王鵬旭 阮 鑫 董曉英

細胞外囊泡(extracellular vesicle, EV)是一種由細胞釋放的膜囊泡,它能夠將信息傳遞給其他細胞甚至是遠離囊泡的細胞,影響受體細胞的功能,以達到細胞間通訊的作用[1, 2]。EV的存在極其廣泛,在哺乳動物體內,EV存在于體液(如血液、尿液、卵泡液、子宮液等)中,且?guī)缀蹼S體液遍布全身。EV可以通過不同的分子(蛋白質、脂質、核酸等)傳輸信號,并且可以通過包裝多種分子來遞送多種信息。此外,EV的內容物、大小和膜組成隨著細胞來源、狀態(tài)和環(huán)境條件的改變而發(fā)生一系列的動態(tài)變化[2]。作為新型的細胞間交流方式,EV廣泛參與了許多人體病理和生理過程,這個特性讓它成為新的疾病標志物和有潛力的疾病治療工具[3]。隨著對EV研究的不斷深入,EV越來越多地被用于液態(tài)活檢、癌癥的診斷和治療、免疫調節(jié)、靶向藥物遞送、組織再生和疫苗接種等。同時越來越多的研究表明,EV在女性生殖中也有著重要的通訊作用,包括卵泡發(fā)育、受精、胚胎發(fā)育及質量、胚胎植入等階段[4]。因此,它也成為了改善輔助生殖技術過程及效果的潛在工具。卵泡發(fā)育作為女性生殖的起始階段,對后續(xù)生殖過程的正常進行至關重要,而EV又對卵泡發(fā)育有著重要的調節(jié)等作用。因此,本文將從EV的角度出發(fā),與顆粒細胞(granulosa cell, GC)和卵母細胞間常規(guī)的細胞通訊方式進行對比,對它在卵泡發(fā)育過程中的交互作用進行綜述,并闡述未來EV在幫助改善早發(fā)性卵巢功能不全的卵泡發(fā)育問題上有哪些可能的應用。

一、卵泡發(fā)育中顆粒細胞與卵母細胞的交互作用

在卵泡的生長過程中,涉及到GC、卵母細胞和體細胞之間旁分泌方式的交流,以及促卵泡激素(follicle-stimulating hormone,FSH)等內分泌方式的交流。其中最為重要的就是GC和卵母細胞間的交互作用,并且它們在卵泡發(fā)育的不同階段,呈現出不同的交互作用。

1.原始卵泡激活階段的信號交流:自出生時,原始卵泡就存于卵巢中,它由單層扁平GC和卵母細胞組成,此時GC和卵母細胞之間直接接觸。青春期時,原始卵泡會被激活,這個過程主要由卵母細胞內PI3K/PTEN/Akt/FOXO3信號通路介導,而且GC也在此過程發(fā)揮重要的作用。在顆粒細胞中存在著mTOR (mammalian target of rapamycin, mTOR)復合物分為mTORC1和mTORC2兩種不同的復合體。mTORC1受到TSC1/TSC2(tuberous sclerosis complex,TSC) 復合物的調節(jié)。且RPTOR(regulatory associated protein of mTOR, RPTOR)也是調節(jié)mTORC1復合物的重要蛋白。當對原始GC中TSC1和RPTOR的進行剔除后,GC中的mTOR1的信號會受到相應的抑制作用,隨后原始卵泡的激活會更明顯。該實驗也表明,GC中的mTOR信號能夠增加GC中KIT-受體酪氨酸激酶配體的表達,這會導致KIT配體與卵母細胞表面更多的KIT受體結合,進一步激活PI3K信號轉導,從而促進原始卵泡的激活[5,6]。同時還有研究表明,卵母細胞中RPTOR的缺失對卵泡發(fā)育并無影響[5]。這說明原始GC發(fā)出的mTOR信號可以促進原始卵泡的激活,且比卵母細胞發(fā)出的mTOR信號更為重要。

2.卵泡生長階段的信號交流:原始卵泡被激活后卵母細胞開始生長,同時GC也由鱗狀變成立方形并開始增殖。同時,卵細胞分泌糖蛋白等成分形成透明帶保護卵細胞,而多層立方GC則通過形成跨區(qū)域投射的結構穿透透明帶與卵細胞相連[7]。TZP的尖端含有間隙連接,GC和卵母細胞之間通過間隙連接輸送營養(yǎng)物質和傳遞信號分子[8,9]。GC通過間隙連接向卵母細胞提供營養(yǎng)物質,這是由于卵母細胞缺少關鍵酶而無法充分利用葡萄糖、氨基酸和膽固醇等物質,需要GC的協助才能吸收[10]。同樣,卵母細胞向GC傳遞信息分子,這些信號的主要作用是調節(jié)GC生長和功能,如生長分化因子-9(growth differentiation factor-9, GDF-9)和骨形成蛋白-15(bone morphogenetic protein-15, BMP-15),兩者在卵泡發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用,缺乏GDF-9的小鼠的GC最多只能發(fā)育到2層,缺乏BMP-15的雌性小鼠雖然卵泡生長的相對正常,但卵母細胞的排卵和受精過程會受損[11]。目前已經證明,GDF-9和BMP-15能夠發(fā)揮協同作用刺激GC增殖與分化、維持GC形態(tài)、促進GC產生絲狀偽足、調節(jié)GC的糖酵解和膽固醇合成等過程[12,13]。除了這兩種重要信號分子,卵母細胞還能衍生旁分泌因子通過刺激GC制造丙酮酸來滿足卵母細胞對營養(yǎng)物質的需求[7]。

3.卵泡成熟階段的信號交流:在卵母細胞未受到FSH的信號時,其成熟會被抑制,這種抑制作用需要卵母細胞和GC的相互配合,即需要卵母細胞與附壁GC的接觸以及間隙連接來維持其正常的通訊功能[7,14]。青春期前,GC產生的環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)通過間隙連接進入卵母細胞抑制環(huán)磷酸腺苷(cAMP)的水解,從而抑制卵母細胞成熟;青春期后,FSH的激增激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK),MAPK作用于GC來降低間隙連接的通透性,增加GC內cAMP的水平并降低卵母細胞中的cAMP和cGMP,從而誘導減數分裂的恢復以及卵丘的擴張[15]。因此,卵母細胞的成熟抑制和減數分裂的恢復階段也同樣需要GC和卵母細胞間的交流。

二、EV在卵泡發(fā)育中的作用

在卵泡發(fā)育過程中,除了上述的TZP和間隙連接,EV也是非常重要的通訊工具。根據EV的發(fā)生機制、大小、含量和功能,它們分為外泌體、微泡和凋亡小體3種類型[16]。目前,很多研究已經描述了人類卵泡液中的EV的分子特征以及EV在卵泡發(fā)育中的交互作用[17,18],概括為以下3個方面:

1.EV中的微小RNA(miRNA)促進卵泡發(fā)育:卵泡生長階段,EV傳遞著很多大分子物質、RNA、蛋白質、DNA等,其中關于miRNA的研究最多,同時它也是發(fā)揮作用最大的分子。

從原始卵泡的激活階段開始,EV中的miRNA就參與其中。卵泡液外泌體中的miRNA214、miRNA212和miRNA132能夠靶向PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten),抑制其對PI3K通路的負調節(jié)作用,從而激活蛋白激酶B(Akt)并開啟PI3K信號通路,參與調控原始卵泡的激活。此外,miRNA調節(jié)的PI3K通路還涉及卵泡成熟的各個階段,如原始卵泡的存活、顆粒細胞排卵、周期性卵泡募集和卵母細胞減數分裂恢復等[19]。

除了對原始卵泡的激活過程的調節(jié),EV中的miRNA在卵泡生長過程中也具有重要的通訊作用。研究發(fā)現,多種miRNA會靶向并調節(jié)卵泡生長和卵母細胞成熟相關途徑中的關鍵信號通路,例如轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、Wnt信號通路、MAPK、表皮生長因子受體通路等。TGF-β在卵泡生長和胚胎發(fā)育中起著重要作用;Wnt信號通路是調節(jié)胎兒卵巢卵泡發(fā)育、卵母細胞成熟以及類固醇生成和黃體化的信號通路;MAPK能夠刺激GC增殖和卵丘擴張,還可以影響促黃體生成素(luteinizing hormone,LH)誘導的卵母細胞成熟過程。此外,MAPK還與表皮生長因子受體通路一起,促進了卵母細胞減數分裂的恢復。例如,外泌體能夠通過miRNA靶向和調節(jié)GC的TGF-β家族成員,影響ACVR1(activin A receptor type 1,ACVR1)信號轉導和DNA結合因子2(ID2)功能,從而調節(jié)卵泡的成熟[20]。此外,miRNA-181a也能靶向TGF-β家族成員激活素,抑制其受體的表達,從而阻斷激活素對GC的增殖作用[21]。

2.卵泡吸收EV后促進卵泡發(fā)育:當EV和卵泡共同培養(yǎng)時,EV會被卵丘卵母細胞復合物所吸收,并對后續(xù)卵泡的發(fā)育起著促進的作用。在對小鼠和牛的實驗中,當用其卵泡液中的外泌體和卵丘-卵母細胞復合物共同培養(yǎng)后,卵丘會發(fā)生擴張且相關擴張基因的表達也會增加,而且從小卵泡中分離出的EV比從大卵泡中分離出的EV表現出更多的活性[22]。后續(xù)對牛的研究中發(fā)現,卵泡液中的EV在被周圍的GC吸收后能不同程度地刺激GC的增殖,并且GC優(yōu)先從小卵泡中吸收EV。這也說明在卵泡發(fā)育早期的小卵泡階段,GC能從小卵泡中吸收更多的EV,從而能更快地增殖[23]。

3.EV保護卵泡發(fā)育:EV不僅對卵泡發(fā)育過程起著非常重要的調節(jié)作用,而且還能增強卵泡的防御系統(tǒng)。研究表明,在外界環(huán)境壓力下,卵泡液中的外泌體能夠保護細胞,免受外界影響。例如,在氧化應激期間,GC產生的EV含有更高比例的抗氧化劑和其他與細胞防御相關的物質[17,24]。有研究發(fā)現,卵丘-卵母細胞復合體在用卵泡液的EV處理后可減少卵丘細胞的凋亡和熱休克引起的卵母細胞損傷[17,25]。

因此,在原始卵泡的激活階段,EV通過包裝信號分子miRNA來對PI3K通路進行調節(jié)。隨后在卵泡成長過程中,EV作為新的通訊方式,不同于間隙連接通道,它是經過包裝的,而且經過體液運輸到受體細胞。雖然與傳統(tǒng)的通訊方式不同,但卵泡發(fā)育的正常進行需要兩者的共同合作。因此,EV在幫助治療卵泡發(fā)育問題上具有很好的前景。

三、EV在恢復卵巢功能上的應用方向

1.間充質干細胞(mesenchymal stem cell,MSC)分泌的EV恢復卵巢功能:MSC是一種多能干細胞,具有自我更新、再生和修復缺陷細胞的能力,而且它們比其他干細胞更容易從各種組織中提取。因此,它成為了再生醫(yī)學的研究熱點[26]。在女性生殖領域,干細胞已被證明是恢復卵巢功能的有效治療工具。例如,骨髓間質干細胞可以從抑制卵巢顆粒細胞凋亡、促進血管生成、減少細胞外基質沉積、抗卵巢組織纖維化、抑制炎性反應等方面促進卵巢功能的恢復[27]。然而,異體MSC移植過程中可能存在免疫排斥和致瘤的風險。因此,MSC移植的臨床使用受到限制。

越來越多的研究證明,MSC可以通過它們的旁分泌作用治療疾病,而且MSC分泌的細胞外囊泡與MSC具有相同的作用,例如免疫調節(jié)以及組織修復和再生。目前許多研究已經說明MSC分泌的EV在治療許多疾病方面發(fā)揮重要的作用,如腎病、肝病、心血管疾病、免疫系統(tǒng)和神經系統(tǒng)疾病等。在女性生殖領域,也有研究證明MSC的EV能夠治療卵巢早衰。這些EV主要從誘導血管生成,抑制GC凋亡,減少氧化應激等方面來促進卵巢功能的恢復[28～30]。相比于干細胞治療方案,EV缺乏自我復制能力,沒有異位分化的危險,不會導致腫瘤的形成;而且它沒有免疫排斥反應。因此,干細胞EV可以為臨床治療應用提供更安全的替代方案。

盡管有動物實驗表明,MSC-衍生的EV對治療卵巢早衰有一定的效果,但是目前相關臨床試驗數據正在進行,MSC-EV在治療卵巢早衰方面的安全性有待確定,而EV療法的安全性將是其能否作為臨床治療的關鍵。如果EV療法是安全的,研究人員也需要克服很多挑戰(zhàn):(1)為了提升EV療法的治療效率,可以從增強EV內的活性成分來入手,目前已有實驗做了嘗試。(2)應該更加了解EV的分子機制,制定標準化的分離和純化方法。(3)應該尋找出大規(guī)模生產EV的方法。

2.基于EV的藥物遞送:目前很多研究正在探索把EV作為天然藥物輸送載體,這是因為EV與傳統(tǒng)的藥物遞送比較,具有多方面優(yōu)勢:一方面,EV包裹后的藥物更加穩(wěn)定,不易被免疫系統(tǒng)清除;另一方面,藥物能借助EV跨越生物屏障(如血-腦脊液屏障等)和靶向指定細胞。目前,基于EV的藥物遞送已經嘗試了許多種類的化療藥物,而且證明了EV封裝后的治療效果更好,例如,姜黃素在封裝后抗炎效果多出3倍,多柔比星和紫杉醇抗腫瘤作用更強,且藥物有著更好的生物活性和靶向效率。但是目前缺乏標準化EV分離和純化方法,而且作為載體的EV細胞來源并未確定。同時女性生殖領域方面的藥物載體研究也很少,因此,基于EV的藥物傳輸系統(tǒng)能否在恢復卵巢功能上應用,需要后續(xù)研究進一步探索。

四、展 望

在卵泡發(fā)育過程中,GC和卵母細胞間常規(guī)的通訊模式主要是通過間隙連接,即通過間隙連接傳輸信號分子和營養(yǎng)物質。不同于間隙連接,EV僅傳遞信號分子而不傳遞營養(yǎng)物質,它運用包裝的方式,通過體液到達受體細胞傳輸信息,發(fā)揮調節(jié)作用,特別是通過其內容物miRNA,EV可以對卵泡發(fā)育過程中的很多信號通路進行調節(jié)。因此,EV在解決卵泡發(fā)育問題方面有很好的前景。

目前EV已有了一些應用的方向,例如,液態(tài)活檢和藥物傳輸系統(tǒng),在女性生殖領域,MSC-EV療法有望作為新型無細胞療法,是解決卵巢早衰的卵泡發(fā)育問題的未來重要研究方向。除此之外,并未有很多研究去探索EV的治療潛力。鑒于其他領域對EV作為藥物遞送系統(tǒng)的研究,也可以使用EV包裝治療卵巢功能的藥物,或者我們可以設想通過藥物如中藥的有效成分對EV的作用過程進行干預,但這兩種方法是否可行需要實驗的證實。目前對EV的各方面應用都還處于起步階段,對EV的作用機制研究還不完全清楚,而且缺少標準的EV分離純化方法。因此,在今后的研究中,需要對EV進行更細致地分析,并且在確認EV安全性的同時發(fā)展各種技術手段對其進行利用,這樣才能將基于EV的治療方式帶向臨床和實踐。