(shí)當(dāng)下基因組資源已逐漸擴(kuò)大我們對(duì)犬基因組的了解,隨著細(xì)胞RNA測序和生物信息學(xué)的發(fā)展,我們可以更加清楚地闡明腫瘤表型細(xì)節(jié)與ncRNA的生物學(xué)功能,相信ncRNA在犬腫瘤預(yù)防、診斷和治療中存在著深遠(yuǎn)意義,是治療的新靶點(diǎn)和潛在標(biāo)志物,在未來將會(huì)成為攻克癌癥的重要部分。