程天印,吳聰穎,劉雨珂,段德勇

(湖南農業(yè)大學動物醫(yī)學院,長沙 410128)

褐黃血蜱(Haemaphysalisflava),隸屬于硬蜱科血蜱屬,廣泛分布于我國南方各省與東亞各國,是一種常見寄生于哺乳動物體表的吸血寄生蟲[1-2]。褐黃血蜱可傳播立克次體(Rickettsia)[3]、貝納柯克斯體(Coxiellaburnetti)[3]、巴爾通體(Bartonella)[4]、森林腦炎病毒(Forest encephalitis virus)[5]等病原體,嚴重威脅著人類健康和畜牧養(yǎng)殖業(yè)[6]。篩選蜱源優(yōu)質抗原是開發(fā)抗蜱疫苗的先決條件。熱休克蛋白70(heat shock protein 70, HSP70)是一類高度保守的伴侶蛋白,參與細胞內蛋白質的折疊、裝配、降解和修復過程,具有促進抗原提呈與識別、調控免疫應答等生物學功能[7]。對比蜱不同發(fā)育階段,發(fā)現熱休克同源蛋白70(heat shock cognate 70, HSC70)的表達量在半飽血狀態(tài)的成蟲中顯著高于其他發(fā)育階段[8]。通過體外抗凝血測定,發(fā)現褐黃血蜱HSC70重組蛋白具有顯著的抗凝血活性[9]。上述研究表明,蜱在吸血時,體內有HSP家族蛋白會變得活躍,且可能參與蜱抗凝血過程。本課題組已通過轉錄組學建立了半飽血和飽血雌性褐黃血蜱中腸轉錄組文庫[10],并發(fā)現Contig41014是褐黃血蜱中腸轉錄組文庫中負責編碼HSP70-b2的Unigene,但缺失3′端序列。

HSP家族蛋白不僅參與蜱的抗凝血過程,還具有一定免疫原性。研究證實,外源性HSP70通過主要組織相容性復合體Ⅰ和Ⅱ類(MHCⅠ和Ⅱ)分子遞呈抗原,以刺激T和B細胞產生免疫[11-13]。14-Mer肽是HSP70家族蛋白中具有免疫功能的肽段,位于450—463位氨基酸[14]。而對蜱HSP70家族蛋白的一級氨基酸序列進行比對時,發(fā)現蜱HSP家族蛋白的14-Mer肽段個別氨基酸發(fā)生了變化,為類14-Mer肽[15]。類14-Mer肽是否影響蜱HSP70-b2的免疫原性尚不明確?；诖?本研究通過cDNA末端快速擴增(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)技術擴增Contig41014基因,以得到褐黃血蜱HSP70-b2基因全長,并定點突變HSP70-b2編碼類14-Mer肽段的核酸序列為編碼14-Mer肽段的核酸序列,以獲得HSP70-b2M基因全長。為進一步探究HSP70-b2、HSP70-b2M是否具有抗凝血作用,及類14-Mer肽是否影響蜱HSP70-b2的免疫活性,本研究將構建HSP70-b2、HSP70-b2M原核表達載體,表達、純化獲得重組HSP70-b2和HSP70-b2M蛋白(rHSP70-b2、rHSP70-b2M);采用四項凝血試驗,測定rHSP70-b2、rHSP70-b2M抗凝血活性;以弗氏完全/不完全佐劑乳化rHSP70-b2、rHSP70-b2M并皮下免疫Sprague Dawley(SD)大鼠,測量各組血清抗體水平以評估HSP70-b2、HSP70-b2M免疫原性。

1 材料與方法

1.1 主要設備和儀器

EasyPure RNA Kit,2×TransTaqHiFi PCR SuperMixⅡ,TransStart?KD Plus DNA Polymerase,BL21(DE3)Chemically Competent Cell,限制性內切酶(EagI、XhoI、NcoI)購自北京全式金生物技術有限公司,PremixTaq(TaKaRaTaqVersion 2.0)、pMD19-T Vector Cloning Kit、EscherichiacoliDH5α Competent Cells、DNA Ligation Kit Ver.2.1、SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit購自TaKaRa公司,瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質粒小提試劑盒(DP103)購自天根生化科技(北京)有限公司,Ni-NTA His Bind Resin鎳柱購自上海七海復泰生物科技有限公司,小鼠抗His單克隆抗體、過氧化氫標記的山羊抗小鼠抗體購自天津博士德生物科技有限公司,BCA蛋白定量試劑盒、ELISA包被液、ELISA封閉液、ELISA終止液、10×ELISA洗滌液、雙組分TMB顯色液、酶標抗體稀釋液購自北京博奧森生物技術有限公司,VER 155008(10 mmol·L-1in DMSO,adenosine-derived inhibitor)購自美國Apex Bio Technology公司,凝血酶原時間(PT)測定試劑盒、凝血酶時間(TT)測定試劑盒、活化部分凝血酶時間(APTT)測定試劑盒、纖維蛋白原(FIB)測定試劑盒購自上海太陽生物技術公司,弗氏完全/不完全佐劑購自西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司,血凝分析儀MC-1000購自德國TECO公司,酶標儀Epoch2購自美國BioTek公司、7周齡SD大鼠購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。

1.2 引物設計

基于褐黃血蜱中腸轉錄組文庫中的Contig 41014序列,用Primer Premier 5.0軟件設計引物,交由北京擎科生物科技有限公司合成,引物序列見表1。引物HSP70-b2-F、HSP70-b2-M下劃線部分分別為NcoⅠ、XhoⅠ酶切位點,引物HSP70-b2-Mr、HSP70-b2-Mf下劃線部分為EagⅠ酶切位點,其所包含的突變堿基已斜體顯示。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3 克隆Contig 41014的3′序列

用EasyPure RNA試劑盒提取褐黃血蜱總RNA,SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit反轉錄合成褐黃血蜱3′RACE-Ready cDNA。以合成的cDNA為模板,以3′RACE-OP和UPM為引物,進行第一輪PCR,反應體系:上、下游引物(10 mmol·L-1)各1.5 μL、cDNA 1 μL、2×TransTaqHiFi PCR SuperMixⅡ 15 μL、ddH2O 11 μL。擴增條件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,65 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,20個循環(huán);72 ℃ 7 min;4 ℃保存。切膠回收第一輪PCR擴增產物。以回收產物為模板,以3′RACE-IP和UPS為引物,進行第二輪PCR擴增,反應體系及擴增條件同第一輪。切膠回收第二輪PCR擴增產物,連接于pMD19-T載體,轉化至DH5α感受態(tài)細胞,在含氨芐西林、異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside,IPTG)、X-gal的LB固態(tài)培養(yǎng)基過夜培養(yǎng),挑取陽性菌落,PCR驗證,提取擴增出正確條帶菌液的質粒送至北京擎科生物科技有限公司測序。DNAman 6.0軟件對3′端測序結果和Contig 41014序列進行比對、分析和拼接,得到褐黃血蜱HSP70-b2基因全長,并用SignalP 6.0軟件、ORF finder(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)對其進行生物信息學分析。

1.4 HSP70-b2基因的克隆、定點突變及重組表達質粒的構建

以cDNA為模板,HSP70-b2-F和HSP70-b2-R為引物,擴增HSP70-b2基因的開放閱讀框(open reading frame, ORF),反應體系:上、下游引物(10 mmol·L-1)各2 μL、cDNA 2 μL、2×TransTaqHiFi PCR SuperMixⅡ 25 μL、ddH2O 19 μL。擴增條件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,65 ℃ 30 s,72 ℃ 5 min,35個循環(huán);72 ℃ 10 min;4 ℃保存。切膠回收擴增產物并連接于pMD19-T載體,構建克隆質粒pMD19-HSP70-b2。以pMD19-HSP70-b2為模板,HSP70-b2-F和HSP70-b2-Mr為引物,擴增P1片段。反應體系:上、下游引物(10 mmol·L-1)各2 μL,模板 1 μL,2.5 mmol·L-1dNTPS 4 μL,TransStart?KD Plus DNA Polymerase 1 μL,5×TransStart?KD Plus Buffer 10 μL,ddH2O 30 μL。擴增條件同上。以HSP70-b2-Mf和HSP70-b2-R為引物,按同上條件,擴增P2片段。切膠回收P1、P2片段,EagⅠ酶切后凝膠電泳純化并切膠回收。DNA Ligation Kit連接酶切產物P1、P2的黏性末端,得到突變后的序列P3,即HSP70-b2-ORFM。以P3為模板,HSP70-b2-F和HSP70-b2-R為引物,按上述條件擴增HSP70-b2-ORFM。擴增產物經凝膠電泳、切膠回收后,連接pMD19-T載體,構建克隆質粒pMD19-HSP70-b2M。NcoⅠ、XhoⅠ酶切質粒pET-28a、pMD19-HSP70-b2和pMD19-HSP70-b2M,用DNA Ligation Kit分別將HSP70-b2-ORF、HSP70-b2-ORFM片段分別與線性質粒pET-28a進行連接,轉化至大腸桿菌BL21。挑選陽性菌落,PCR驗證并測序,構建表達質粒pET-28a-HSP70-b2和pET-28a-HSP70-b2M。

1.5 誘導表達、純化蛋白及Western blot

挑取陽性菌落至含卡那霉素(50 mg·mL-1)的LB培養(yǎng)液擴大培養(yǎng),37 ℃,180 r·min-1至OD600 nm值0.6。加入IPTG(0.5 mmol·L-1)誘導表達,6 h后收集菌液,4 ℃,5 000 r·min-1離心20 min,去上清,加入20 mL破菌緩沖液(20 mmol·L-1Tris,250 mmol·L-1NaCl,0.5% Triton X-100,1 mmol·L-1PMSF,pH 7.5)重懸,冰浴中超聲波裂解(15 min,功率180 W,開5 s關5 s),12 000 r·min-1,4 ℃離心15 min,收集上清液。用Ni-NTA His Bind Resin鎳柱進行純化。待目的蛋白與鎳柱結合后,使用洗雜緩沖液(20 mmol·L-1Tris,250 mmol·L-1NaCl,20 mmol·L-1imidazole)和洗脫緩沖液(20 mmol·L-1Tris,50 mmol·L-1NaCl,200/500 mmol·L-1imidazole)洗脫目的重組蛋白。純化的目的蛋白通過SDS-PAGE和Western blot進行檢測和驗證。在Western blot中,小鼠抗His單克隆抗體為一抗(1∶2 000稀釋),過氧化氫標記的山羊抗小鼠抗體為二抗(1∶5 000稀釋)。

1.6 重組蛋白HSP70-b2和HSP70-b2M抗凝血活性測定

用生理鹽水將rHSP70-b2或rHSP70-b2M稀釋至4 μmol·L-1。以同濃度的牛血清蛋白溶液(BSA)作為空白組,rHSP70-b2或rHSP70-b2M加入VER155008(100 μmol·L-1)作為抑制組。對SD大鼠進行眼眶靜脈采血,用3.8%檸檬酸鈉抗凝(檸檬酸鈉∶血液=1∶9),3 000 r·min-1離心10 min,取上層淡黃色血漿。根據凝血四項試劑盒說明書,分別測試rHSP70-b2、rHSP70-b2M對TT、PT、APTT、FIB四項數據的影響,每項測量平行重復8次,重組蛋白液、血漿、測量試劑均在測量前于37 ℃進行預溫。

1.7 重組蛋白HSP70-b2和HSP70-b2M免疫原性測定

用PBS將rHSP70-b2或rHSP70-b2M的濃度稀釋至600 μg·mL-1,制備前預熱弗氏完全/不完全佐劑至37 ℃,分別吸取等體積佐劑和rHSP70-b2或rHSP70-b2M至裝有雙孔乳化接頭的針筒內,進行乳化。取7周齡SD大鼠24只,隨機分成HSP70-b2組、HSP70-b2M組、陰性對照組和空白組。采用背部皮下多點注射法進行3次免疫,第1次免疫用弗氏完全佐劑乳化的重組蛋白,第2、3次免疫用弗氏不完全佐劑乳化的重組蛋白。重組蛋白濃度為300 μg·mL-1;每只大鼠注射100 μL乳化蛋白,即每只大鼠注射30 μg蛋白,陰性對照組注射100 μL生理鹽水。空白組不做任何處理,直接采血。每次免疫兩周后,眼眶靜脈采血,4 ℃過夜析出血清,3 000 r·min-1離心10 min,吸取上清至干凈離心管中,間接ELISA法測定HSP70-b2組、HSP70-b2M組、陰性對照組血清抗體效價。rHSP70-b2及rHSP70-b2M濃度為40 μg·mL-1(用ELISA包被液稀釋);被檢血清用酶標抗體稀釋液稀釋至1∶2 000倍;過氧化氫標記的山羊抗小鼠抗體為二抗(1∶20 000倍稀釋)。

2 結 果

2.1 Contig 41014序列3′端擴增結果

以褐黃血蜱3′RACE-Ready cDNA為模板,3′RACE-OP和UPM為引物進行第一輪PCR擴增后,再以3′RACE-IP和UPS為引物,進行第二輪PCR擴增,擴增后得到大小為1 065 bp的片段(圖1)。通過序列測定和DNAman 6.0軟件拼接,獲得褐黃血蜱中腸轉錄組文庫中的Contig 41014序列3′端,其大小為859 bp,拼接后的Contig 41014序列全長為2 413 bp。

M. DNA相對分子質量標準;A. 3′端擴增產物;N. 陰性對照M. DL2000 DNA marker; A. 3′end amplification products; N. Negative control圖1 褐黃血蜱中腸轉錄組文庫中Contig 41014序列3′端擴增Fig.1 Amplification of the 3′end of the Contig 41014 sequence in the midgut transcriptome library of Haemaphysalis flava

2.2 HSP70-b2同源性及序列分析

對比同源蛋白基因序列發(fā)現,褐黃血蜱Contig 41014與血紅扇頭蜱(Rhipicephalussanguineus; No. XP037504077)、微小扇頭蜱(Rhipicephalusmicroplus; XP037282991)、亞洲璃眼蜱(Hyalommaasiaticum; No.KAH6948317)、全溝硬蜱(Ixodespersulcatu; No.KAG0426161)、肩突硬蜱(Ixodesscapularis; No.XP029837103)的HSP70-b2高度相似(相似度97.8%)且結構特點一致。序列分析顯示,褐黃血蜱Contig 41014的ORF框長度為1 905 bp,5′非編碼區(qū)為97 bp,3′非編碼區(qū)為411 bp,無信號肽序列。ORF框編碼的蛋白為634 aa,相對質量為70 ku,其序列有如下特點:具有核酸結合區(qū)、底物結合區(qū)、C端結構域3段;有IDLGTTYSCV、IFDLGGGTFDVSI、IVLVGGSTRIPRIQ 3個HSP70家族標簽;含有亞細胞定位模體DEVD(圖2),上述結果表明褐黃血蜱中腸轉錄組文庫中Contig 41014的全長序列為褐黃血蜱的HSP70-b2基因序列,其序列已上傳至NCBI數據庫(No. MN518895)。

2.3 HSP70-b2基因的定點突變

由HSP70-b2-F和HSP70-b2-Mr為引物,擴增獲得P1片段,其長度為1 396 bp;HSP70-b2-Mf和HSP70-b2-R引物,擴增獲得P2片段,其長度為546 bp(圖3A)。P1、P2的黏性末端連接后獲得 P3(HSP70-b2-ORFM),其長度為1 923 bp(圖3B)。將HSP70-b2-ORFM克隆至pMD19-T后測序,測序結果與HSP70-b2進行比對,發(fā)現第455、459、461、463位氨基酸成功由H(CAC)變?yōu)镹(AAC)、T(ACC)變?yōu)镽(CGC)、D(GAC)變?yōu)镋(GAG)、M(ATG)變?yōu)镾(TCG)。

A. 突變堿基片段電泳圖;B. HSP70-b2-ORFM電泳圖。M. DNA相對分子質量標準;P1. 突變堿基片段P1;P2. 突變堿基片段P2;P3. HSP70-b2-ORFMA. Agarose gel electrophoresis of the mutant base fragment; B. Agarose gel electrophoresis of the HSP70-b2-ORFM. M. DL2000 DNA marker; P1. Mutant base fragment P1; P2. Mutant base fragment P2; P3. HSP70-b2-ORFM圖3 褐黃血蜱HSP70-b2堿基定點突變擴增結果Fig.3 Amplification of Haemaphysalis flava HSP70-b2 base by site-directed mutagenesis

2.4 表達載體的構建及酶切驗證

將pMD19-T-HSP70-b2和pMD19-T-HSP70-b2M雙酶切后,獲得表達片段,再將純化后的表達片段與雙酶切處理的線性原核表達載體pET-28a相連接;重組質粒轉化至Trans BL21(DE3)感受態(tài)細胞,挑取陽性菌落,酶切驗證表明,重組質粒均含有表達片段(圖4A、B)。經測序分析,表達片段插入位置正確,無變異,表達質粒pET-28a-HSP70-b2和pET-28a-HSP70-b2M重組成功。

A. pET-28a-HSP70-b2酶切驗證;B. pET-28a-HSP70-b2M酶切驗證。M. DNA marker;E. 空pET-28a質粒;F. 雙酶切空pET-28a質粒;1. HSP70-b2-ORF;2. pET-28a-HSP70-b2質粒;3. 雙酶切pET-28a-HSP70-b2質粒;4. HSP70-b2-ORFM;5. pET-28a-HSP70-b2M質粒; 6. 雙酶切pET-28a-HSP70-b2M質粒。所有質粒均使用Nco I、Xho I雙酶切進行驗證A. pET-28a-HSP70-b2 digestion verification; B. pET-28a-HSP70-b2M digestion verification. M. DNA marker; E. Empty pET-28a plasmid; F. Double digested empty pET-28a plasmid; 1. HSP70-b2-ORF; 2. pET-28a-HSP70-b2 plasmid; 3. Double digested pET-28a-HSP70-b2 plasmid; 4. HSP70-b2-ORFM; 5. pET-28a-HSP70-b2M plasmid; 6. Double digested pET-28a-HSP70-b2M plasmid. All plasmids were validated using Nco I, Xho I double digestion圖4 重組表達質粒pET-28a-HSP70-b2和pET-28a-HSP70-b2M的酶切驗證Fig.4 Restriction analysis of recombinant expression plasmid pET-28a-HSP70-b2 and pET-28a-HSP70-b2M

2.5 重組蛋白表達、純化和Western blot檢測

活化菌液經IPTG誘導培養(yǎng)6 h后,超聲破碎并進行His親和層析柱純化。經 SDS-PAGE凝膠結果顯示,在所有泳道中70 ku處均存在一條高豐度蛋白條帶(圖5A、B)。rHSP70-b2、rHSP70-b2M均以可溶性蛋白和包涵體兩種形式同時存在。洗脫液電泳條帶粗且清晰,雜蛋白少,純度較高。對純化后的蛋白進行Western blot檢測,出現特異性蛋白條帶(圖5C)。結果顯示,純化后蛋白為rHSP70-b2、rHSP70-b2M,表明通過純化成功獲得了以可溶性形式存在于上清液中的重組蛋白。

A. rHSP70-b2表達純化SDS-PAGE電泳圖;B. rHSP70-b2M表達純化SDS-PAGE電泳圖;C. rHSP70-b2和rHSP70-b2M的Western blot驗證。M. 蛋白相對分子質量標準;1和a分別為未破碎菌液總蛋白;2和b分別為純化前rHSP70-b2和rHSP70-b2M破菌上清液;3和c分別為純化前rHSP70-b2和rHSP70-b2M破菌沉淀溶解液;4和d分別為rHSP70-b2和rHSP70-b2M過柱穿出液;5、6、7和e、f、g分別為rHSP70-b2和rHSP70-b2M洗雜液;8、9和h、i分別為rHSP70-b2和rHSP70-b2M洗脫液;m.rHSP70-b2M; 70.rHSP70-b2A. SDS-PAGE analysis of purified rHSP70-b2 expression; B. SDS-PAGE analysis of purified rHSP70-b2M expression; C. Identification of rHSP70-b2 and rHSP70-b2M by Western blot. M. Protein marker; 1 and a are the total protein of unbroken bacteria solution, respectively; 2 and b are the broken bacteria supernatants of rHSP70-b2 and rHSP70-b2M before purification, respectively. 3 and c are the broken bacteria precipitation of rHSP70-b2 and rHSP70-b2M before purification. 4 and d are the effluent liquids of rHSP70-b2 and rHSP70-b2M, respectively. 5, 6, 7 and e, f, g are the wash liquids of rHSP70-b2 and rHSP70-b2M, respectively. 8, 9 and h, i are the eluents of rHSP70-b2 and rHSP70-b2M, respectively. m is rHSP70-b2M; 70 is rHSP70-b2圖5 rHSP70-b2、rHSP70-b2M表達、純化和Western blotFig.5 Expression and purification and Western blot of rHSP70-b2 and rHSP70-b2M

2.6 rHSP70-b2和rHSP70-b2M抗凝活性測定

rHSP70-b2和rHSP70-b2M對大鼠血漿PT和APTT體外抗凝血結果與對照組相近,凝血時間均處于正常區(qū)間(P>0.05)(圖6A、B),說明rHSP70-b2及rHSP70-b2M基于PT和APTT途徑無抗凝血效果。rHSP70-b2和rHSP70-b2M對大鼠血漿TT和FIB體外抗凝血結果與對照組相比,rHSP70-b2和rHSP70-b2M凝血時間顯著延長(P<0.05)(圖6C、D);rHSP70-b2與rHSP70-b2M之間無差異(P>0.05),說明rHSP70-b2和rHSP70-b2M基于TT和FIB途徑具有抗凝血效果,二者抗血凝效果相近。在TT和FIB體外抗凝血結果中,抑制組與對照組凝血時間均處于正常區(qū)間(P>0.05)(圖6C、D),說明抑制劑(VER155008)可有效抑制rHSP70-b2及rHSP70-b2M體外活性。

A. rHSP70-b2和rHSP70-b2M對凝血酶原時間(PT)的影響;B. rHSP70-b2和rHSP70-b2M對活化部分凝血酶時間(APTT)的影響;C. rHSP70-b2和rHSP70-b2M對凝血酶時間(TT)的影響;D. rHSP70-b2和rHSP70-b2M對纖維蛋白原(FIB)的影響。濃度與重組蛋白相等的BSA 作為陰性對照;抑制劑(VER155008)以終濃度為100 μmol·L-1作為抑制組;每項數據平行測定8次。*表示組間差異顯著(P<0.05)A. The effect of rHSP70-b2 and rHSP70-b2M on prothrombin time (PT); B. The effect of rHSP70-b2 and rHSP70-b2M on activated partial thrombin time (APTT); C. The effect of rHSP70-b2 and rHSP70-b2M on thrombin time (TT); D. The effect of rHSP70-b2 and rHSP70-b2M on fibrinogen (FIB). BSA solutions with concentrations comparable to recombinant protein were used as the negative controls. Inhibitor (VER155008) with a final concentration of 100 μmol·L-1 was used as the inhibition group. Each data was measured eight times in parallel. * indicate significant differences between groups (P<0.05)圖6 rHSP70-b2和rHSP70-b2M四項凝血參數結果Fig.6 Results of rHSP70-b and rHSP70-b2M on the four coagulation parameters

2.7 rHSP70-b2和rHSP70-b2M免疫原性測定

rHSP70-b2組和rHSP70-b2M組大鼠首次免疫后2周,均產生了特異性抗體,表明rHSP70-b2和rHSP70-b2M均具有一定免疫原性。rHSP70-b2組和rHSP70-b2M組第二次免疫產生的抗體水平明顯高于首次免疫,第三次免疫抗體水平增長不明顯;rHSP70-b2組產生的抗體水平在每次免疫后均顯著強于rHSP70-b2M組(P<0.01)(圖7),表明含有類14-Mer肽的rHSP70-b2誘導產生抗體的能力優(yōu)于含14-Mer肽的rHSP70-b2M(P<0.01)。

First為第一次免疫;Second為第二次免疫;Third為第三次免疫。**表示組間差異極顯著(P<0.01)First represents the first immunization; Second represents the second immunization; Third represents the third immunization.** indicate significant differences between groups (P<0.01)圖7 大鼠免疫后血清抗體水平Fig.7 Serum antibody concentration in rats after immunization

3 討 論

本研究基于褐黃血蜱中腸轉錄組庫中的Contig 41014序列,通過比對分析,發(fā)現其3′端有缺失。設計特異性引物對3′殘缺序列進行補全后,克隆得到其全長序列,比對分析結果顯示,褐黃血蜱Contig 41014序列編碼蛋白含有HSP70家族的典型標簽(IDLGTTYSCV、IFDLGGGTFDVSI、IVLVGGSTRIPRIQ)[16-18],確定其為HSP70家族成員。在人類與褐黃血蜱HSP70家族蛋白(ASA45615、AIS39468、APO36715)中發(fā)現存在EEVD的末端定位基序[19-20],但本研究中褐黃血蜱Contig 41014序列的3′殘缺序列中,其末端定位基序卻為DEVD。目前,尚無DEVD基序的人源HSP70成員[21],但是這種定位基序在蜱中并不罕見。NCBI蛋白數據庫中已公布了血紅扇頭蜱、微小扇頭蜱、亞洲璃眼蜱、全溝硬蜱、肩突硬蜱等的HSP70-b2,與本研究獲得的序列均高度相似(相似度97.8%),且C末端基序一致。為此作者將補全3′殘缺序列的Contig 41014與上述不同蜱種的HSP70-b2視為同一類熱休克蛋白,并命名為褐黃血蜱HSP70-b2。

(Fig.6Continuedonthenextpage)

HSP70廣泛存在于各種動物體內,其最初被發(fā)現在果蠅的熱休克反應中大量表達,并被證明在熱適應和應激狀態(tài)中發(fā)揮保護作用[22]。HSP70家族蛋白中包括13個家族成員,它們在表達水平、表達形式、氨基酸的組成方面均存在差異[23]。而有研究表明,蜱在吸血過程中,其體內的HSP70表達量會明顯增加,說明HSP70可能在蜱吸血過程中發(fā)揮一定作用[24]。同時,有研究證實HSP70在誘導大鼠高溫應激試驗中大量表達,可起到保護血管、阻止血栓形成的作用[25];Allende等[26]同樣發(fā)現HSP70具有有效預防血栓形成且無出血風險的作用。上述研究表明,HSP70家族中的部分成員具有一定抗凝血活性。為明確褐黃血蜱HSP70-b2是否具有抗凝血作用,以及突變類14-Mer肽的HSP70-b2M是否會增強或減弱抗凝血作用,本研究經原核表達、純化獲得了rHSP70-b2和rHSP70-b2M,并對其進行凝血四項指標PT、APTT、TT和FIB測定,其中,PT和APTT分別反映外源性和內源性凝血途徑的指標[27];TT反映了纖維蛋白原向纖維蛋白的轉化時間;FIB反映了纖維蛋白原產生纖維蛋白的能力[28]。本研究結果顯示,rHSP70-b2和rHSP70-b2M均可通過TT和FIB途徑產生抗凝血效果,說明二者可通過抑制凝血酶活性或阻止可溶性纖維蛋白原轉變?yōu)椴豢扇艿睦w維蛋白而發(fā)揮抗凝血作用,這與褐黃血蜱HSC70的抗凝血作用相一致[9]。

原核表達微小扇頭蜱腸道抗原Bm86制備的有效防控微小扇頭蜱疫苗,已說明抗蜱疫苗是一種可行的控蜱策略[29]。開發(fā)抗蜱疫苗的先決條件是篩選出在蜱生理過程中發(fā)揮重要作用的蛋白分子,且該蛋白應具有較好的免疫原性。研究表明,HSP70可與特異性多肽結合,形成的 HSP70-多肽復合物被特殊的抗原呈遞細胞攝取后,遞呈給MHC分子并被T細胞識別[30],且HSP70的14-Mer肽可增強NK細胞的增殖與活性[14]。本研究結果表明,未突變的含類14-Mer肽的rHSP70-b2誘導產生抗體的能力強于突變后含14-Mer肽的rHSP70-b2M,這可能是由于突變后的14-Mer肽雖強化了NK細胞活性,但NK細胞對刺激抗體表達并未發(fā)揮正面效應[31]。盡管如此,本研究結果依然證明了rHSP70-b2、rHSP70-b2M能夠刺激大鼠對相應抗原產生特異性抗體,這與藺煥然等[32]用原核表達的犬吉氏巴貝斯蟲(Babesiagibsoni)HSP70蛋白免疫小鼠產生抗體的研究結論相一致。

4 結 論

rHSP70-b2和rHSP70-b2M可通過抑制凝血酶活性或阻止可溶性纖維蛋白原轉變?yōu)椴豢扇艿睦w維蛋白而發(fā)揮抗凝血作用。rHSP70-b2和rHSP70-b2M均可刺激機體產生特異性抗體,且rHSP70-b2的免疫原性強于rHSP70-b2M。