李 蔚,張 強,瞿嘉豪,吳亞平,胡若辰,賈若藝,郭如海,馬清義,潘廣林*,王興龍*

(1.西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院,楊凌 712100;2.秦嶺大熊貓研究中心(陜西省珍稀野生動物救護基地),周至 710400)

大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)是以竹為主食的食肉目(Carnivora)動物,是我國特有的珍稀保護動物[1],因其具有獨特的飲食結(jié)構(gòu)備受關(guān)注。消化系統(tǒng)疾病是導致大熊貓等野生動物數(shù)量減少以及種群瀕危的重要因素之一[2],當大熊貓的生活方式、飲食結(jié)構(gòu)等因素發(fā)生變化時,可能導致腸道菌群的失衡,進而引發(fā)腸道性疾病并使機體處于亞健康狀態(tài)甚至出現(xiàn)死亡[3-4],因此研究大熊貓腸道菌群的結(jié)構(gòu)組成,對保護大熊貓具有重要的意義。

腸道菌群在大熊貓的生長發(fā)育、營養(yǎng)吸收、代謝以及免疫等方面發(fā)揮重要作用[5-6],由于目前暫未發(fā)現(xiàn)大熊貓體內(nèi)含有與纖維素降解直接相關(guān)的基因,因此推測其主要依賴腸道菌群產(chǎn)生纖維素酶或編碼纖維素代謝相關(guān)的基因來進行降解[7]。先前的研究表明,厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)是大熊貓腸道內(nèi)主要優(yōu)勢菌門[8],且年齡對大熊貓腸道菌群結(jié)構(gòu)和數(shù)量會產(chǎn)生一定的影響[9],但對于不同年齡段大熊貓在腸道菌群多樣性、結(jié)構(gòu)組成和功能上的動態(tài)變化及演替規(guī)律研究尚淺。因此本試驗采集了16只不同年齡段大熊貓的新鮮糞便,基于16 S rRNA高通量測序技術(shù)[10]和層次聚類結(jié)果分為不同年齡段的5組進行分析,以探究不同年齡段大熊貓腸道菌群多樣性、結(jié)構(gòu)組成和功能的演替規(guī)律,為大熊貓腸道性疾病的防治提供思路。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與分組

在秦嶺大熊貓研究中心采集不同年齡段大熊貓的新鮮糞便共16份(表1),采樣期間大熊貓狀態(tài)良好,無疾病等異常情況,糞樣采集后用冰盒保存帶回實驗室,-20 ℃冷凍保存。

表1 大熊貓基本信息Table 1 Basic information of giant panda

1.2 總DNA提取、文庫構(gòu)建及測序

依照DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)說明書步驟進行操作,提取糞便中所有細菌DNA,利用PCR擴增試劑盒結(jié)合引物515F-806R對細菌DNA的16 S rDNA V4區(qū)域進行擴增(前端引物:5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′,后端引物:5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′),并對PCR產(chǎn)物的片段長度和濃度進行篩選,主帶長度篩選條件為290～310 bp。按照標準流程進行建庫操作,檢測合格的文庫用 Illumina Nova 6000 平臺進行雙末端250 bp測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

fastp 0.23.2[11]軟件對測序原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)控,usearch 10.0軟件的UPARSE聚類方法對非重復序列進行聚類,以97% 相似性水平將有效序列聚類成操作分類單元(operational taxonomic units,OTU),并基于SILVA數(shù)據(jù)庫進行物種注釋。ggplot2 3.3.6繪制樣品的豐富度稀釋曲線(richness rarefaction curve)以反映樣品中微生物多樣性信息,使用平均連接法(average-linkage clustering)的聚類分析方法和Chisq距離算法對樣品進行層次聚類(hierarchical clustering),并將聚類結(jié)果與屬水平上物種相對豐度整合。QIIME 2 2 021.2軟件計算樣品的Chao1、Simpson和Dominance等Alpha多樣性指數(shù)[12-13],并基于單因素方差分析(one-way ANOVA)比較各指數(shù)間差異,R軟件的vegan包進行非參數(shù)多元方差分析(non-parametric multivariate analysis of variance,ADONIS)和非度量多維尺度分析 (non-metric multidimensional scaling,NMDS),均采用bray_curtis距離算法。

2 結(jié) 果

2.1 測序數(shù)據(jù)信息

對下機數(shù)據(jù)進行質(zhì)控、拼接和去噪后,16份糞便樣品共獲得1 235 229條高質(zhì)量序列,平均每個樣品77 202條序列?；?7%相似性水平進行OTU聚類,共獲得1 707個OTU,包括12個門,22個綱,47個目,68個科,90個屬。

以重抽樣抽出的序列數(shù)比例作為橫坐標,OTU水平下物種豐富度(species richness)作為縱坐標,進一步構(gòu)造物種稀釋性曲線。由圖1可知,隨著抽出序列數(shù)比例的增加,腸道菌豐富度先顯著升高,后趨于平緩,這表明隨著樣品序列數(shù)量不斷增加,檢測到大熊貓腸道菌的種類數(shù)目逐漸穩(wěn)定,即便樣品序列數(shù)繼續(xù)增加,檢測到新的腸道菌種類也是有限的。因此本試驗的測序數(shù)據(jù)量足夠大,能夠檢測到樣品中絕大部分的微生物信息,可用于后續(xù)分析。

圖1 97%相似度水平下各樣品的腸道菌群豐富度稀釋曲線Fig.1 Dilution curve of intestinal flora abundance of each sample at 97% similarity level

2.2 大熊貓腸道菌群層次聚類分析

層次聚類分析能反映樣品的腸道菌群結(jié)構(gòu)及樣品間的相似度。結(jié)果顯示(圖2),編號為16的老年大熊貓腸道菌群結(jié)構(gòu)單獨聚為一個類別,其余大熊貓聚為一個類別。編號為1、2、3、4的亞成年大熊貓位于同一樹杈分支點下,編號為5、6,編號為9、10及編號為13、14、15的成年大熊貓分別聚類到不同的樹杈分支點下,且相同年齡的雌性和雄性大熊貓腸道菌群沒有明顯差異。依據(jù)層次聚類結(jié)果,將16只大熊貓分為5組(表2),分別為2～3歲亞成年組(G1)、8～9歲成年組(G2)、13～14歲成年組(G3)、18～22歲成年組(G4)、34歲老年組(G5)。年齡相近的大熊貓腸道菌群結(jié)構(gòu)相似性較高,年齡差異越大的腸道菌群結(jié)構(gòu)差異越大,從而形成鮮明的菌群差異派別。

聚類樹后的數(shù)字為大熊貓編號,黑色數(shù)字表示雌性大熊貓,棕色數(shù)字表示雄性大熊貓The number behind the cluster tree is the giant panda number, black numerals refer to female giant pandas and brown numerals refer to male giant pandas圖2 各樣品在屬水平的層次聚類分析Fig.2 Hierarchical cluster analysis of samples at genus level

表2 大熊貓分組信息Table 2 Group information of Giant pandas

2.3 大熊貓腸道菌群的多樣性分析

Alpha多樣性指數(shù)包括Chao 1指數(shù)、Simpson指數(shù)和Dominance指數(shù)等,能夠分別衡量大熊貓腸道菌群豐富度、群落多樣性以及物種均勻度等,其中Simpson 指數(shù)值與群落多樣性呈負相關(guān)。結(jié)果可知,不同年齡組的大熊貓在Chao1指數(shù)上無顯著差異(P>0.05),2～3歲亞成年組和34歲老年組的Simpson指數(shù)顯著高于18～22歲成年組(P<0.05),老年組的Dominance 指數(shù)顯著低于18～22歲成年組(P<0.05)(表3)。上述結(jié)果表明,不同年齡段大熊貓在菌群豐富度上差異不大,2～3歲亞成年大熊貓的腸道菌群在群落多樣性上明顯低于18～22歲大熊貓,34歲老年大熊貓在腸道微生物群落多樣性以及均勻度上明顯低于18～22歲大熊貓。綜合3個指數(shù)結(jié)果表明,大熊貓腸道菌群Alpha多樣性隨著年齡增大呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,且在18～22歲達到最高。

表3 不同年齡組大熊貓腸道菌群Alpha多樣性指數(shù)Table 3 Alpha diversity index of intestinal microflora of giant panda in different age

Beta多樣性能對不同樣本間的微生物群落構(gòu)成進行比較。NMDS分析能在二維平面判斷群落組成差異,結(jié)果如圖3所示,2～3歲亞成年大熊貓的腸道菌群較為聚集,與其余4組存在一定距離,而8～9、13～14及18～22歲成年大熊貓腸道菌群分離較明顯,組間距離近。ADONIS分析能判斷分組效果是否顯著,結(jié)果可知,除僅有34歲大熊貓所在的G6不參與組間差異比較外,其余各比較組在OTU水平差異程度均>0.25且<0.5,說明組間存在差異,但差異不大,且除G3vsG4比較組外,其余差異比較組的P值均<0.05,說明不同分組對樣品差異的解釋具有可信度(表4)。綜合以上結(jié)果表明,雖然各組內(nèi)腸道菌群存在差異,但組間差異仍大于組內(nèi)差異,即該分組具有可信度。

圖3 不同年齡組間腸道菌群NMDS分析Fig.3 NMDS analyze of intestinal flora between different age groups

表4 不同年齡比較組間ADONIS統(tǒng)計結(jié)果Table 4 Statistical results of ADONIS between different age groups

2.4 不同年齡段大熊貓腸道菌群在門和屬水平的演替

首先從門水平對大熊貓共有以及特有腸道菌群進行分析,如圖4A所示,5個年齡段組包含6個共有腸道菌門,34歲組包含1個特有菌門,為藍細菌門(Cyanobacteria)。如圖5A所示,5個年齡組中共有優(yōu)勢菌門為厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)和Epsilonbacteraeota,平均豐度為60.44%、38.69%和5.37%;變形菌門在2～3歲組的相對豐度最高,為66.50%;厚壁菌門在34歲組的相對豐度最高,為70.73%,由此推斷出,隨著大熊貓年齡增長,厚壁菌門的相對豐度逐漸增加,變形菌門的相對豐度逐漸降低。

A. 在門水平的花瓣Venn圖;B.在屬水平的花瓣Venn圖。圖中不同顏色代表不同的分組,重疊區(qū)域表示5個年齡段共有的功能數(shù)目,非重疊區(qū)域表示5個年齡段各自特有的功能數(shù)目A. Venn diagram of petals at the door level; B. Venn diagram of petals at the genus level. Different colors in the figure represent different groups. Overlapping areas represent the number of functions shared by the five age groups, while non overlapping areas represent the number of functions unique to each of the five age groups圖4 大熊貓腸道菌群在門水平(A)和屬水平(B)的Venn圖Fig.4 Venn diagram of intestinal flora of giant pandas at phyla level (A) and genus level (B)

A. 門水平的物種相對豐度;B. 屬水平的物種相對豐度。不同顏色表示不同腸道菌種類A. Species relative abundance at the phyla level; B. Species relative abundance at the genus level. Different colors indicate different types of intestinal bacteria圖5 大熊貓腸道菌群在門水平(A)和屬水平(B)的物種相對豐度Fig.5 Species relative abundance of giant panda intestinal flora at phyla level (A) and genus level (B)

在屬水平上,如圖4B所示,5個年齡段組包含42個共有腸道菌屬,2～3歲組包含7個特有菌屬,占比前兩個分別為冷桿菌屬(Psychrobacter)和梭狀芽胞桿菌屬(Shuttleworthia);8～9歲組包含7個特有菌屬,占比前兩個分別為Ruminiclostridium_5和帕拉蘇特菌屬(Parasutterella);13～14歲組包含5個特有菌屬,占比前兩個分別為海洋芽胞桿菌屬(Oceanobacillus)和根瘤菌屬(Rhizorhapis);18～22歲組包含3個特有菌屬,占比前兩個分別為黃桿菌屬(Luteolibacter)和假黃色單胞菌屬(Pseudoxanthomonas);34歲組包含1個特有菌屬,為Aliterella_CENA595。如圖5B所示,5個年齡組中共有優(yōu)勢菌屬為變形菌門的埃希菌屬-志賀菌屬(Escherichia/Shigella)和厚壁菌門的狹義梭菌屬1(Clostridium_sensu_stricto_1),平均豐度分別為57.35%和15.17%;13～14歲組的優(yōu)勢菌屬為魏斯菌屬(Weissella),其平均豐度為9.975%,顯著高于其他四組(P<0.05),34歲組的優(yōu)勢菌屬為八疊球菌屬(Sarcina),其平均豐度為53.29%,顯著高于其他4組(P<0.05)。

2.5 大熊貓腸道菌群基因功能預測

通過統(tǒng)計COG的L2水平和KEGG通路的L2水平上的功能組成和豐度信息,并進行聚類分析,能預測出不同年齡段大熊貓的腸道菌群基因在功能上的差異。如圖6所示,在COG的L2水平上,13～14歲成年大熊貓腸道菌群基因在細胞運動(cell motility)功能的相對豐度最低,在脂質(zhì)轉(zhuǎn)運與代謝(lipid transport and metabolism)的相對豐度最高;34歲老年大熊貓在碳水化合物轉(zhuǎn)運和代謝(carbohydrate transport and metabolism)、氨基酸轉(zhuǎn)運和代謝(amino acid transport and metabolism)的相對豐度低于其他年齡段大熊貓,在轉(zhuǎn)錄(transcription)、防御機制(defense mechanisms)、信號轉(zhuǎn)導機制(signal transduction mechanisms)的相對豐度高于其他年齡段大熊貓。如圖7所示,在KEGG通路的L2水平上,G2、G3、G4 3個成年大熊貓組別在代謝相關(guān)的途徑上相對豐度相似,2～3歲亞成年大熊貓在信號傳導途徑(signal transduction)的相對豐度高于成年和老年大熊貓;34歲老年大熊貓在其他次級代謝物的生物合成途徑(biosynthesis of other secondary metabolites)、復制和修復途徑(replication and repair)、細胞生長與死亡途徑(cell growth and death)等方面的相對豐度高于其他年齡段。由此可推斷出,不同年齡段大熊貓腸道菌群中基因功能存在差異。

橫軸為不同分組,縱軸為各個COG編號,左側(cè)聚類樹為功能聚類樹,上方聚類樹為樣品聚類樹,色塊表示每個分組對應的COG相對豐度,豐度高低用顏色深淺來表征The horizontal axis refers to different groups, and the vertical axis refers to each COG number,the left clustering tree refers to the functional clustering tree, the upper clustering tree refers to the sample clustering tree. The color block represents the relative abundance of COG corresponding to each group, and the abundance is represented by the color depth圖6 大熊貓腸道菌群基因功能在COG的L2水平的聚類熱圖Fig.6 Cluster heat map of gene function of giant panda intestinal flora at L2 level of COG

3 討 論

機體的消化代謝、免疫功能等與腸道菌群多樣性息息相關(guān),腸道菌群能通過刺激腸道上皮分泌黏液等多種途徑加強腸道的屏障保護作用,以維持腸道結(jié)構(gòu)完整性,當腸道菌群多樣性降低時,腸道黏膜修復能力下降,更易引起病原體的侵入和腸道性疾病的發(fā)生[14-15]。Xue等[16]報道,雌性和雄性大熊貓腸道菌群沒有顯著性差異,本試驗層次聚類結(jié)果也表明,相同年齡的雌性和雄性大熊貓腸道菌群結(jié)構(gòu)沒有明顯差異,所以性別差異對本試驗沒有影響。

大熊貓年齡劃分一直存在爭議,胡錦矗曾根據(jù)大熊貓咬節(jié)值及糞團直徑將大熊貓分為幼年組(0～1.5歲)、青年組(1.5～5.5歲)、成年組(5.5～20歲)和老年組(20歲以上),而胡杰等[17]基于離差平方和聚類的方法對大熊貓年齡劃分進行了優(yōu)化,并認為該方法避免了人為因素,值得進一步實踐和推廣。但上述基于咬節(jié)值的年齡劃分結(jié)果中,成年組跨度均較大,直接應用于大熊貓腸道菌群結(jié)構(gòu)分析難以具有說服力,因此本試驗采用層次聚類方法,通過聚類圖對11只成年大熊貓進一步分組,最終將16只大熊貓分為2～3歲亞成年組(4只)、8～9歲成年組(4只)、13～14歲成年組(4只)、18～22歲成年組(3只)及34歲老年組(1只),并通過Beta多樣性分析得出,除僅有34歲大熊貓所在的G5不參與組間差異比較外,其余各組的組間差異均大于組內(nèi)差異,即該分組具有可信度。層次聚類結(jié)果還顯示,34歲老年大熊貓與亞成年、成年大熊貓腸道菌群的結(jié)構(gòu)組成差異較大,羅亞等的研究結(jié)果也表明,亞成年、成年大熊貓在腸道菌群結(jié)構(gòu)和優(yōu)勢菌群上與老年大熊貓具有顯著差異[14]。這提示大熊貓腸道菌群結(jié)構(gòu)隨年齡增長處于動態(tài)變化過程中,飼養(yǎng)人員需要在大熊貓不同年齡階段(尤其是老年階段)補充不同的營養(yǎng)物質(zhì)以維持腸道菌群的穩(wěn)態(tài)。

崔明全等[18]的研究顯示,成年圈養(yǎng)大熊貓的腸道菌群Alpha多樣性最高,其次分別是亞成體和老年體。本試驗進一步完善了崔明全等[18]的研究結(jié)論,即不同年齡段大熊貓腸道菌群Alpha多樣性具有顯著差異(P<0.05),其中群落多樣性及均勻度呈現(xiàn)隨年齡增長先增加后降低的趨勢,在18～22歲達到最高。

大熊貓的腸道優(yōu)勢菌群以及與纖維素、半纖維素降解相關(guān)酶的豐度與食肉動物接近,而顯著不同于食性相似的食草動物[19]。Tun等[20]證實,厚壁菌門和變形菌門是老年和成年大熊貓中最豐富的微生物群,且不同年齡段的大熊貓腸道內(nèi)優(yōu)勢菌群既有相似性,也存在一定差異[21]。在門水平,本試驗中不同年齡段的大熊貓共有優(yōu)勢菌門為厚壁菌門、變形菌門和Epsilonbacteraeota,且隨著大熊貓年齡增長,厚壁菌門的相對豐度逐漸增加,變形菌門的相對豐度逐漸降低。目前對Epsilonbacteraeota的研究極少,據(jù)Waite等[22]報道,該門與變形菌門聯(lián)系緊密,近些年才將變形菌門下的一些菌屬劃分到Epsilonbacteraeota,Yang等[23]的試驗結(jié)果也證實,給高脂肪小鼠飲食補充香菇多糖時,變形菌門和Epsilonbacteraeota的變化趨勢一致,由此推測Epsilonbacteraeota在大熊貓腸道中的功能和變形菌門相似。此外,老年大熊貓包含1個特有菌門,為藍細菌門。藍細菌是廣泛分布于各種水體、土壤等地的光合細菌,在大熊貓采食竹子或飲水時進入體內(nèi),未被消化的藍細菌隨糞便排出體外,王立志和徐誼英[24]也在大熊貓糞便中發(fā)現(xiàn)過藍細菌,推測它僅作為路過菌存在于大熊貓腸道中,與消化吸收無關(guān)。

在屬水平上,本試驗不同年齡段大熊貓共有優(yōu)勢菌屬為變形菌門的埃希氏菌屬-志賀氏菌屬和厚壁菌門的狹義梭菌屬1,梭菌屬是常見的纖維素降解菌,埃希氏菌屬能夠維持大熊貓腸道內(nèi)微生態(tài)平衡,這些菌屬與大熊貓降解竹子中纖維素關(guān)系密切[25]。優(yōu)勢菌屬間的相互作用會影響大熊貓對纖維素的消化能力,如Guo等[26]的研究結(jié)果顯示,圈養(yǎng)大熊貓纖維素酶活性偏低,導致消化竹子的能力弱于野生大熊貓,其原因與腸道菌群結(jié)構(gòu)和優(yōu)勢菌屬的差異相關(guān)。本試驗中13～14歲大熊貓?zhí)赜械哪c道優(yōu)勢菌屬為魏斯菌屬,34歲老年大熊貓?zhí)赜械膬?yōu)勢菌屬為八疊球菌屬。魏斯菌是廣泛分布于發(fā)酵食物、發(fā)酵植物和土壤等處的一類乳酸菌,可以抑制人體腸道內(nèi)腐敗細菌的增殖,降低腐敗霉菌素的產(chǎn)生[27-28]。魏斯菌為成年大熊貓腸道內(nèi)的優(yōu)勢菌,說明其腸道處于較為健康的狀態(tài)[29],這也提示魏斯菌可進一步分離研究以制成大熊貓益生菌菌劑,從而抑制腸道內(nèi)病原菌的滋生,提高大熊貓免疫水平。八疊球菌為革蘭陽性厭氧性球菌,Debey等[30]和Owens等[31]的研究結(jié)果表明,八疊球菌為致病菌,黑猩猩感染后出現(xiàn)的 “動物流行性神經(jīng)和胃腸綜合征”以及人類感染后出現(xiàn)的胃擴張和肺氣腫性胃炎與其相關(guān),但暫無大熊貓感染的相關(guān)報道,且本次采樣時老年大熊貓表觀健康,因此推測八疊球菌屬是大熊貓腸道內(nèi)的條件致病菌,在特定條件下會引起腸道疾病,且在抵抗力較弱的老年大熊貓腸道內(nèi)相對豐度最高,不過這種推測有待進一步研究確認。

對大熊貓腸道菌群功能進行預測可得,不同年齡段大熊貓腸道菌群的功能存在差異,尤其是34歲老年大熊貓在碳水化合物轉(zhuǎn)運和代謝、氨基酸轉(zhuǎn)運和代謝方面相對豐度最低,在轉(zhuǎn)錄、防御機制、信號轉(zhuǎn)導機制的相對豐度高于其他年齡段。Yang等[32]的研究結(jié)果表明,圈養(yǎng)野豬的小腸中由于梭狀芽胞桿菌等微生物的富集,致使其在小分子營養(yǎng)物質(zhì)代謝、氨基酸的合成、碳水化合物代謝等功能上豐度較高。豬作為一種雜食動物,與大熊貓在腸道菌群組成上存在相似性,由此可推測大熊貓腸道菌群在碳水化合物轉(zhuǎn)運和代謝、氨基酸的轉(zhuǎn)運和代謝功能上的富集與梭菌屬的相對豐度存在一定聯(lián)系。此外,轉(zhuǎn)錄通路和信號轉(zhuǎn)導通路的激活與腸道炎性反應、代謝紊亂等密切相關(guān)[33-34],防御機制通路的激活也表明腸道中可能存在應激源,這提示34歲老年大熊貓更易受到病原體的侵害,所以在飼喂老年尤其是高齡大熊貓時,需要格外注意其飲食衛(wèi)生,可適量補充抗生素。

4 結(jié) 論

大熊貓腸道菌群多樣性、結(jié)構(gòu)及功能隨年齡變化呈現(xiàn)一定演替規(guī)律。隨年齡增長,厚壁菌門的相對豐度逐漸增加,變形菌門的相對豐度逐漸降低,腸道菌群Alpha多樣性先增加后降低,在18～22歲達到最高。13～14歲大熊貓?zhí)赜械膬?yōu)勢菌屬——魏斯菌屬為腸道益生菌,34歲老年大熊貓?zhí)赜械陌睡B球菌屬為條件致病菌。結(jié)果為大熊貓腸道菌群研究數(shù)據(jù)作了進一步完善,同時可為大熊貓的飼養(yǎng)管理和疾病預防提供指導。