劉文豪,朱彥策,張冬萱,王智豪,張 超

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物生化與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,鄭州 450046)

非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)是一種雙鏈DNA蟲媒病毒編碼60種以上的結(jié)構(gòu)蛋白和100余種非結(jié)構(gòu)蛋白[1],其中由E165R、K196R、A240L基因編碼的dUTPase(E165R)、K196R、A240L蛋白是ASFV主要的核苷酸代謝酶[2],負(fù)責(zé)在病毒復(fù)制過(guò)程中提供能量[3]。dUTPase被證實(shí)與先天免疫相關(guān)[4-5]且能夠激活核因子-kappaB(NF-κB)信號(hào)通路[6]。在ASFV中也有報(bào)道稱E165R缺失會(huì)影響病毒在巨噬細(xì)胞中的高效復(fù)制[7]。

NF-κB是由5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB1(p50)、NF-κB2(p52)、RelA(p65)、RelB和c-Rel組成的家族,激活靶基因的轉(zhuǎn)錄參與多種細(xì)胞過(guò)程,常見(jiàn)其介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。在非活性狀態(tài)下,經(jīng)典NF-κB通路中的p65/p50二聚體被NF-κB抑制蛋白α(IKBa)隔離在細(xì)胞質(zhì)中,當(dāng)受到促炎刺激時(shí),IKBa的蛋白酶體降解,p65/p50二聚體從IKBa中釋放并迅速發(fā)生核轉(zhuǎn)位從而啟動(dòng)下游靶基因表達(dá),入核的p65/p50二聚體同時(shí)激活I(lǐng)KBa轉(zhuǎn)錄使自身恢復(fù)靜息狀態(tài)[8]。

慢病毒表達(dá)系統(tǒng)能夠?qū)⒛康幕蛘系剿拗骰蚪M中,從而實(shí)現(xiàn)在宿主細(xì)胞的穩(wěn)定表達(dá),是一種準(zhǔn)確高效的基因轉(zhuǎn)移載體[9]。本研究通過(guò)慢病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建出穩(wěn)定表達(dá)E165R的PK 15細(xì)胞系,發(fā)現(xiàn)E165R促進(jìn)NF-κB和炎癥相關(guān)基因表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和細(xì)胞 HEK 293T細(xì)胞、PK 15細(xì)胞、p3×FLAG-CMV-10質(zhì)粒、慢病毒載體lentiCRISPR v2Cas9-質(zhì)粒、psPAX2質(zhì)粒、PMD2.G質(zhì)粒和大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞均由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物生化與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存,E165R基因以NCBI公布的ASFV E165R的序列號(hào)(NC_001659.2)交由生工生物公司合成。

1.1.2 主要試劑 ClonExpress II One Step Cloning Kit購(gòu)自Vazyme公司;Q5? High-Fidelity DNA Polymerases和限制性核酸內(nèi)切酶購(gòu)自NEB公司;PCR產(chǎn)物回收試劑盒、膠回收試劑盒和質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒購(gòu)自生工生物公司;TurboFect轉(zhuǎn)染試劑和山羊抗小鼠IgG Alexa Fluor Plus 555二抗購(gòu)自Thermo Fisher公司、DMEM購(gòu)自Solarbio公司;胎牛血清FBS、Opti-MEMTMI減血清培養(yǎng)基和胰酶購(gòu)自Gibco公司;Anti-GAPDH mouse mAb購(gòu)自Servicebio公司;鼠源抗FLAG單克隆抗體購(gòu)自abcam公司;辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG和蛋白Marker購(gòu)自鼎國(guó)生物公司;PVDF轉(zhuǎn)印膜和ECL化學(xué)發(fā)光顯色液購(gòu)自millipore公司;RIPA裂解液購(gòu)自碧云天生物公司。

1.2 方法

1.2.1 重組標(biāo)簽質(zhì)粒的構(gòu)建 ASFV E165R基因由生工生物公司合成,和p3×FLAG-CMV-10設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物并添加酶切位點(diǎn),上游引物為5′-aaggatgacgatgacaagcttCTAGCGATGGCAACAA-ATTTT-3′,下游引物為5′-cagggatgccacccgggatcc-GGAGTTCTCATAATCCCGGCC-3′,下劃線處分別為限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和BamH Ⅰ的識(shí)別位點(diǎn)。為模板PCR擴(kuò)增同源重組插入片段,PCR反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性30 s,60 ℃退火40 s,72 ℃延伸40 s,35個(gè)循環(huán),72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分離純化與雙酶切后的p3×FLAG-CMV-10質(zhì)粒一起同源重組連接,轉(zhuǎn)化,涂板,挑菌鑒定得到質(zhì)粒p3×FLAG-E165R。

1.2.2 重組慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建 以重組質(zhì)粒p3×FLAG-E165R為模板根據(jù)lentiCRISPR v2Cas9-質(zhì)粒選擇酶切位點(diǎn)XbaⅠ和BamH Ⅰ設(shè)計(jì)并合成一對(duì)特異性引物,上游引物V2-FLAG-F為5′-gaacacaggaccggttctagaATGGACTACAAAGACCATGACGG-3′,下游引物V2-FLAG-R為5′-gaagtttgttgcgcc-ggatccGGATCCGGAGTTCTCATAATCCC-3′,下劃線處分別為限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和BamH Ⅰ識(shí)別位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增和lentiCRISPR v2Cas9-慢病毒載體酶切回收純化后進(jìn)行同源重組連接,經(jīng)轉(zhuǎn)化,涂板,鑒定測(cè)序后得到質(zhì)粒V2-FLAG-E165R。

1.2.3 重組慢病毒的包裝和細(xì)胞篩選 按照TurboFect的說(shuō)明,將V2-FLAG-E165R(2 μg)、pMD2.G(0.5 μg)和psPAX2(1.5 μg)三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEK 293T細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染48和72 h時(shí)分別收集病毒上清液,混勻后感染PK 15細(xì)胞48 h,然后使用工作濃度的嘌呤霉素篩選細(xì)胞直到陰性對(duì)照細(xì)胞全部死亡。存活細(xì)胞經(jīng)終點(diǎn)稀釋法篩選出單克隆細(xì)胞,經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行鑒定。鑒定正確的細(xì)胞系命名為E165R-PK,同時(shí)設(shè)置lentiCRISPR v2 Cas9-質(zhì)粒構(gòu)建慢病毒作為陰性對(duì)照命名為V2-PK。

1.2.4 細(xì)胞系的PCR鑒定 用細(xì)胞DNA小量提取試劑盒提取細(xì)胞基因組,以基因組為模板PCR擴(kuò)增E165R蛋白序列,反應(yīng)條件參考“1.2.1”,反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,并用凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.2.5 蛋白免疫印跡(Western blot) 將細(xì)胞接種于6孔板,當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)使用RIPA進(jìn)行裂解。裂解液4 ℃離心收集上清并加入4×Loading buffer,高溫變性后進(jìn)行15%的SDS-PAGE電泳以濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。將膜使用5%脫脂奶粉封閉1 h,再分別以鼠抗GAPDH和FLAG的單抗(1∶1 000)作為一抗4 ℃孵育過(guò)夜,HRP標(biāo)記山羊抗小鼠單抗(1∶5 000)作為二抗室溫孵育1 h。孵育完成的膜使用ECL化學(xué)發(fā)光顯色液顯色后以多功能成像儀觀察結(jié)果。

1.2.6 間接免疫熒光(indirect immunoinfluscent assay,IFA) 將細(xì)胞株接種于細(xì)胞爬片,待細(xì)胞長(zhǎng)至50%時(shí)使用4% PFA固定細(xì)胞30 min,然后使用500 μL 0.1% TritonX-100通透12 min。通透結(jié)束后的細(xì)胞使用10% FBS室溫封閉1 h,以鼠抗FLAG的單抗(1∶1 000)在室溫孵育1 h,山羊抗小鼠Alexa Fluor Plus 555(1∶500)避光孵育1 h。最后細(xì)胞經(jīng)DAPI染核并封片后使用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.2.7 RT-qPCR檢測(cè)mRNA轉(zhuǎn)錄 以TRIzol法提取細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,再以cDNA為模板進(jìn)行Real-time qPCR,檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄,豬GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參,引物序列如表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 RT-qPCR primer sequence

2 結(jié) 果

2.1 重組慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建

本研究以p3×FLAG-CMV-10質(zhì)粒為骨架構(gòu)建了E165R基因含有FLAG標(biāo)簽的質(zhì)粒,經(jīng)鑒定正確后將基因和標(biāo)簽一起連接到lentiCRISPR v2質(zhì)粒上,測(cè)序鑒定后成功得到慢病毒質(zhì)粒V2-FLAG-E165R。

2.2 細(xì)胞系的篩選和鑒定

將慢病毒質(zhì)粒V2-FLAG-E165R包裝后轉(zhuǎn)導(dǎo)至PK 15細(xì)胞以嘌呤霉素進(jìn)行篩選,經(jīng)終點(diǎn)稀釋法挑選擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行PCR和Western blot鑒定。在PCR鑒定中將重組慢病毒質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照,V2-PK細(xì)胞基因組作為陰性對(duì)照,結(jié)果顯示,E165R-PK基因組在575 bp處有目的條帶(圖1A)與預(yù)期一致。Western blot鑒定結(jié)果顯示(圖1B)E165R-PK細(xì)胞系在21 ku存在條帶而PK 15和V2-PK則沒(méi)有。上述結(jié)果證實(shí)E165R蛋白在E165R-PK細(xì)胞系成功表達(dá)。

A. 細(xì)胞系PCR鑒定:M. DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000); 1. V2-FLAG-E165R質(zhì)粒; 2. V2-PK細(xì)胞基因組; 3～4. E165R-PK細(xì)胞基因組。B. 細(xì)胞系Western blot鑒定:1. PK 15細(xì)胞; 2. V2-PK細(xì)胞; 3～4. E165R-PK細(xì)胞A. PCR identification of cell lines: M. DNA molecular weight standard (DL2000); 1. V2-FLAG-E165R plasmid; 2. V2-PK cell genome; 3-4. E165R-PK cell genome. B. Western blot identification of cell lines: 1. PK 15 cells; 2. V2-PK cells; 3-4. E165R-PK cells圖1 細(xì)胞系PCR和Western blot鑒定Fig.1 PCR and Western blot identification of cell lines

2.3 IFA鑒定細(xì)胞系E165R蛋白表達(dá)

在24孔板中制備PK 15和E165R-PK的細(xì)胞爬片進(jìn)行免疫熒光鑒定。從圖2可以看到E165R-PK細(xì)胞有點(diǎn)狀紅色熒光信號(hào)(以白色方框標(biāo)出),而PK 15細(xì)胞并無(wú)明顯點(diǎn)狀熒光。

圖2 免疫熒光鑒定E165R的FLAG標(biāo)簽表達(dá)(掃描文章首頁(yè)OSID碼可查看彩圖)Fig.2 Identification of FLAG tag expression of E165R by immunofluorescence(Scan OSID code on the first page to view the colorful image)

2.4 細(xì)胞中NF-κB及炎癥相關(guān)基因mRNA水平檢測(cè)

通過(guò)qPCR檢測(cè)NF-κB和炎癥相關(guān)IL-6、IL-8、TNF-α基因mRNA表達(dá)水平。由圖3可知E165R-PK細(xì)胞相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞V2-PK,NF-κB相關(guān)基因P65和IKBa表達(dá)均極顯著高于對(duì)照組(P<0.01),同時(shí)炎癥相關(guān)基因IL-6、IL-8、TNF-α表達(dá)量也顯著增高(P<0.01)。該結(jié)果表明E165R蛋白可以激活NF-κB信號(hào)通路,并可能刺激炎癥產(chǎn)生。

用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析,*** P<0.001,**** P<0.000 1t test was used for analysis, *** P<0.001, **** P<0.000 1圖3 過(guò)表達(dá)E165R蛋白后NF-κB和炎癥相關(guān)基因mRNA水平變化Fig.3 Change of mRNA levels of NF-κB and inflammation-related gene after overexpression of E165R protein

3 討 論

據(jù)報(bào)道,dUTPase廣泛存在于生命體中,包括許多原核生物、真核生物、DNA病毒及RNA病毒中[10]。Oliveros等[7]通過(guò)構(gòu)建ASFV dUTPase缺失突變體,發(fā)現(xiàn)dUTPase影響ASFV在豬巨噬細(xì)胞高效復(fù)制,同時(shí)Epstein-Barr virus (EBV)的dUTPase能通過(guò)NF-κB信號(hào)通路增加TNF-α、IL-6表達(dá)[4-5]。雖然E165R在ASFV復(fù)制中的作用已有報(bào)道,但其在先天免疫方面的作用研究的還并不清楚。

雖然ASFV的易感細(xì)胞為豬原代肺泡巨噬細(xì)胞,但是相對(duì)與豬原代肺泡巨噬細(xì)胞,PK15細(xì)胞易于培養(yǎng),并且廣泛用作細(xì)胞模型用來(lái)研究宿主先天免疫信號(hào)通路。本研究通過(guò)慢病毒系統(tǒng)構(gòu)建表達(dá)ASFVE165R基因的 PK15細(xì)胞系,利用PCR、Western blot和IFA證實(shí)該基因能夠在PK15細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá)。

ASFV相關(guān)蛋白對(duì)天然免疫信號(hào)通路的影響引起學(xué)者廣泛關(guān)注,Yang等[11]通過(guò)敲減F317L蛋白發(fā)現(xiàn)其抑制NF-κB從而拮抗宿主先天免疫應(yīng)答,Wang等[12]發(fā)現(xiàn)K205R蛋白誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,從而激活自噬和NF-κB信號(hào)通路。針對(duì)構(gòu)建成功的穩(wěn)定過(guò)表達(dá)E165R的PK15細(xì)胞系,本研究用qPCR檢測(cè)E165R對(duì)NF-κB信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)的影響,發(fā)現(xiàn)E165R蛋白顯著提高NF-κB信號(hào)通路相關(guān)基因P65和IKBa的轉(zhuǎn)錄,促進(jìn)炎癥相關(guān)基因IL-6、IL-8和TNF-α在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá),表明E165R蛋白能夠激活NF-κB信號(hào)通路并且刺激炎癥產(chǎn)生,但其在先天免疫信號(hào)通路中的具體作用仍有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié) 論

本研究以慢病毒包裝技術(shù)轉(zhuǎn)導(dǎo)PK 15細(xì)胞得到穩(wěn)定表達(dá)非洲豬瘟E165R蛋白的細(xì)胞系,并初步驗(yàn)證其能激活NF-κB信號(hào)通路,刺激炎癥因子表達(dá),為ASFV在先天免疫方向的研究提供了新思路。