鄭若愚,任永軍,肖 潔,白 鑫,蒲家艷,陳 浩,楊光友*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,成都 611130;2.四川省畜牧科學(xué)研究院,成都 610066;3.動(dòng)物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 610066)

斯氏艾美耳球蟲(Eimeriastiedae)是對(duì)兔致病性強(qiáng)、危害性大的蟲種,主要危害斷奶后至3月齡間的幼兔,可引發(fā)嚴(yán)重的肝組織病變和功能障礙,嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡,對(duì)養(yǎng)兔業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。目前兔球蟲病的防控仍以化學(xué)藥物為主要手段,但藥物防控存在易產(chǎn)生耐藥性、食品中藥物殘留以及環(huán)境污染等問題,尋求免疫學(xué)方向的防控策略具有重要意義。目前已報(bào)道物理方法致弱的斯氏艾美耳球蟲弱毒株[4],但尚無(wú)商業(yè)化的兔球蟲疫苗。借助基因工程手段來(lái)研制安全、有效的兔球蟲新型疫苗是一個(gè)很有吸引力的選擇。其中,重組亞單位疫苗的表達(dá)系統(tǒng)較為成熟,且具有生產(chǎn)周期短、產(chǎn)量高和生產(chǎn)成本相對(duì)較低等優(yōu)點(diǎn),而篩選具有良好免疫保護(hù)效果的重組蛋白,無(wú)疑是重組亞單位疫苗研制的關(guān)鍵[5]。

三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)是催化糖酵解反應(yīng)中的一個(gè)關(guān)鍵酶,該酶在真核生物以及原核生物中廣泛存在,表達(dá)水平高[6-7]。文獻(xiàn)報(bào)道日本血吸蟲[8-11]、曼氏血吸蟲[12-14]、旋盤尾絲蟲[15-16]、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲[17]和雞巨型艾美耳球蟲[18]的GAPDH可作為候選疫苗抗原。

目前有關(guān)兔球蟲的GAPDH尚無(wú)研究報(bào)道。本研究基于實(shí)驗(yàn)室測(cè)定的斯氏艾美耳球蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),篩選出Es-GAPDH,克隆測(cè)序后采用相對(duì)熒光定量PCR分析了該基因在不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄水平,原核表達(dá)獲得了重組蛋白rEs-GAPDH,通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)評(píng)價(jià)了rEs-GAPDH的免疫保護(hù)效果,為兔斯氏艾美耳球蟲重組亞單位疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)用蟲株及動(dòng)物

斯氏艾美耳球蟲四川株由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物寄生蟲病研究中心提供。

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物寄生蟲病研究中心繁育的無(wú)球蟲新西蘭兔42只(雌雄各半),體重為1.1 kg±0.2 kg。幼兔于18日齡斷奶,使用人用嬰兒奶粉飼喂至30日齡后,提供高溫處理且不含抗球蟲藥物的兔飼料,每日定時(shí)和定量飼喂。

1.2 主要試劑與儀器

限制性內(nèi)切酶(EcoRI/SalI)購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;HRP標(biāo)記羊抗兔IgG抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司;兔谷丙轉(zhuǎn)氨酶ELISA試劑盒,兔谷草轉(zhuǎn)氨酶ELISA試劑盒購(gòu)自北京RXbio生物工程有限公司;Rabbit IFN-γ ELISA development kit (HRP)試劑盒,購(gòu)自瑞典Mabtech 公司;Rabbit IL-2、IL-4、IL-17、IL-10 ELISA Kit試劑盒,Rabbit Transforming Growth factor β1,TGF-β ELISA Kit試劑盒,購(gòu)自武漢CUSABIO BIOTECH公司。

PCR儀:Mastercycler Gradient,eppendorf,美國(guó);熒光定量PCR儀:LightCycler?96,Roche,瑞士;中高壓層析系統(tǒng):NGCTM10,Bio-Rad,美國(guó);McMaster計(jì)數(shù)板,富士平工業(yè)株式會(huì)社,日本;數(shù)字病理掃描儀:VS120-S6-W,OLYMPUS,日本。

1.3 斯氏艾美耳球蟲不同階段蟲體收集、總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄

參考文獻(xiàn)[19],以8×104個(gè)卵囊·只-1的劑量經(jīng)口感染35日齡無(wú)球蟲幼兔4只,分別于感染后10 d收集裂殖生殖階段蟲體,感染后13 d收集配子生殖階段蟲體,感染后28 d收集未孢子化卵囊,于液氮中保存。同時(shí),將收集的部分未孢子化卵囊進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)育至孢子化卵囊后,置于4 ℃保存。取適量各階段蟲體用RNA抽提試劑盒分別進(jìn)行RNA抽提,產(chǎn)物保存于-80 ℃超低溫冰箱;取適量各階段蟲體總RNA,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒在PCR儀上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,產(chǎn)物cDNA于-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.4 Es-GAPDH克隆、生物信息學(xué)分析及不同發(fā)育階段轉(zhuǎn)錄水平分析

1.4.1Es-GAPDH克隆測(cè)序與生物信息學(xué)分析 利用BLAST檢測(cè),結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選出Es-GAPDH,利用生物信息學(xué)軟件對(duì)氨基酸序列進(jìn)行分析,使用ExPASy ProtParam工具預(yù)測(cè)分子量(MW)和等電點(diǎn)(pI),使用SignalP5.0 Server和TMHMM Server v. 2.0.預(yù)測(cè)該基因信號(hào)肽和跨膜區(qū)的存在。

1.4.2 qRT-PCR引物設(shè)計(jì)和反應(yīng) 根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)特異性qRT-PCR引物并參考GenBank中公布的Es-18S rRNA(HQ173 837.1)基因序列結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中的Es-β-actin的基因序列設(shè)計(jì)內(nèi)參基因的特異性qRT-PCR引物(表1)。

表1 目的基因和內(nèi)參基因的qPCR引物Table 1 The qPCR primers of genes and internal reference genes

采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)技術(shù)檢測(cè)目的基因在斯氏艾美耳球蟲不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄水平,參考GenBank中公布的Es-18S rRNA(HQ173 837.1)基因序列結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中的Es-β-actin、Es-GAPDH為內(nèi)參基因進(jìn)行比較。采用2-ΔΔCt法對(duì)斯氏艾美耳球蟲各發(fā)育階段的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量進(jìn)行分析。試驗(yàn)結(jié)果以 3 次平行重復(fù)的“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式展示,各組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異通過(guò) SPSS Statistics 20.0單因素方差分析進(jìn)行。

1.5 Es-GAPDH原核表達(dá)、純化、免疫印跡分析和蛋白穩(wěn)定性

1.5.1Es-GAPDH的表達(dá)與純化 用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(上游5′-CGGAATTCATGGCTTGCAAATTGGG-3′,EcoRI;下游5′-GCGTCGACTCATTTGCACCTGCTTG-3′,SalI),取蟲體cDNA混合液為模板,對(duì)目的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將目的條帶與pMD19-T載體連接,將目的基因經(jīng)測(cè)序鑒定為陽(yáng)性的菌液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),提取T克隆質(zhì)粒,和pET32a(+)質(zhì)粒一起雙酶切20 min,酶切后產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,回收的目的片段酶切產(chǎn)物進(jìn)行T4連接,并將測(cè)序正確的質(zhì)粒,轉(zhuǎn)入表達(dá)感受態(tài)BL21(DE3)中,擴(kuò)培出1 L的陽(yáng)性克隆菌液。37 ℃、130 r·min-1條件下培養(yǎng)至菌液OD590 nm為0.6左右,加入IPTG 8 mL,并于18～22 ℃、110 r·min-1誘導(dǎo)表達(dá)12 h。隨后進(jìn)行可溶性分析,將菌液7 000 r·min-1離心10 min,于菌體沉淀中加入20 mL裂解液(20 mmol·L-1Tris-Cl,pH=8.0)重懸菌體,反復(fù)凍融3次后超聲破碎。將超聲產(chǎn)物7 000 r·min-1離心10 min,收集上清并先后使用2、4、6、8 mol·L-1尿素溶解沉淀。各取40 μL上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE判斷原核表達(dá)重組蛋白的可溶性。最后采用鎳離子親和層析的方法純化重組蛋白,SDS-PAGE分析純化效果。

1.5.2 rEs-GAPDH的免疫印跡分析 一抗為0.01 mol·L-1PBS稀釋至1∶200斯氏艾美耳球蟲陽(yáng)性兔血清,二抗為1∶1 000稀釋辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔抗體(武漢博士德),按常規(guī)方法進(jìn)行免疫印跡分析。

1.5.3 rEs-GAPDH的穩(wěn)定性試驗(yàn) 選擇純化后的重組蛋白rEs-GAPDH,分別保存于4、-20和-80 ℃,每周于固定時(shí)間分別制樣,持續(xù)7周。使用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法對(duì)比7周的蛋白濃度變化。

1.6 斯氏艾美耳球蟲rEs-GAPDH對(duì)兔的免疫保護(hù)效果觀察

1.6.1 分組和免疫程序 本試驗(yàn)中,42只45日齡的無(wú)球蟲幼兔(雌雄各半)分組情況如下(表2)。免疫方式為頸部皮下注射,免疫接種2次,兩次免疫時(shí)間間隔14 d。加強(qiáng)免疫后14 d,除空白對(duì)照組外,其余各組實(shí)驗(yàn)兔分別經(jīng)口感染1×104個(gè)斯氏艾美耳球蟲孢子化卵囊。

表2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和免疫程序Table 2 Groups of Experimental animal and immunization program

1.6.2 評(píng)價(jià)指標(biāo)

1.6.2.1 臨床觀察:首免、二免和攻蟲后每天觀察各實(shí)驗(yàn)組兔的臨床表現(xiàn)。

1.6.2.2 增重情況、相對(duì)增重率和料肉比:免疫后攻蟲前增重=攻蟲前體重-首免前體重;攻蟲后增重=剖殺前體重-攻蟲前體重;相對(duì)增重率=(試驗(yàn)各組平均攻蟲后增重/不感染不免疫平均攻蟲后增重)×100%;料肉比=(飼喂前飼料總量-剖殺后剩余飼料總量)/感染后增重總量。

1.6.2.3 肝指數(shù)和卵囊減少率:試驗(yàn)兔宰殺前進(jìn)行稱重,剖檢后觀察并記錄肝的重量。肝指數(shù)=肝重/體重×100%。參考動(dòng)物球蟲病診斷技術(shù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T18647—2020),剖檢時(shí)收集適量直腸糞樣進(jìn)行卵囊排出量的定量檢查,統(tǒng)計(jì)各組平均每克糞便卵囊數(shù)(oocyst per gram, OPG),并計(jì)算卵囊減少率。卵囊減少率=[(攻蟲對(duì)照組OPG-免疫組OPG)/攻蟲對(duì)照組OPG]×100%。

1.6.2.4 生化指標(biāo)、細(xì)胞因子及抗體水平的檢測(cè):從首免前開始,到攻蟲后直至剖殺,每周定時(shí)采集實(shí)驗(yàn)兔血清。分別使用相應(yīng)的ELISA試劑盒,對(duì)生化指標(biāo)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)和細(xì)胞因子(IL-2、IL-4、IL-10、IL-17、 TGF-β、IFN-γ)進(jìn)行測(cè)定,根據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。使用基于重組蛋白rEs-GAPDH的間接ELISA方法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)兔血清中特異性IgG抗體水平(蛋白稀釋比1∶100,二抗稀釋比1∶3 000)。

1.6.2.5 病理切片:剖殺后摘取肝制作病理切片,進(jìn)行HE染色,按照常規(guī)操作進(jìn)行[20]。使用數(shù)字病理掃描儀對(duì)肝組織切片進(jìn)行掃描拍攝。

1.7 數(shù)據(jù)處理

使用GraphPad軟件(GraphPad Prism版本5.0)制作生成所有圖形。使用SPSS Statistics 20.0確定組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,對(duì)每個(gè)因變量(肝指數(shù)、平均增重、卵囊排出量、料肉比)的重復(fù)測(cè)量進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA),數(shù)據(jù)用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)”表示,P<0.05認(rèn)為差異有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 Es-GAPDH克隆、生物信息學(xué)分析及不同發(fā)育階段轉(zhuǎn)錄水平分析

克隆測(cè)序的Es-GAPDH與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的Es-GAPDH序列相似性為100%(GenBank:OK337683)。Es-GAPDH序列包含1 020 bp的開放閱讀框,編碼339個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)相對(duì)分子量為36.80 ku,計(jì)算等電點(diǎn)(pI)為7.97。將Es-GAPDH氨基酸序列與堆形艾美耳球蟲、柔嫩艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲、毒害艾美耳球蟲、隱孢子蟲、弓形蟲和貝諾孢子蟲的GAPDH氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì),可見Es-GAPDH與其他原蟲氨基酸同源性均在70%以上,與雞堆型艾美耳球蟲(GenBank:XP_013 251 305.1)氨基酸相似性最高,達(dá)73.16%(圖1)。

E.a:雞堆型艾美耳球蟲;E.m:雞巨型艾美耳球蟲;C.m:火雞隱孢子蟲;E.t:雞柔嫩艾美耳球蟲;T.g:弓形蟲;E.n:雞毒害艾美耳球;B.b:牛貝氏貝諾孢子蟲。Eimeria stiedae氨基酸序列標(biāo)注為:紅色方塊:α螺旋;綠色箭頭:β折疊;黑色方框:B抗原表位E.a:Eimeria acervuline; E.m:Eimeria maxima; C.m:Cryptosporidium meleagridis; E.t:Eimeria tenella; T.g:Toxoplasma gondii; E.n:Eimeria necatrix; B.b:Besnoitia besnoiti. Eimeria stiedae amino acid sequences are labeled as follows: red squares: alpha helix; green arrows: beta fold; black boxes: B antigen epitopes圖1 Es-GAPDH與其他原蟲GAPDH的氨基酸序列比對(duì)Fig.1 Amino acid sequence comparison of Es-GAPDH with other protozoan GAPDH

Es-GAPDH在斯氏艾美耳球蟲4個(gè)發(fā)育階段均有轉(zhuǎn)錄,且轉(zhuǎn)錄水平存在差異,其中Es-GAPDH在孢子化階段相對(duì)于其他階段轉(zhuǎn)錄水平最高,且差異極顯著(P<0.01,圖2)。

橫坐標(biāo)的發(fā)育階段由左至右依次為未孢子化卵囊、孢子化卵囊、裂殖體和配子體。不同的字母標(biāo)注的數(shù)據(jù)間存在顯著差異(P<0.05),相同字母標(biāo)注的數(shù)據(jù)間無(wú)顯著差異(P>0.05)Development stages of the abscissa from left to right are unsporulated oocysts, sporulated oocysts, merozoites,gametophytes, respectively. There is a statistically significant difference between data labeled with different letters (P<0.05), and there is no statistically significant difference between data labeled with the same letters (P>0.05)圖2 Es-GAPDH在斯氏艾美耳球蟲不同發(fā)育階段的相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Relative mRNA expression levels of Es-GAPDH at different developmental stages of Eimeria stiedae

2.2 Es-GAPDH原核表達(dá)、純化和蛋白免疫印跡分析

以斯氏艾美耳球蟲cDNA為模板擴(kuò)增出Es-GAPDH基因,以測(cè)序成功的菌液擴(kuò)培后提取質(zhì)粒,將基因克隆菌的質(zhì)粒與pET32a(+)質(zhì)粒一起在37 ℃條件下進(jìn)行雙酶切30 min(圖3)。并成功與pET-32a(+)載體連接,經(jīng)轉(zhuǎn)化、涂板及單菌落鑒定,成功構(gòu)建了pET-32a(+)-Es-GAPDH。

泳道:M. DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1. 基因Es-GAPDH擴(kuò)增結(jié)果;2～3. 基因克隆菌質(zhì)粒的酶切;4～5. pET32a(+)載體質(zhì)粒的酶切Lane: M. DNA marker; 1. Amplification of Es-GAPDH; 2-3. Enzymatic cleavage of Es-GAPDH; 4-5. Enzymatic cleavage of gene cloning bacterial plasmid. 圖3 基因Es-GAPDH的克隆Fig.3 Cloning of the gene Es-GAPDH

重組蛋白rEs-GAPDH在誘導(dǎo)劑IPTG終濃度為1.0 mmol·L-1,37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)12 h(130 r·min-1)的條件下表達(dá)量最高,大小在55 ku左右,且大部分表達(dá)在包涵體。重組蛋白經(jīng)鎳離子親和層析后的純化效果良好,無(wú)明顯雜條帶(圖4)。同時(shí),rEs-GAPDH能識(shí)別陽(yáng)性兔血清(圖5),具有良好的免疫反應(yīng)性。

泳道:M. 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記(ku);1. 重組菌誘導(dǎo)表達(dá)后菌體裂解物上清;2～5. 菌體裂解物先后溶解于2、4、6、8 mol·L-1尿素;6. 誘導(dǎo)表達(dá)后未經(jīng)純化的rEs-GAPDH;7. 經(jīng)純化的rEs-GAPDHLanes: M. Protein molecular weight markers (in ku);1. Soluble protein;2-5. Inclusion body in 2,4,6,8 mol·L-1 urea; 6. Non-purified rEs-GAPDH; 7. Purified rEs-GAPDH圖4 重組蛋白rEs-GAPDH的可溶性分析Fig.4 SDS-PAGE of solubility analysis of recombinant protein rEs-GAPDH

泳道:M. 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記(ku);1. 經(jīng)純化的rEs-GAPDH與自然感染斯氏艾美耳球蟲兔血清識(shí)別反應(yīng);2. 經(jīng)純化的rEs-GAPDH與健康兔血清識(shí)別反應(yīng)Lanes: M. Protein molecular weight markers (in ku); 1. Purified rEs-GAPDH detected by serum from naturally infested with Eimeria stiedae; 2. Purified rEs-GAPDH detected by healthy rabbit’s serum圖5 純化后重組蛋白rEs-GAPDH的免疫印跡Fig.5 Western blot of purified recombinant protein

2.3 重組蛋白rEs-GAPDH穩(wěn)定性試驗(yàn)

純化后重組蛋白各加5%的甘油,混勻后分別保存于-80、-20、4 ℃ 3種溫度下,持續(xù)觀察7周。由SDS-PAGE結(jié)果可知,重組蛋白在7周時(shí)間內(nèi)未出現(xiàn)降解(圖6),重組蛋白rEs-GAPDH的穩(wěn)定性良好。

2.4 rEs-GAPDH對(duì)家兔的疫保護(hù)效果

2.4.1 臨床表現(xiàn) 在攻蟲前各組實(shí)驗(yàn)兔體況表現(xiàn)正常,在經(jīng)口感染1×104個(gè)·只-1孢子化卵囊后,前2周未有明顯癥狀,感染后第3周不免疫攻蟲組出現(xiàn)兔肝球蟲病典型癥狀:食欲減退,精神沉郁,喜臥;消瘦,腹瀉;黏膜黃染,腹圍增大;而rEs-GAPDH免疫組兔的肝球蟲病臨床癥狀不明顯,感染后第3周偶有食欲稍減退,腹圍略有增大。經(jīng)口攻蟲感染后各試驗(yàn)組兔均未出現(xiàn)死亡。

2.4.2 相對(duì)增重 初次免疫、二次免疫和攻蟲時(shí)各組體重?zé)o明顯差異。感染21 d后,空白對(duì)照組平均增重為(536.88±48.32)g,不免疫攻蟲組平均增重(234.00±47.91 )g,Trx-His-S tag對(duì)照組平均增重(248.75±49.12)g,Quil-A saponin對(duì)照組平均增重(258.25±21.78)g,這4組實(shí)驗(yàn)兔的平均增重間呈現(xiàn)顯著差異(P<0.05)。rEs-GAPDH免疫組平均增重(375.00±57.30)g,與空白對(duì)照組和攻蟲對(duì)照組之間存在明顯差異(P<0.05)。其中,不免疫攻蟲組的相對(duì)增重率僅為空白對(duì)照的43.59%,感染后2～3周甚至有個(gè)別試驗(yàn)兔體重出現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng);而rEs-GAPDH免疫組的相對(duì)增重率為69.85%(表3)。

表3 rEs-GAPDH針對(duì)斯氏艾美耳球蟲感染的保護(hù)效果評(píng)價(jià)Table 3 Protective effects of rEs-GAPDH against Eimeria stiedae infection under different evaluation indicators

2.4.3 卵囊排出量 感染后21 d進(jìn)行卵囊排出量的檢查,空白對(duì)照組的糞便樣本中未檢查到斯氏艾美耳球蟲卵囊;不免疫攻蟲組平均OPG達(dá)1.49×105,Trx-His-S tag對(duì)照組平均OPG達(dá)1.48×105,Quil-A saponin對(duì)照組平均OPG達(dá)1.47×105,均不存在顯著差異(P>0.05)。而rEs-GAPDH免疫組的平均OPG為0.19×105,與不免疫攻蟲組相比顯著減少(P<0.05),免疫組的卵囊減少率達(dá)87.09%(表3)。

2.4.4 料肉比和肝指數(shù) 不免疫攻蟲組、Trx-His-S tag對(duì)照組和Quil-A saponin對(duì)照組間的平均肝指數(shù)差異不顯著。而rEs-GAPDH免疫組的平均肝指數(shù)為3.10,與各個(gè)對(duì)照組之間存在顯著差異(表3)。同時(shí),自攻蟲起至攻蟲后21 d,rEs-GAPDH免疫組料肉比為4.48∶1,與各個(gè)對(duì)照組之間存在顯著差異(表3)。

2.4.5 血清中特異性IgG抗體水平的變化 免疫接種后,rEs-GAPDH免疫組實(shí)驗(yàn)兔的血清平均特異性IgG抗體水平升高,其平均水平極顯著的高于不免疫攻蟲組、Trx-His-S tag對(duì)照組和Quil-A saponin對(duì)照組的血清平均特異性IgG抗體水平(P<0.01)。rEs-GAPDH免疫組的血清平均特異性IgG抗體水平在第二次免疫后達(dá)到最高水平,為1.86,抗體水平見頂后略有下降,但在攻蟲3周后仍可以保持高水平(圖7)。

實(shí)驗(yàn)兔分別在第0和2周進(jìn)行首次免疫和加強(qiáng)免疫。在第4周,除空白組外,每只實(shí)驗(yàn)兔口服感染斯氏艾美耳球蟲孢子化卵囊1×104個(gè)The rabbits were immunized at week 0 and boostered with same dose at week 2. Except for the blank control group, each rabbit was orally inoculated with 1×104E. stiedae sporulated oocysts at week 4圖7 實(shí)驗(yàn)兔血清中特異性IgG抗體水平的變化情況Fig.7 Variation of specific IgG antibody levels in sera of immunized rabbits

2.4.6 血清中ALT/AST值 攻蟲3周后,可見免疫組和對(duì)照組的ALT值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但AST值存在顯著差異;不免疫攻蟲組的AST值均高于Trx-His-S tag、Quil-A saponin對(duì)照組和rEs-GAPDH免疫組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表4)。

表4 實(shí)驗(yàn)兔攻蟲后3周肝功能數(shù)值Table 4 Liver function of experimental rabbits 3 weeks after challenged with E.stiedae

2.4.7 細(xì)胞因子 rEs-GAPDH免疫組除IL-17水平無(wú)明顯變化外,其他細(xì)胞因子(IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10和TGF-β)水平均顯著高于不免疫攻蟲組和Quil-A saponin對(duì)照組(圖8)。

不同的字母標(biāo)注的數(shù)據(jù)間存在顯著差異(P<0.05),相同字母標(biāo)注的數(shù)據(jù)間不存在顯著差異(P>0.05)There is a statistically significant difference between data labeled with different letters (P<0.05), and there is no statistically significant difference between data labeled with the same letters (P>0.05)圖8 兩次免疫后實(shí)驗(yàn)兔血清中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、IL-17、TGF-β的變化情況Fig.8 The changes of IFN-γ,IL-2, IL-4, IL-10, IL-17 and TGF-β in serum of experimental rabbits after two immunizations

2.4.8 剖解病變及組織病理學(xué) 剖檢發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組肝健康,大小正常無(wú)病變。不免疫攻蟲組出現(xiàn)兔肝球蟲病典型病理變化:肝充血腫脹,擠占大部分腹內(nèi)空間,且表面布滿白黃色豆?fàn)罱Y(jié)節(jié);膽囊擴(kuò)張,充滿黃色滲出物。rEs-GAPDH免疫組病變較輕微,肝腫脹不明顯,有一定數(shù)量的粟粒狀或豆?fàn)罱Y(jié)節(jié),部分有少許泡狀結(jié)節(jié)。

使用數(shù)字病理掃描儀對(duì)實(shí)驗(yàn)兔的肝組織切片進(jìn)行掃描拍攝,可見空白對(duì)照組肝切片未見明顯異常,膽管大小勻稱,結(jié)構(gòu)完整,管壁的膽管單層柱狀上皮細(xì)胞排列整齊有序,肝細(xì)胞呈放射排列,結(jié)構(gòu)清晰完整,可見明顯的紅染胞質(zhì)和深色細(xì)胞核(圖9a～b)。

a～b.空白對(duì)照組;c～d.不免疫攻蟲組;e～f.Quil-A saponin對(duì)照組;g～h.Trx-His-S tag對(duì)照組;i～j.rEs-GAPDH免疫組。d、f、h、j分別為c、e、g、i方框內(nèi)的放大圖。紅色箭頭.排列整齊有序的膽管上皮細(xì)胞;黑色箭頭.不同發(fā)育階段的蟲體a-b. Unimmunized and unchallenged group; c-d. Unimmunized and challenged group; e-f. Quil-A saponin group; g-h. Trx-His-S tag group; i-j. rEs-GAPDH immunization group. d, f, h, and j are enlarged views in boxes c, e, g, and i respectively. Red arrows. Neatly arranged and ordered bile duct epithelial cells; black arrows. Worms at different developmental stages圖9 對(duì)照組和免疫組的實(shí)驗(yàn)兔肝組織病理切片 (HE染色)Fig.9 Pathological sections of the liver of control and immunized rabbits (HE staining)

不免疫攻蟲組的試驗(yàn)兔肝組織則明顯受到破壞,尤其是膽管上皮細(xì)胞排列紊亂,結(jié)構(gòu)支離破碎,有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。膽管中充斥著不同發(fā)育階段的蟲體:孢子囊、裂殖體、配子體等,它們正不斷侵蝕肝細(xì)胞(圖9c～h)。其中,rEs-GAPDH免疫組的肝組織也受到一定程度的破壞,可見膽管中存在各階段蟲體,使膽管內(nèi)壁擴(kuò)張。但相較其余攻蟲組,蟲體數(shù)量較少,膽管上皮細(xì)胞被破壞程度較低(圖9i～j)。說(shuō)明實(shí)驗(yàn)兔經(jīng)重組蛋白免疫后,對(duì)于斯氏艾美耳球蟲具有一定保護(hù)作用。

3 討 論

隨著科技發(fā)展,考慮到生產(chǎn)活疫苗的成本較高,基因工程苗逐漸成為研究熱門,因其具有安全穩(wěn)定、易于大規(guī)模生產(chǎn)、生產(chǎn)成本較低的優(yōu)勢(shì)。兔球蟲基因工程苗的研究主要集中在核酸疫苗[21]、活載體疫苗[22-23]和重組亞單位疫苗[24-25]上,而基因工程苗研究的關(guān)鍵在于篩選具有良好免疫保護(hù)作用的候選抗原。

三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)除了在糖酵解反應(yīng)中起到關(guān)鍵作用外,還具有其他多種功能[26-27]。事實(shí)上,已經(jīng)有許多物種的GAPDH被證明存在于細(xì)胞表面,它們與基質(zhì)蛋白結(jié)合,調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng),在毒力和表面定位中發(fā)揮作用,引發(fā)了人們對(duì)于GAPDH作為疫苗靶標(biāo)基因的興趣[28-30]。最近有研究報(bào)道在雞的柔嫩艾美耳球蟲(Eimeriatenella)子孢子感染過(guò)程中,宿主的GAPDH對(duì)子孢子入侵的過(guò)程起到正向調(diào)控,這說(shuō)明雞球蟲子孢子入侵過(guò)程中可能會(huì)利用宿主GAPDH為其提供能量[31]。同時(shí),已知包括惡性瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum)在內(nèi)的幾種致病原蟲不存在三羧酸循環(huán),只依賴糖酵解產(chǎn)生能量,其代謝過(guò)程所需的ATP完全來(lái)自糖酵解反應(yīng)[32]。還有研究人員鑒定了3種多肽,它們與Kupffer細(xì)胞(一種排列在肝血管上的巨噬細(xì)胞類型細(xì)胞)表面的CD68結(jié)合,從而抑制子孢子穿越,且這種抑制作用不會(huì)與宿主本身的GAPDH發(fā)生交叉反應(yīng)[33]。人們繼而發(fā)現(xiàn)這些Kupffer細(xì)胞多肽的抗體可以識(shí)別子孢子表面的Pf-GAPDH。同時(shí),研究者進(jìn)一步通過(guò)試驗(yàn)證明了瘧原蟲子孢子GAPDH是CD68的配體,這兩者的相互作用在抑制子孢子穿越和肝感染中起到關(guān)鍵作用[34]。來(lái)自其他病原體的GAPDH也已被證明是宿主細(xì)胞識(shí)別的配體,因此被評(píng)估為疫苗候選基因[30]。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄水平分析,發(fā)現(xiàn)Es-GAPDH主要在斯氏艾美耳球蟲孢子化卵囊階段轉(zhuǎn)錄水平最高,可能是GAPDH催化產(chǎn)生ATP,為球蟲子孢子入侵宿主提供能量。同時(shí),GAPDH作為子孢子的表面抗原,可被宿主細(xì)胞識(shí)別,引起免疫反應(yīng)。本研究利用動(dòng)物試驗(yàn)證明了重組蛋白rEs-GAPDH免疫實(shí)驗(yàn)兔能夠有效抵抗斯氏艾美耳球蟲的感染,卵囊減少率達(dá)87.09%,為兔球蟲疫苗的研制提供了候選抗原。

細(xì)胞免疫在預(yù)防艾美耳球蟲感染的保護(hù)性免疫反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[35]。雞體內(nèi)的IFN-γ可以通過(guò)抑制雞球蟲子孢子的生長(zhǎng)發(fā)育、參與抗原呈遞等過(guò)程增強(qiáng)宿主的抗球蟲感染能力[36]。IL-2也是參與細(xì)胞免疫的主要細(xì)胞因子,對(duì)球蟲子孢子和裂殖子均產(chǎn)生反應(yīng)[37-38]。抑制雞體內(nèi)的IL-2產(chǎn)生,雞抵抗球蟲的能力會(huì)下降[39]。IL-4、IL-10是介導(dǎo)Th2型反應(yīng)的細(xì)胞因子,在弓形蟲感染中,它們能夠降低炎癥反應(yīng),減少宿主的病理變化[40]。雞巨噬細(xì)胞面對(duì)雞柔嫩艾美耳球蟲刺激時(shí),會(huì)產(chǎn)生IL-10以平衡過(guò)度強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng),避免宿主產(chǎn)生過(guò)量的病理?yè)p傷[41]。TGF-β是一種抗炎性的細(xì)胞因子,參與修復(fù)受損傷的黏膜上皮細(xì)胞,降低宿主的炎性反應(yīng)[42]。IL-17是一種新鑒定的細(xì)胞因子,發(fā)現(xiàn)在雞球蟲感染期間,IL-17在盲腸等組織顯著提高,表明它能在球蟲免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用[43]。本研究中檢測(cè)了細(xì)胞因子(IL-2、IL-4、IL-10、IL-17、TGF-β、IFN-γ),除IL-17的濃度水平與其余攻蟲組無(wú)顯著差異外,免疫組其余細(xì)胞因子水平都存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,說(shuō)明免疫組的重組蛋白能引發(fā)細(xì)胞因子水平的變化,IFN-γ、IL-2等細(xì)胞因子濃度的上調(diào),可能在抗斯氏艾美耳球蟲感染的過(guò)程中起到了一定作用。

研究表明兔球蟲子孢子移行時(shí)通過(guò)血液循環(huán)進(jìn)入肝,故而在兔球蟲免疫應(yīng)答中,體液免疫也應(yīng)當(dāng)被考慮[44]。本研究中檢測(cè)到免疫組的特異性IgG抗體水平較對(duì)照組顯著上升,在攻蟲后仍能維持在較高水平。重組蛋白rEs-GAPDH誘發(fā)產(chǎn)生的特異性IgG抗體可能引起宿主的免疫保護(hù)作用。

在雞球蟲疫苗研究中,GAPDH已經(jīng)被證明是雞的堆型艾美耳球蟲(Eimeriaacervulina)和巨型艾美耳球蟲(Eimeriamaxima)的共同抗原[18]。在雞柔嫩艾美耳球蟲、堆型艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲分別感染及3種球蟲混合感染的情況下呈現(xiàn)出較好的保護(hù)效果(ACI>160),其中,卵囊減少率最高可達(dá)79%[45]。而本研究顯示,rEs-GAPDH可引發(fā)了宿主體內(nèi)的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答,免疫組的卵囊減少率達(dá)87.09%,具有一定免疫保護(hù)作用。Es-GAPDH能否成為對(duì)多種兔球蟲產(chǎn)生共同保護(hù)效果的疫苗抗原,未來(lái)還可深入研究。

4 結(jié) 論

斯氏艾美耳球蟲GAPDH基因在孢子化卵囊階段轉(zhuǎn)錄水平最高。免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示,rEs-GAPDH免疫兔后能減少增重?fù)p失和卵囊排出,減輕肝組織病變,可以引發(fā)宿主體內(nèi)的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答。表明rEs-GAPDH可以作為斯氏艾美耳球蟲基因重組亞單位疫苗的候選抗原。