杜小迪,侯 巍,蘇中華,馬青梅,何 雪,華瑞其,陽愛國*,楊光友*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,成都 611130;2.四川省動物疫病預(yù)防控制中心,成都 610041;3.西藏自治區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心,拉薩 850000;4.青海省海北州海晏縣畜牧獸醫(yī)站,海晏 810200)

囊型棘球蚴病(Cystic echinococcosis, CE),又稱囊型包蟲病,是被忽視的熱帶人畜共患寄生蟲病之一。該病呈世界性分布,造成了嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題和畜牧業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失[1]。該病的病原主要是細(xì)粒棘球絳蟲(Echinococcusgranulosussensulato)的中絳期幼蟲,其主要以包囊的形式生長在中間宿主(綿羊、山羊和牛等)的肝和肺[2]。終末宿主(犬科動物)誤食含有可育包囊的肝和肺后,原頭蚴(Protoscolex, PSCs)在其腸道中外翻并附著在腸黏膜上,經(jīng)過45 d左右發(fā)育為成蟲。每條成蟲每天產(chǎn)生上千個蟲卵,蟲卵隨糞便排出體外。中間宿主誤食蟲卵后,六鉤蚴從蟲卵中孵化出并穿透腸黏膜,通過血液移行到肝等器官,最終長成數(shù)量、大小不等的包囊[3]。

泛素化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的重要過程,廣泛存在于真核生物中,它調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和活性,從而調(diào)節(jié)多條信號通路[4]。蛋白質(zhì)泛素化需要三種關(guān)鍵酶:泛素激活酶(ubiquitin-activating enzyme, E1)、泛素結(jié)合酶(ubiquitin-conjugating enzyme, E2)和泛素連接酶(ubiquitin ligase, E3)。E1的半胱氨酸殘基在ATP的能量供應(yīng)下與泛素(ubiquitin, Ub)的C端甘氨酸殘基結(jié)合,隨后E1將激活的Ub轉(zhuǎn)移到E2上,E2單獨(dú)或通過E3協(xié)作將Ub轉(zhuǎn)移到靶蛋白上。Ub以這樣的方式不斷轉(zhuǎn)移到靶蛋白上形成單泛素化、多單泛素化或聚泛素化[5],聚泛素化常見的泛素連接方式是Lys11、Lys48和Lys63,這是由E2s決定的。Lys11和Lys48通常參與蛋白酶體降解過程,而Lys63參與非蛋白水解過程,如免疫調(diào)節(jié)、DNA修復(fù)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等[6]。在人類中,部分E2s的下調(diào)會增加p53蛋白的穩(wěn)定性從而引起細(xì)胞凋亡,同時,它們也可能通過修飾蛋白分子(TRAF2/5/6、RIP1、IKKγ等)而調(diào)節(jié)某些重要的信號通路(NF-κB)[7]。目前,高粱[8]、玉米[9]、水稻[10]、葡萄[11]和龍眼[12]等植物E2s基因家族的鑒定分析已完成,而寄生蟲E2s基因家族的研究還局限于曼氏血吸蟲[13]。

2013年以來陸續(xù)出現(xiàn)了細(xì)粒棘球絳蟲的組學(xué)研究報(bào)道,其測序多為二代測序如:Roche 454[14]和Illumina Solexa[15-16],但其準(zhǔn)確率不高,且難以檢測序列的變異情況[17]。因此,本研究通過T-A克隆對細(xì)粒棘球絳蟲泛素結(jié)合酶(EgE2s)家族進(jìn)行序列鑒定和生物信息學(xué)分析,通過qRT-PCR分析EgE2s在PSCs和28日齡童蟲中的轉(zhuǎn)錄水平,為探索EgE2s可能的生物學(xué)功能、發(fā)揮功能的調(diào)節(jié)機(jī)制以及構(gòu)建優(yōu)勢表位疫苗等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲體材料 細(xì)粒棘球絳蟲包囊取自中國四川省的某屠宰場,從自然感染的綿羊肝和肺中無菌采集包囊。囊液和PSCs的分離和處理如前所述[18-19]。采用0.4%臺盼藍(lán)染液檢測PSCs的活力,將活性大于95%的PSCs用于后續(xù)試驗(yàn)[20]。收集的蟲體統(tǒng)一進(jìn)行基因型鑒定為G1型[21]。28日齡童蟲由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)寄生蟲病研究中心提供。

1.1.2 主要試劑 總RNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、GoldViewTM核酸染料、2× Taq PCR MasterMix、D2000 Marker和DH5α感受態(tài)細(xì)胞均購自天根生化科技(北京)有限公司;pMD19-T Cloning Kit、2×PrimeSTAR Max Premix和TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ均購自大連寶生物工程有限公司;PBS干粉、0.4%臺盼藍(lán)染液和氨芐青霉素干粉均購自北京索萊寶科技有限公司;八聯(lián)管購自愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司;RevertAid RT 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自賽默飛世爾科技公司;LB肉湯購自青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA合成 將PSCs和28日齡童蟲置于滅菌和過夜冷凍的研缽中,加入適量液氮分別進(jìn)行研磨。參照總RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行RNA的提取,采用NanoDrop 2000分光光度計(jì)測定其濃度。以提取的RNA作為模板,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2EgE2s基因家族的克隆測序 根據(jù)Gene DB (https:∥www.genedb.org/)和NCBI (https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)已發(fā)表的EgE2s的mRNA序列,使用SnapGene version 2.3.2設(shè)計(jì)引物,引物序列(表1)交由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 EgE2s基因家族引物Table 1 Primers of EgE2s gene family

目的基因的克隆方法參照文獻(xiàn)[22]所述,將連接有pMD19-T載體的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,置于37 ℃恒溫?fù)u床以150 r·min-1培養(yǎng)90 min后涂于含Amp的固體LB培養(yǎng)基表面,37 ℃倒置培養(yǎng)12 h。每個基因挑取8個單菌落于1 mL的含Amp的液體LB中培養(yǎng)6 h后進(jìn)行PCR鑒定,將陽性樣品送公司測序。

將測序結(jié)果與NCBI下載的EgE2s序列進(jìn)行比對,若有問題則重復(fù)進(jìn)行以上試驗(yàn)過程,以確定最終序列。

1.2.3EgE2s家族氨基酸序列的分析 從Gene DB和NCBI中下載細(xì)粒棘球絳蟲基因組數(shù)據(jù),并根據(jù)克隆測序的情況進(jìn)行適當(dāng)修正。開放閱讀框、分子量、理論等電點(diǎn)、信號肽、跨膜區(qū)、亞細(xì)胞定位的預(yù)測參照文獻(xiàn)[23]所述方法進(jìn)行。

1.2.4EgE2s家族蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)分析 將EgE2s家族的氨基酸序列提交至在線網(wǎng)站(https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)預(yù)測其二級結(jié)構(gòu)。于在線網(wǎng)站(http:∥www.ebi.ac.uk/interpro/)預(yù)測EgE2s的活性位點(diǎn)半胱氨酸位置。SWISS-MODEL在線網(wǎng)站(https:∥swissmodel.expasy.org/interactive)預(yù)測其三級結(jié)構(gòu)。

1.2.5EgE2s家族的多序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析 通過Clustal Omega (https:∥www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)進(jìn)行EgE2s的多序列比對,手動裁減兩端非保守序列。從UniProt (https:∥www.uniprot.org/)和NCBI中下載多房棘球絳蟲E2s (Echinococcusmultilocularis,EmE2s)、亞洲帶絳蟲E2s (Taeniaasiatica,TaE2s)、曼氏血吸蟲E2s (Schistosomamansoni,SmE2s)和秀麗隱桿線蟲E2s (Caenorhabditiselegans,CeE2s)的氨基酸序列。利用MEGA 7.0軟件對其進(jìn)行多序列比對,TBtools version 1.098 32自動刪除歧義比對的序列以產(chǎn)生140個氨基酸的比對,用于隨后的鄰接法(Neighbor-joining, NJ)分析并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,Bootstrap值設(shè)置為1000。

1.2.6EgE2s家族的基因結(jié)構(gòu)和蛋白保守基序分析 提取EgE2s基因組序列和編碼序列(Coding sequence, CDS),將其與EgE2s家族的樹文件輸入在線網(wǎng)站GSDS (http:∥gsds.gao-lab.org/)進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)圖的繪制。

使用在線網(wǎng)站MEME version 5.3.3 (https:∥meme-suite.org/meme/tools/meme)分析EgE2s基因家族的保守基序,參數(shù)設(shè)置:motif最大查找數(shù)為7,其他參數(shù)為默認(rèn)值。

1.2.7EgE2s的組織特異性表達(dá)分析 以Zheng等[24]測得的細(xì)粒棘球絳蟲4個發(fā)育階段(成蟲、六鉤蚴、原頭蚴、包囊)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為準(zhǔn),獲取EgE2s基因的RPKM (Reads Per Kilobase Million)值,用以表示基因的表達(dá)豐度。為方便統(tǒng)計(jì),對每個表達(dá)數(shù)值取以2為底數(shù)的對數(shù)(log2),使用TBtools version 1.098 32繪制基因表達(dá)熱圖。

1.2.8 qRT-PCR檢測EgE2s在PSCs、28日齡童蟲中的轉(zhuǎn)錄水平 為測定和分析EgE2s在不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄水平,篩選PSCs階段特異性表達(dá)的EgE2s。將EgE2s序列上傳至生工生物工程(上海)股份有限公司網(wǎng)站(https:∥www.sangon.com/userLogin)設(shè)計(jì)特異的qRT-PCR引物(表2)。BLSAT(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)檢查引物是否特異。

表2 EgE2s基因家族qRT-PCR引物Table 2 qRT-PCR primers of EgE2s gene family

以各階段蟲體cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增,EgGAPDH和EgEFα作為內(nèi)參基因進(jìn)行分析,反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參考前人所述[21]。結(jié)果采用ΔΔCt(Qr=2-ΔΔCt)法進(jìn)行分析。

1.2.9EgE2D2和EgE2N的B/T細(xì)胞抗原表位預(yù)測 抗原表位的研究對疾病的診斷、免疫治療及疫苗分子結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)等具有重要意義。細(xì)粒棘球絳蟲組學(xué)文獻(xiàn)表明,EgE2D2和EgE2N通過外泌體[25]/胞外囊泡[26]分泌出去。故本研究通過在線網(wǎng)站IDBE(http:∥tools.immuneepitope.org/main/)和ABCpred(https:∥webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/ABC_submission.html)對其B/T細(xì)胞抗原表位進(jìn)行了預(yù)測。T細(xì)胞抗原表位預(yù)測分別選擇HLA-A*0201(人類)與DLA-88*50101(犬),%Rank<0.5%與%Rank>2%的分別為強(qiáng)結(jié)合MHC Ⅰ類分子和弱結(jié)合MHC Ⅰ類分子[27]。

2 結(jié) 果

2.1 EgE2s基因家族的克隆測序結(jié)果

成功克隆測序了19個EgE2s基因,其中EgE2I為相撲結(jié)合酶(SUMO-conjugating enzyme),EgE2V2為泛素結(jié)合酶突變體。所有EgE2s有完整的ORF框,PCR結(jié)果條帶清晰,較為單一(圖1),其CDS序列在350～1 600 bp之間。EgE2L3的CDS序列與數(shù)據(jù)庫序列相差了12個堿基,EgE2J1的CDS序列與數(shù)據(jù)庫序列兩端有差異,本團(tuán)隊(duì)向NCBI重新上傳了其CDS序列,登錄號分別為EgE2L3: MZ277618;EgE2J1: MZ277619,且EgE2J2的CDS序列(XM_024496294.1)與NCBI數(shù)據(jù)庫序列一致。

1～19. 分別為EgE2R1、EgE2G2、EgE2G1、EgE2J2、EgE2Z、EgE2I、EgE2H、EgE2C、EgE2B、EgE2A、EgE2S、EgE2N、EgE2-25、EgE22、EgE2D2、EgE2-24、EgE2V2、EgE2L3、EgE2J1; M. 基因分子量標(biāo)準(zhǔn)1-19. Represent EgE2R1, EgE2G2, EgE2G1, EgE2J2, EgE2Z, EgE2I, EgE2H, EgE2C, EgE2B, EgE2A, EgE2S, EgE2N, EgE2-25, EgE22, EgE2D2, EgE2-24, EgE2V2, EgE2L3, EgE2J1, respectively. M. Marker圖1 EgE2s家族基因PCR結(jié)果Fig.1 PCR results of EgE2s gene family

2.2 EgE2s基因家族的序列分析

將19個EgE2s的氨基酸序列提交至ExPASY等軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)的長度、分子量、等電點(diǎn)、跨膜區(qū)、信號肽和活性位點(diǎn)等進(jìn)行分析(表3)。結(jié)果顯示,EgE2s的CDS序列在354～1 605 bp之間,氨基酸長度在117～534 aa之間,對應(yīng)的分子量為13.39～57.17 ku。EgE2s的等電點(diǎn)為4.41～9.06,除了EgE2-25、EgE2S、EgE2I外,其余蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)均小于7.00。信號肽預(yù)測顯示EgE2s均沒有信號肽?？缒の稽c(diǎn)預(yù)測顯示,只有EgE2J1和EgE2J2具有跨膜區(qū),分別位于第505～527和214～236位氨基酸。EgE2s蛋白大部分位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中;分布于細(xì)胞膜的有EgE2L3、EgE2J1和EgE2C;分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的只有EgE2G2。使用InterPro在線網(wǎng)站預(yù)測了EgE2s的半胱氨酸活性位點(diǎn)的位置(表3)且標(biāo)注在了三級結(jié)構(gòu)中(圖2)。EgE2V2與泛素結(jié)合酶在氨基酸序列和結(jié)構(gòu)上高度相似,但其不具有活性位點(diǎn)半胱氨酸,因而缺乏催化活性。

方框圈注為活性位點(diǎn)位置The box is the position of active site圖2 EgE2s三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.2 The three dimensional (3D) structures of EgE2s

表3 EgE2s基因家族的基本信息Table 3 Basic information of EgE2s gene family

2.3 EgE2s家族蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

EgE2s家族蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測(表3)表明:19個EgE2s蛋白均含有α-螺旋(17.14%～51.47%),除EgE2V2和EgE2J1的α-螺旋占比分別為17.14%和28.65%外,其余EgE2s的α-螺旋占比均大于30%。EgE2s的β-轉(zhuǎn)角占比在2.61%～6.88%之間,延伸鏈占比在10.58%～21.05%之間,無規(guī)則卷曲占比在29.90%～58.57%之間。

三級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示:19個EgE2s蛋白基本上都含有4個α-螺旋,4個β-折疊,構(gòu)成了EgE2s家族的保守催化“核心”結(jié)構(gòu)域(UBC結(jié)構(gòu)域)(圖2)[28]。結(jié)合三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測及相關(guān)文獻(xiàn)對E2s的分類[29],認(rèn)為EgE2A、EgE2B、EgE2D2、EgE2G1、EgE2G2、EgE2I、EgE2L3、EgE2N、EgE22、EgE2-24屬于Class Ⅰ,EgE2C、EgE2V2屬于Class Ⅱ,EgE2H、EgE2J1、EgE2J2、EgE2R1、EgE2S、EgE2-25屬于Class Ⅲ。

2.4 EgE2s基因家族的多序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化分析

將EgE2s氨基酸序列進(jìn)行了多序列比對,發(fā)現(xiàn)該家族內(nèi)部的氨基酸序列相似性較低(圖3)。然而,這并不影響其具有150～200個氨基酸組成的UBC結(jié)構(gòu)域。

不同顏色矩形中的氨基酸序列對應(yīng)圖5的保守基序The amino acid sequences in different color rectangles correspond to the conserved motifs in Fig.5圖3 EgE2s氨基酸序列比對Fig.3 Alignment of EgE2s amino acid sequences

為探究細(xì)粒棘球絳蟲與其他物種E2s家族的進(jìn)化關(guān)系,本研究下載了多房棘球絳蟲E2s (Echinococcusmultilocularis,EmE2s)、亞洲帶絳蟲E2s (Taeniaasiatica,TaE2s)、曼氏血吸蟲E2s (Schistosomamansoni,SmE2s)和秀麗隱桿線蟲E2s (Caenorhabditiselegans,CeE2s)各19、11、20和16條氨基酸序列。根據(jù)與曼氏血吸蟲E2s蛋白的同源性[30],對細(xì)粒棘球絳蟲的E2s的名字進(jìn)行了標(biāo)注并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)。結(jié)果表明,細(xì)粒棘球絳蟲、多房棘球絳蟲和曼氏血吸蟲的E2s之間親緣關(guān)系較近。

圖4 EgE2s的系統(tǒng)進(jìn)化樹(NJ樹)Fig.4 Phylogenetic tree of EgE2s (Neighbor-joining, NJ)

2.5 EgE2s家族基因結(jié)構(gòu)和蛋白保守基序分析

為更好地了解EgE2s基因的結(jié)構(gòu)多樣性,本研究將EgE2s基因的內(nèi)含子/外顯子排列和保守基序做了比較。結(jié)果顯示,EgE2A和EgE2B只含有1個外顯子,且無內(nèi)含子,EgE22含有2個外顯子,其余EgE2s基因都含有3～7個外顯子。不同EgE2s成員的基因結(jié)構(gòu)差異較大。EgE2R1含有下游結(jié)構(gòu),EgE2I和EgE2C含有上游結(jié)構(gòu),其他EgE2s無上、下游結(jié)構(gòu)(圖5)。

圖5 EgE2s基因結(jié)構(gòu)和保守基序Fig.5 Gene structure and conserved motifs of EgE2s

EgE2s家族蛋白的保守基序預(yù)測表明(不同顏色的方塊表示不同的motif)(圖5):該家族蛋白序列含有的保守基序較為一致,大部分EgE2s都含有6個保守基序。EgE2s最少,只含有3個。

2.6 EgE2s在4個發(fā)育階段中的表達(dá)譜分析

從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)提取了19個EgE2s在細(xì)粒棘球絳蟲4個發(fā)育階段中的基因表達(dá)譜。結(jié)果表明,EgE2s的表達(dá)量在不同發(fā)育階段有較大的差異(圖6)。值得注意的是,EgE2D2在4個發(fā)育階段均呈現(xiàn)出了極高的表達(dá)水平。EgE2J1和EgE2J2在4個階段的表達(dá)量都較低甚至在六鉤蚴(Oncospheres)時期不表達(dá),EgE2A、EgE2V2和EgE2L3在六鉤蚴時期也不表達(dá)。同時,EgE2G2在PSCs中不表達(dá)。

2.7 qRT-PCR檢測EgE2s在PSCs、28日齡童蟲中的轉(zhuǎn)錄水平

以PSCs、28日齡童蟲的cDNA為模板,對19個EgE2s基因進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增,采用內(nèi)參基因EgGAPDH、EgEFα的幾何平均值進(jìn)行分析[31],表明EgE2s的轉(zhuǎn)錄水平在各個階段存在差異,其中EgE2A、EgE2J1在PSCs階段相對于28日齡童蟲階段高表達(dá),具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001,P<0.01,圖7)。

ns. 差異不顯著;*. P<0.05;**. P<0.01;***、****. P<0.001ns. No significant difference; *. P<0.05;**. P<0.01;***, ****.P<0.001圖7 EgE2s在不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄水平Fig.7 Transcription levels of EgE2s at different developmental stages

2.8 EgE2D2和EgE2N的B/T細(xì)胞抗原表位預(yù)測

將ABCpred預(yù)測閾值>0.8[32]與IEDB預(yù)測的氨基酸序列區(qū)域整合后確定為最終EgE2D2、EgE2N的優(yōu)勢B細(xì)胞抗原表位區(qū)域分別為:38-54、59-63、70-86、114-119、129-137;14-21、36-48、57-65、117-122、139-157。

IEDB預(yù)測EgE2D2、EgE2N與人MHC Ⅰ類分子強(qiáng)結(jié)合的位點(diǎn)分別為:91-99(0.52%);58-66(0.07%)、104-113(0.34%)。EgE2D2、EgE2N與犬MHC Ⅰ類分子強(qiáng)結(jié)合的位點(diǎn)分別為:5-13(0.38%);8-16(0.09%)、104-113(0.35%)。

3 討 論

在NCBI和DB數(shù)據(jù)庫中各提取到22條[24]和19條[30]EgE2s序列,通過DNAMAN進(jìn)行序列比對后整合為22條EgE2s序列。在本研究中,對EgE2-17、EgE2F、EgUBC12更換引物多次均未能克隆出正確序列,這可能是因?yàn)槎鷾y序技術(shù)本身的缺點(diǎn),即PCR擴(kuò)增前后的DNA會發(fā)生相對頻率和豐度的改變,且該技術(shù)難以檢測變異的堿基,從而影響了測序結(jié)果的準(zhǔn)確性[33];且不能完全避免序列的拼接錯誤。因此,根據(jù)研究需求組合多種測序技術(shù)[34]以及運(yùn)用多種識別錯誤拼接的方法[35]對提高序列的準(zhǔn)確性是有必要的。

泛素結(jié)合酶是泛素蛋白酶體系統(tǒng)的核心,它決定了靶蛋白的泛素連接類型而影響靶蛋白的生物學(xué)活性[36]。有研究表明癌細(xì)胞中高表達(dá)的E2s活躍調(diào)節(jié)各個信號通路,從而認(rèn)為這些E2s可能為潛在的癌癥診斷標(biāo)志物[37]和治療靶點(diǎn)[38],例如:抑制人肺癌細(xì)胞的E2D可穩(wěn)定p53,從而促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡[39];E2D2通過修飾TRAF2/5以及IκBα參與NF-κB信號的傳遞,從而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答[4]。本研究表明,EgE2s擁有與哺乳動物相似的UBC結(jié)構(gòu)域和活性位點(diǎn),在細(xì)粒棘球絳蟲的4個發(fā)育階段中EgE2D2均呈現(xiàn)出了極高的表達(dá)水平,說明EgE2D2可能在細(xì)粒棘球絳蟲各個生長發(fā)育階段起著抗凋亡的功能,還可能參與了抵抗宿主免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)。僅有的幾項(xiàng)寄生蟲E2s功能研究表明,旋毛蟲E2L3被分泌到宿主成肌細(xì)胞,影響宿主的泛素蛋白酶體系統(tǒng),從而有利于寄生蟲的生存[40];阿米巴原蟲E2G2的失活顯著抑制其噬紅細(xì)胞功能[41];布氏錐蟲E2R1的失活導(dǎo)致胞質(zhì)分裂受阻而影響其在小鼠體內(nèi)的生存[42]。這說明,目前寄生蟲E2s的功能研究主要集中在其如何促進(jìn)寄生蟲在宿主體內(nèi)生存,推測EgE2D2的功能也是如此。

Platts等[43]表明,泛素蛋白酶體系統(tǒng)的組成部分是畸精癥患者精子中差異表達(dá)較強(qiáng)的部分。E2A的突變或缺乏主要與X連鎖智力障礙有關(guān)[44],而敲除E2J1使雄性小鼠精細(xì)胞胞質(zhì)去除不完全,影響成熟精子細(xì)胞向生精小管腔的釋放而導(dǎo)致不育,且E2J2不能彌補(bǔ)這種效應(yīng)[45]。本研究發(fā)現(xiàn),EgE2A和EgE2J1在PSCs時期的轉(zhuǎn)錄水平相對于28日齡童蟲高表達(dá),且有顯著性差異。因此推測,EgE2A和EgE2J1在原頭蚴生長發(fā)育中可能有重要作用。

寄生蟲病仍是發(fā)展中國家亟待解決的公共衛(wèi)生問題,尤其是我國西部地區(qū),犬的放養(yǎng)及其感染后無明顯臨床表現(xiàn)使其成為細(xì)粒棘球絳蟲傳播的重要原因[46]。目前,預(yù)防包蟲病較好的疫苗源于細(xì)粒棘球絳蟲(G1型)的EG95基因工程亞單位疫苗,由于其對G6/G7型的交叉保護(hù)作用減少或消失[47],且免疫中間宿主的人力和時間消耗較大,研制預(yù)防終末宿主感染的疫苗迫在眉睫。反向疫苗學(xué)縮短了疫苗開發(fā)的時間和成本,其第一步是通過基因組信息尋找優(yōu)勢抗原表位[48]。因此,本研究通過B細(xì)胞抗原表位預(yù)測發(fā)現(xiàn),EgE2N的139-157區(qū)域位于EgE2s保守區(qū)域外。同時,EgE2N的T細(xì)胞抗原表位預(yù)測對人和犬MHC Ⅰ類分子各有2個強(qiáng)結(jié)合位點(diǎn),且有一個共同的抗原表位位點(diǎn)104-113,二級結(jié)構(gòu)顯示β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲的比例達(dá)到45%,表明這兩段區(qū)域可能是藥物研究和疫苗開發(fā)的靶序列[49]。

4 結(jié) 論

基于細(xì)粒棘球絳蟲基因組數(shù)據(jù),本研究在細(xì)粒棘球絳蟲中成功克隆并測序19個EgE2s基因,更正了兩個原序列有誤的EgE2s,登錄號分別為EgE2L3: MZ277618;EgE2J1: MZ277619。三級結(jié)構(gòu)和保守基序預(yù)測結(jié)果表明EgE2s高度保守。qRT-PCR結(jié)果顯示EgE2s的轉(zhuǎn)錄水平在PSCs和28日齡童蟲中存在差異,其中EgE2A、EgE2J1在PSCs階段高表達(dá)。B細(xì)胞抗原表位預(yù)測表明EgE2N的139-157區(qū)域位于EgE2s保守基序外。同時,T細(xì)胞抗原表位預(yù)測表明EgE2N與人和犬MHC Ⅰ類分子各有兩個強(qiáng)結(jié)合位點(diǎn),且有一個共同的抗原表位位點(diǎn)104-113。綜上,EgE2A和EgE2J1可能在PSCs的生長發(fā)育中起重要作用。EgE2N的139-157和104-113區(qū)域可能是藥物研究和疫苗開發(fā)的靶序列。本研究將為細(xì)粒棘球絳蟲的生長發(fā)育和疫苗研發(fā)提供新的思路、新的方向。