曹西月,紀(jì)曉霞,張崇昊,張亞峰,陳雨濤,張?jiān)词?/p>

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部動(dòng)物生理生化重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,南京 210095)

肺纖維化(pulmonary fibrosis,PF)是特發(fā)性間質(zhì)性肺炎(idiopathic interstitial pneumonia,IIP)中慢性致纖維化疾病中的一類。表現(xiàn)為肺部結(jié)構(gòu)扭曲、肌成纖維細(xì)胞過度增殖活化、大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積等[1]。犬、貓和馬等動(dòng)物也出現(xiàn)了與人肺纖維化相似的臨床癥狀,特別是在成年動(dòng)物發(fā)病、臨床病程和治療方面困難較大[2]。因此,開發(fā)或?qū)ふ倚碌乃幬锘蛑委煱悬c(diǎn)是亟待解決的問題。

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(angiotensin-converting enzyme 2, ACE2)是2000年發(fā)現(xiàn)的腎素-血管緊張素系統(tǒng)的新成員,多年來的研究已經(jīng)證實(shí),ACE2可將Ang Ⅱ轉(zhuǎn)化為Ang 1-7,發(fā)揮舒張血管、抑制細(xì)胞增生和抗炎等作用[3]。但在肺纖維化中的研究還處于初步階段。Rey-Parra等[4]研究證明,ACE2的遺傳缺失會(huì)加重肺纖維化,同時(shí)肺功能下降和運(yùn)動(dòng)能力降低。Rathinasabapathy等[5]用重組ACE2蛋白治療動(dòng)物肺纖維化,發(fā)現(xiàn)肺血管肌化減少,纖維化程度緩解,死亡率降低。Wu等[6]研究證實(shí),Ang Ⅱ通過TGF-β依賴性和獨(dú)立途徑誘導(dǎo)促纖維化因子TGF-β1表達(dá),激活TGF-β1/Smad3信號(hào)通路,導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。Sygitowicz等[7]研究證實(shí),在沒有TGF-β1的情況下,Ang Ⅱ不能導(dǎo)致心肥大和纖維化,但可以誘導(dǎo)TGF-β1合成、Smad2/3磷酸化和Smad復(fù)合物易位進(jìn)入細(xì)胞核,并促進(jìn)Smad2/3與DNA的活性結(jié)合。這些研究提示:ACE2在肺纖維化發(fā)生發(fā)展中具有一定抵抗作用,可能是肺纖維化研究的一個(gè)新思路。

二脒那秦(diminazene aceturate, DIZE)是一種經(jīng)FDA批準(zhǔn)的抗寄生蟲病藥物[8]。動(dòng)物研究表明,使用DIZE進(jìn)行慢性治療會(huì)對(duì)狗和駱駝造成腦損傷,但對(duì)牛、大鼠、小鼠等沒有影響,并且DZIE已在早期非洲錐蟲病的患者中使用,報(bào)道未見重大毒性[9]。近期的研究表明,DIZE具有激活A(yù)CE2,從而抑制肺泡上皮細(xì)胞中的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化,緩解矽肺纖維化的功能[10]。也有多項(xiàng)研究表明,DIZE可以改善大鼠心纖維化和舒張功能障礙[11],抑制小鼠肝損傷和膽道纖維化[12]及顯著抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化[13]等作用。本實(shí)驗(yàn)室朱斌[14]首次明確了DIZE通過激活A(yù)CE2基因啟動(dòng)子對(duì)其轉(zhuǎn)錄起始具有激活作用。但DIZE是否可以通過激活A(yù)CE2緩解博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化,以及其作用機(jī)制尚不清楚。

總之,隨著研究的深入,各種因素,特別是人類新冠病毒對(duì)肺功能的損傷及纖維化后遺癥等的嚴(yán)重影響,結(jié)合前人的研究結(jié)果證明ACE2對(duì)肺纖維化能起到一定影響及作用,將會(huì)對(duì)肺纖維化的預(yù)防和治療提供一個(gè)新的思路。本試驗(yàn)通過一次性氣管內(nèi)注射博來霉素,構(gòu)建小鼠肺纖維化損傷模型,用DIZE處理,探究DIZE與肺纖維化及ACE2的相互關(guān)系,探討其相關(guān)機(jī)制,為從ACE2的角度改善小鼠肺纖維化的研究和治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

DIZE購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;博來霉素(Bleomycin, BLM)購(gòu)自海正輝瑞制藥有限公司;羥脯氨酸試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所;小鼠Ang Ⅱ和Ang 1-7 ELISA試劑盒購(gòu)自上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司;RIPA裂解液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司;ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海天能科技有限公司等。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β1抗體、山羊抗兔IgG二抗購(gòu)自ABclonal公司;內(nèi)參抗體GAPDH、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、ACE2抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

Tecan Spark多功能酶標(biāo)儀(瑞士,Tecan公司);POWER-PAC300電泳儀和POWER-PAC HC轉(zhuǎn)印儀(美國(guó),Bio-Rad公司);Tanon-3900全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司);LightCycler96熒光定量PCR儀(瑞士,Roche公司)等。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

6周齡SPF級(jí)雄性ICR小鼠,體重32 g± 2 g,購(gòu)自南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物養(yǎng)殖基地,許可證號(hào):SCXK(浙)2019-0002。飼養(yǎng)于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,溫度(22±2)℃,濕度50%～60%,(12 h/12 h)光/暗周期光照。動(dòng)物試驗(yàn)遵循南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物倫理規(guī)范要求(GB/T 35892-2018)。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組與處理 24只ICR小鼠,分籠飼養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為對(duì)照組(CON組)、模型組(MOD組)和二脒那秦組(DIZE組)。各組處理見表1。

每籠8只,自由采食和飲水。每日觀察各組小鼠精神狀況等,試驗(yàn)周期為4周。

1.3.2 樣品采集 連續(xù)灌胃至第28天,每只小鼠眶下靜脈采血,3 000 r·min-1離心取血清,-20 ℃保存。所有小鼠頸椎脫臼處死,剖檢取肺稱重,按如下公式計(jì)算肺系數(shù)。

肺系數(shù)=肺質(zhì)量(mg)/小鼠體重(g)

1.3.3 肺病理組織學(xué)切片制作

1.3.3.1 HE染色:小鼠處死后,剪取一部分右上肺葉組織置于4%多聚甲醛固定24 h。后續(xù)組織切片的制作及HE染色交由武漢賽維爾生物科技有限公司進(jìn)行。光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3.3.2 Masson染色:將制作好的石蠟切片脫水,Weigert鐵蘇木素染色,酸性乙醇分化液分化、水洗,Masson藍(lán)化液藍(lán)化,品紅染液染色,苯胺藍(lán)染色液復(fù)染,脫水后,光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3.4 肺組織中羥脯氨酸含量的測(cè)定 取各組小鼠肺組織30 mg,堿水解法測(cè)定其中羥脯氨酸的含量。具體按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作,550 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度(A)值。按照如下公式計(jì)算:

羥脯氨酸含量

(μg·mg-1組織)

V水解液:水解液總體積,5 mL;W:組織質(zhì)量,mg

1.3.5 血清中Ang Ⅱ和Ang 1-7含量的測(cè)定 間接ELISA法測(cè)定。按照試劑盒說明書方法操作,450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品得出標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程,計(jì)算出各組Ang Ⅱ和Ang 1-7的含量(單位:pg·mL-1)。

1.3.6 肺組織中纖維化相關(guān)因子基因表達(dá)水平的RT-qPCR檢測(cè)

1.3.6.1 引物設(shè)計(jì):利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)Col1a1、Col3a1、α-SMA、TGF-β1和內(nèi)參GAPDH引物,引物參數(shù)指標(biāo)見表2,引物由南京擎科生物科技有限公司合成。

表2 目的基因和內(nèi)參引物序列Table 2 Primer sequences of target genes and GAPDH

1.3.6.2 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄:取各小鼠肺組織約100 mg放入勻漿管中,加入1 mL Trizol Reagent勻漿,提取肺組織總RNA,紫外分光光度測(cè)定總RNA濃度。然后根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,-20 ℃保存。

1.3.6.3 qPCR擴(kuò)增:以c DNA為模板進(jìn)行qPCR。按下述反應(yīng)體系進(jìn)行Real-time qPCR反應(yīng):2×SYBR Green ProTaqHS Mix 10 μL,上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL,cDNA 2 μL,ddH2O 7.2 μL。擴(kuò)增程序:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,共40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)使用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。

1.3.7 肺組織中α-SMA、TGF-β1、E-cadherin及ACE2蛋白表達(dá)水平的Western blot檢測(cè) 取各組小鼠肺組織100 mg,加入RIPA蛋白裂解液勻漿,離心,收集上清液獲得總蛋白提取物。BCA法測(cè)定蛋白濃度,并統(tǒng)一蛋白濃度。取30 μg蛋白按照濃縮膠80 V、分離膠110 V的條件,進(jìn)行SDS-PAGE電泳;隨后選用PVDF膜,100 V,濕法轉(zhuǎn)印90 min;轉(zhuǎn)印結(jié)束后,5%脫脂奶粉封閉2 h,TBST洗膜,分別加入一抗(α-SMA、TGF-β1、E-cadherin、ACE2及GAPDH兔源抗體均為1∶1 000稀釋),4 ℃孵育過夜;TBST洗膜,加入羊抗兔二抗(1∶10 000稀釋)室溫孵育。TBST洗膜,ECL顯影,凝膠成像系統(tǒng)分析并拍照。Image J軟件檢測(cè)各蛋白條帶灰度值,以GAPDH為內(nèi)參蛋白,以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值之比定量分析蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠肺纖維化損傷模型的建立

2.1.1 小鼠肺系數(shù)及羥脯氨酸含量的變化 結(jié)果如表3所示。與CON組相比,MOD組小鼠肺系數(shù)極顯著升高(P<0.01),肺組織中羥脯氨酸含量顯著升高(P<0.05);DIZE組小鼠肺系數(shù)和羥脯氨酸含量顯著或極顯著低于MOD組(P<0.05 &P<0.01)。結(jié)果提示:博來霉素處理可引起小鼠肺組織重量增加及羥脯氨酸的含量升高,DIZE處理緩解了博來霉素處理導(dǎo)致的肺組織重量增加及羥脯氨酸含量的升高。

表3 小鼠肺系數(shù)、肺組織羥脯氨酸含量Table 3 Lung index, hydroxyproline content in lung tissue of mice

2.1.2 肺病理組織學(xué)觀察結(jié)果

2.1.2.1 HE染色結(jié)果:如圖1所示。CON組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常,肺泡間隔和肺泡腔結(jié)構(gòu)正常,無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和間質(zhì)增生。MOD組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)混亂,肺泡塌陷,肺間質(zhì)增厚,有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),伴有充血現(xiàn)象(如箭頭所示)。與MOD組相比,DIZE處理后小鼠肺泡塌陷、肺泡間隔增厚、肺組織結(jié)構(gòu)破壞程度減輕,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少。

圖1 小鼠肺組織HE染色結(jié)果(200×)Fig.1 Results of HE staining of mouse lung tissue (200×)

2.1.2.2 Masson染色結(jié)果:Masson染色是一種經(jīng)典的膠原纖維染色方法,通過Masson染色膠原纖維染為藍(lán)色,肌纖維染為紅色。結(jié)果見圖2。CON組小鼠肺組織中藍(lán)色膠原纖維沉積較少,肺泡壁結(jié)構(gòu)完整。MOD組可見有大量藍(lán)色膠原纖維沉積,且有纖維結(jié)節(jié)生成(如箭頭所示)。DIZE組小鼠肺組織藍(lán)色膠原纖維較MOD組明顯減少。

圖2 小鼠肺組織Masson染色結(jié)果(200×)Fig.2 Results of Masson staining of mouse lung tissue (200×)

2.2 小鼠肺組織ACE2蛋白表達(dá)及血清Ang Ⅱ和Ang 1-7含量變化

2.2.1 肺組織中ACE2蛋白表達(dá)結(jié)果 結(jié)果如圖3所示。與CON組相比,MOD組小鼠肺組織中ACE2蛋白表達(dá)極顯著下調(diào)(P<0.01)。DIZE處理小鼠肺組織中ACE2蛋白表達(dá)水平較CON組和MOD組均極顯著上調(diào)(P<0.01)。提示:ACE2參與了小鼠的肺纖維化損傷過程,DIZE處理可內(nèi)源性激活A(yù)CE2。

與CON組相比,**.P<0.01;與MOD組相比,##.P<0.01Compared with CON,**. P<0.01; Compared with MOD, ##. P<0.01圖3 小鼠肺組織ACE2蛋白表達(dá)Fig.3 Expression of ACE2 protein in mouse lung tissue n=8)

2.2.2 血清中Ang Ⅱ和Ang 1-7的含量 由表4可見,與CON組相比,MOD組小鼠血清Ang Ⅱ含量極顯著升高(P<0.01),Ang 1-7含量極顯著降低(P<0.01);DIZE處理組二者含量均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。與MOD組相比,DIZE組Ang Ⅱ含量極顯著低于MOD組(P<0.01),Ang 1-7含量顯著高于MOD組(P<0.05)。提示,DIZE處理激活的ACE2,高活性的ACE2降解Ang Ⅱ產(chǎn)生Ang 1-7能力增強(qiáng)。

表4 小鼠血清Ang Ⅱ、Ang 1-7含量Table 4 Serum Ang Ⅱ and Ang 1-7 levels in mice pg·mL-1

2.3 小鼠肺組織纖維化相關(guān)基因的表達(dá)結(jié)果

結(jié)果如圖4所示。與CON組相比,MOD組小鼠肺組織中細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分——Col1a1,Col3a1,肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志蛋白α-SMA以及促纖維化因子TGF-β1的基因表達(dá)均極顯著上調(diào)(P<0.01),DIZE組以上4個(gè)基因的表達(dá)均極顯著低于MOD組(P<0.01)。與CON組相當(dāng)。提示:MOD組小鼠肺組織中有大量的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生,且過度沉積。DIZE處理能夠減少以上基因的過度表達(dá),具有一定的緩解作用。

與CON組相比,**.P<0.01;與MOD組相比,##.P<0.01Compared with CON,**. P<0.01; Compared with MOD, ##. P<0.01圖4 小鼠肺組織纖維化相關(guān)基因的表達(dá)(n=8)Fig.4 Expression of fibrosis related genes in mouse lung tissue (n=8)

2.4 小鼠肺組織纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)結(jié)果

結(jié)果如圖5所示。與CON組相比,MOD組小鼠肺組織中上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-cadherin的表達(dá)水平極顯著下調(diào)(P<0.01);DIZE處理較MOD組上調(diào),但無顯著差異(P>0.05)。MOD組小鼠肺組織中促纖維因子TGF-β1及α-SMA蛋白表達(dá)均極顯著高于對(duì)照組(P<0.01);DIZE處理組TGF-β1及α-SMA蛋白表達(dá)顯著低于MOD組(P<0.01、P<0.05)。與基因表達(dá)結(jié)果趨勢(shì)一致。

與CON組相比,**.差異極顯著(P<0.01);與MOD組相比,#.差異顯著(P<0.05),##.差異極顯著(P<0.01)Compared with CON,**. P<0.01; Compared with MOD, #.P<0.05, ##. P<0.01圖5 小鼠肺組織纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)(n=8)Fig.5 Expression of fibrosis related proteins in mouse lung tissue (n=8)

3 討 論

3.1 小鼠肺纖維化模型的建立

肺纖維化是以彌漫性肺泡炎和肺泡結(jié)構(gòu)紊亂,肺間質(zhì)纖維化為特征的疾病,發(fā)病率高,預(yù)后差,由纖維化級(jí)聯(lián)驅(qū)動(dòng),如上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal trans differentiation, EMT)、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)產(chǎn)生和肺部膠原蛋白的生成[15]。主要表現(xiàn)為肺組織充滿大量炎性細(xì)胞,纖維組織增生,其標(biāo)志性指標(biāo)主要是TGF-β1表達(dá)上調(diào),以及肺系數(shù)和羥脯氨酸含量增加。羥脯氨酸是纖維中標(biāo)志性氨基酸之一,其含量越高,表明纖維化程度越高。

動(dòng)物模型對(duì)研究PF發(fā)病機(jī)制、開發(fā)和研究潛在藥物具有重要作用[16]。博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型被廣泛用于研究人類PF,并用作評(píng)估臨床應(yīng)用的新型抗纖維化藥物的篩選[15]。博來霉素是從輪生鏈霉菌中提取出來的一種抗腫瘤藥物,可引起肺纖維化,其誘導(dǎo)的肺纖維化模型與人肺纖維化病變相似,因此成為構(gòu)建肺纖維化模型的常用藥物[17]?？赏ㄟ^氣管、腹腔、靜脈、皮下等給藥途徑給藥,其中,氣管給藥具有單次給藥即可誘導(dǎo)肺纖維化,且時(shí)間短、臨床相關(guān)性好等優(yōu)點(diǎn)。Sun等[18]用氣管內(nèi)注射博來霉素成功制備了小鼠肺纖維化損傷模型,肺組織表現(xiàn)為肺泡壁增厚,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)到間質(zhì)以及膠原蛋白沉積。本試驗(yàn)參照Sun等[18]的方法,采用氣管單次注射博來霉素(5 mg·kg-1)的方法給藥小鼠,28 d后,小鼠表現(xiàn)精神不振,呼吸急促,毛發(fā)凌亂、缺少光澤,肺組織呈現(xiàn)彌漫性肺泡炎和肺泡結(jié)構(gòu)紊亂,肺間質(zhì)大量膠原纖維沉積,肺系數(shù)和羥脯氨酸含量增加。與Sun等[18]的結(jié)果一致,本試驗(yàn)成功建立了小鼠肺纖維化損傷模型。可用于后續(xù)試驗(yàn)。

3.2 DIZE通過激活A(yù)CE2表達(dá)緩解小鼠肺纖維化

研究已經(jīng)證實(shí),ACE2在心肌和肺中發(fā)揮重要作用,其表達(dá)降低時(shí)可發(fā)生心肌肥大、心力衰竭、肺損傷、肺炎、肺纖維化等相關(guān)疾病[19],且證實(shí)ACE2能夠?qū)ng Ⅱ轉(zhuǎn)化為Ang1-7,從而發(fā)揮抗炎、抗纖維化的作用。最近的研究表明,DIZE能夠激活A(yù)CE2,該功能在與心血管、肺和腎系統(tǒng)相關(guān)的多種病理學(xué)中顯示出有益和保護(hù)作用[20]。Lambert等[21]在試驗(yàn)性肺纖維化動(dòng)物模型中檢測(cè)到Ang Ⅱ水平升高,通過AT1受體拮抗劑和ACE抑制劑可降低肺損傷程度,提示Ang Ⅱ在肺纖維形成中起重要作用。Shenoy等[22]通過DIZE處理大鼠心肌梗死模型4周后,結(jié)果發(fā)現(xiàn)改善了心重塑,并且證實(shí)該過程與ACE2 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

本研究使用15 mg·(kg·d)-1DIZE處理博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠28 d,發(fā)現(xiàn)MOD組小鼠肺組織中ACE2蛋白表達(dá)下調(diào),Ang Ⅱ含量升高;相反,DIZE處理使ACE2蛋白表達(dá)上調(diào),Ang Ⅱ含量降低。說明肺局部高水平的Ang Ⅱ參與了小鼠肺纖維化損傷的發(fā)生發(fā)展,Lambert等[21]研究結(jié)果一致。提示DIZE內(nèi)源性激活A(yù)CE2的表達(dá),可以通過降低Ang Ⅱ,改善小鼠肺功能的損傷和肺組織的纖維化。

3.3 DIZE對(duì)肺纖維化相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響

研究發(fā)現(xiàn),肺泡毛細(xì)血管屏障基底膜完整性的破壞、上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的再生修復(fù)功能抑制、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)信號(hào)功能異常均參與了肺間質(zhì)纖維化的形成。研究已經(jīng)證實(shí),在EMT過程中E-cadherin表達(dá)受到抑制,上皮細(xì)胞間的黏連被破壞,轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂羞w移能力的間質(zhì)細(xì)胞[23]。另外,肌成纖維細(xì)胞是纖維化過程中產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)的主要細(xì)胞類型,特征性表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA),產(chǎn)生具有收縮功能的膠原(Colla1、Col3a1)[24]。Xu等[25]在二氧化硅誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化組織中檢測(cè)到α-SMA、Colla1及Col3a1表達(dá)上調(diào)。TGF-β1也是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)積聚或沉積的因子。已有研究證實(shí)TGF-β參與肺、腎、肝等臟器纖維化的發(fā)生和發(fā)展過程[26]。TGF-β在哺乳動(dòng)物中有TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3 3種存在形式,其中致纖維化作用最為明顯的是TGF-β1[27]。

本試驗(yàn)采用RT-qPCR或Western blot法分別檢測(cè)了肺組織中以上與纖維化相關(guān)因子的基因或蛋白表達(dá)水平,進(jìn)一步研究了DIZE的作用及其內(nèi)源性激活A(yù)CE2對(duì)小鼠肺纖維化的作用及其機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,模型組小鼠肺組織中上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-cadherin蛋白表達(dá)水平下調(diào),間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物α-SMA和TGF-β1的基因和蛋白表達(dá)均上調(diào),同時(shí)Col1a1和Col3a1基因表達(dá)上調(diào),提示博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠發(fā)生纖維化的過程中上皮細(xì)胞減少,成纖維化細(xì)胞及肌成纖維細(xì)胞增多,細(xì)胞外基質(zhì)大量產(chǎn)生,且過度沉積。DIZE處理后,以上纖維化損傷得到緩解。

肺纖維化時(shí)TGF-β1表達(dá)的升高,可促進(jìn)小鼠的肺纖維化進(jìn)程。α-SMA大量出現(xiàn),致細(xì)胞合成大量的Colla1、Col3a1,細(xì)胞外基質(zhì)異常沉積加劇。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)博萊霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化損傷時(shí)肺組織及血液中Ang Ⅱ的含量及TGF-β1的表達(dá)均有明顯升高,即AngⅡ-TGF-β1作為一種通路促進(jìn)了肺纖維化。Ang Ⅱ可能通過TGF-β依賴性和獨(dú)立途徑在肺纖維形成中發(fā)揮了促進(jìn)或協(xié)同作用,相關(guān)具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

二脒那秦(DIZE)可以通過激活內(nèi)源性激活血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)降解Ang Ⅱ,緩解小鼠肺纖維化,提示ACE2或DIZE改善肺纖維化的開發(fā)潛力,也為從ACE2的角度對(duì)肺纖維化的研究和治療提供思路。