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鮮積雪草化學(xué)成分的分離鑒定

2023-04-23 22:53黃穎雪繆麗蘭田明明吳繼春
中國民族民間醫(yī)藥 2023年22期
關(guān)鍵詞:積雪草分子式柱層析

黃穎雪 繆麗蘭 田明明 吳繼春

貴州中醫(yī)藥大學(xué),貴州 貴陽 550025

積雪草Centellaasiatica(L.)Urb.為傘形科積雪草屬多年生匍匐草本植物,廣泛分布于長江流域以南各地。積雪草用藥歷史悠久,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,具有清熱利濕、解毒消腫的功效,主要用于治療濕熱黃疸、中暑腹瀉、石淋熱淋、癰腫瘡毒、跌撲損傷等病癥[1-2]。同時,鮮積雪草還是一種使用廣泛的鮮藥,內(nèi)服或外用治療流行性腮腺炎、傳染性肝炎、帶狀皰疹等[3]。目前,已從該植物中發(fā)現(xiàn)三萜及其苷類、多炔類、揮發(fā)油、黃酮類、生物堿等化學(xué)成分[4]。藥理研究[5]表明,積雪草提取物具有抗腫瘤、抗纖維化、抗炎、抗阿爾茲海默癥、改善學(xué)習(xí)記憶能力、抗抑郁、抑制瘢痕增生和修復(fù)皮膚損傷等作用,積雪草苷被認(rèn)為是發(fā)揮相關(guān)功效的主要活性成分。此外,積雪草總黃酮還具有促進組織愈合、止血、止痛等活性[6]。對鮮積雪草化學(xué)成分的研究未見報道。研究表明,鮮藥與干藥中的化合物種類和含量可能存在差異,藥理作用也有區(qū)別[7]。據(jù)此,本實驗對鮮積雪草全草95%乙醇提取物的化學(xué)成分進行分離鑒定,得到7個化合物,其中3個化合物為首次從積雪草中分離得到。報道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Bruker Avance Neo-400 MHz核磁共振波譜儀(TMS為內(nèi)標(biāo),德國Bruker公司);Buchi旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司);WFH-308B型三色紫外分析儀(上海精科實業(yè)有限公司);超聲儀(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司);數(shù)顯熱風(fēng)槍(德力西電氣)。

1.2 材料 柱層析硅膠(200~300目、300~400目,青島海洋化工有限公司);Sephadex LH-20葡聚糖凝膠(美國GE公司);GF254薄層硅膠板(青島海洋化工有限公司)。其它試劑均為分析純。實驗藥材于2019年11月采自貴州省貴陽市花溪大學(xué)城,由貴州中醫(yī)藥大學(xué)江洪副教授鑒定為傘形科植物積雪草Centellaasiatica(L.)Urb.的新鮮全草。

2 提取與分離

鮮積雪草全草100 kg,洗凈切碎,95%乙醇(200 L)浸泡提取4次,提取液減壓濃縮得浸膏3.0 kg??偨嗷鞈矣?0 L水中,分別用等體積石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取。石油醚萃取部分(640 g)經(jīng)硅膠柱層析分離,石油醚∶乙酸乙酯(100∶0→0∶100)梯度洗脫,得到5個流分Fr.A~Fr.E。Fr.B經(jīng)硅膠柱層析分離,石油醚∶乙酸乙酯(10∶1)洗脫,得到Fr.B-1~Fr.B-2兩個流分。Fr.B-1經(jīng)硅膠柱層析(石油醚∶乙酸乙酯=5∶1洗脫)、Sephadex LH-20柱層析(二氯甲烷∶甲醇=1∶1洗脫)得到化合物1(150 mg)。Fr.C重結(jié)晶(乙酸乙酯)得化合物2(15 g);母液經(jīng)硅膠柱層析(石油醚∶乙酸乙酯=5∶1洗脫)、Sephadex LH-20柱層析(二氯甲烷∶甲醇=1∶1洗脫)得到化合物3(20 mg)。乙酸乙酯萃取部分(100 g)通過硅膠柱層析,二氯甲烷∶甲醇(100∶0→0∶100)梯度洗脫,得到4個流分Fr.F~Fr.I。Fr.G采用硅膠柱層析(二氯甲烷∶甲醇=50∶1洗脫)、Sephadex LH-20柱層析(二氯甲烷∶甲醇=1∶1洗脫),最后重結(jié)晶(甲醇)得到化合物4(15 mg)。Fr.H采用硅膠柱層析(石油醚∶乙酸乙酯=1∶1洗脫)、Sephadex LH-20柱層析(二氯甲烷∶甲醇=1∶1洗脫),得到化合物5(10 mg)。Fr.I采用硅膠柱層析(石油醚∶乙酸乙酯=1∶1洗脫)分為Fr.I-1~Fr.I-3。Fr.I-1和Fr.I-3的沉淀分別用乙醇反復(fù)洗滌、離心得到化合物6(8.0 g)、7(10 g)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1:淡黃色油狀,易溶于石油醚、二氯甲烷,分子式為C17H22O3。1H NMR (400 MHz,CDCl3)δ:5.95 (1H,dd,J=8.6,4.3 Hz,H-8),5.70 (1H,m,H-2),5.48 (1H,dq,J=15.6,7.5,5.3 Hz,H-10),5.26 (1H ddd,J=22.3,13.3,5.6 Hz,H-9),5.01 (1H dd,J=10.5,5.2 Hz,H-1),4.72 (1H,t,J=5.0 Hz,H-3),1.98 (2H,dd,J=10.0,4.8 Hz,H-11),1.88 (3H,s,H-17),1.21 (2H,t,J=7.1 Hz,H-12),1.12 (4H,m,H-13,14),0.72 (3H,dt,J=10.7,5.0 Hz,H-15);13C NMR (100 MHz,CDCl3)δ:169.7 (C-16),136.2 (C-10),135.8 (C-2),123.7 (C-9),116.8 (C-1),79.0 (C-4),75.9 (C-7),69.4 (C-5),69.4 (C-6),62.9 (C-3),60.1 (C-8),31.2 (C-13),28.6 (C-12),27.6 (C-11),22.3 (C-14),20.7 (C-17),13.9 (C-15)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]中的化合物8-acetoxyfalcarinol相似,但是對比1H NMR和13C NMR譜發(fā)現(xiàn),化合物1比化合物8-acetoxyfalcarinol少了兩個亞甲基。通過CAS SciFinder數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn),化合物1與文獻(xiàn)[9]中的化合物Ⅲ數(shù)據(jù)一致,故鑒定化合物1為3-Hydroxy-8-acetoxy-pentadecadien-(1,9)-diin-(4,6)。

化合物2:白色針狀結(jié)晶,易溶于二氯甲烷、乙酸乙酯等溶劑,分子式為C29H50O。1H NMR (400 MHz,CDCl3)δ:5.30 (1H,m,H-6),0.97 (3H,s,H-19),0.88 (3H,d,J=6.6 Hz,H-21),0.81 (3H,m,H-27),0.78 (3H,d,J=1.7 Hz,H-26),0.75 (3H,d,J=6.9 Hz,H-29),0.65 (3H,d,J=7.4 Hz,H-18);13C NMR (100 MHz,CDCl3)δ:140.7 (C-5),121.4 (C-6),71.5 (C-3),56.7 (C-14),55.9 (C-17),50.0 (C-9),45.7 (C-24),42.2 (C-4),42.1 (C-13),39.6 (C-12),37.1 (C-1),36.4 (C-10),36.0 (C-20),33.8 (C-22),31.8 (C-8),31.7 (C-2),30.1 (C-7),29.0 (C-25),28.2 (C-16),25.9 (C-23),24.2 (C-15),22.9 (C-28),20.9 (C-11),19.7 (C-26),19.2 (C-19),18.9 (C-27),18.6 (C-21),11.9 (C-29),11.8 (C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]一致,故鑒定化合物2為β-谷甾醇。

化合物3:棕黃色油狀,易溶于二氯甲烷、乙酸乙酯等溶劑,分子式為C21H38O4。1H NMR (400 MHz,CDCl3)δ:5.39 (4H,m,H-9,10,12,13),4.14 (3H,pd,J=11.7,4.8 Hz,H-1′,2′,3′),2.34 (2H,t,J=7.5 Hz,-CH2-COO),0.88 (3H,t,J=4.1 Hz,H-18);13C NMR (100 MHz,CDCl3)δ:173.8 (C-1),130.1 (C-10),129.9 (C-12),128.0 (C-13),127.8 (C-9),68.3 (C-2′),65.0 (C-1′,C-3′),34.0 (C-2),31.8 (C-6),31.4 (C-16),29.5 (C-7),29.3 (C-15),29.1 (C-4),29.0 (C-5),27.1 (C-8,C-14),25.6 (C-11),24.8 (C-3),22.5 (C-17),14.0 (C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]一致,故鑒定化合物3為1,3-dihydroxylpropyl-(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienate。

化合物4:乳白色顆粒,溶于甲醇;分子式為C10H10O4。1H NMR (400 MHz,MeOD)δ:7.58 (1H,d,J=15.9 Hz,H-7),7.16 (1H,d,J=1.9 Hz,H-2),7.05 (1H,dd,J=8.2,2.0 Hz,H-6),6.80 (1H,d,J=8.1 Hz,H-5),6.30 (1H,d,J=15.9 Hz,H-8),3.87 (3H,s,-CH3);13C NMR (100 MHz,MeOD)δ:170.9 (C-9),150.4 (C-3),149.3 (C-4),146.9 (C-8),127.7 (C-1),123.9 (C-6),116.4 (C-5),115.8 (C-2),111.6 (C-7),56.4 (C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]一致,故鑒定化合物4為咖啡酸甲酯。

化合物5:黃色油狀,易溶于二氯甲烷、乙酸乙酯,分子式為C15H20O2。1H NMR (400 MHz,CDCl3)δ:5.92 (1H,ddd,J=17.0,10.1,5.4 Hz,H-2),5.59 (1H,m,H-10),5.51 (1H,dd,J=8.3,1.5 Hz,H-9),5.47 (1H,d,J=1.4 Hz,H-1),5.24 (1H,d,J=10.1 Hz,H-1),5.19 (1H,d,J=8.2 Hz,H-8),4.93 (1H,d,J=5.2 Hz,H-3),2.09 (2H,qd,J=7.3,1.4 Hz,H-11),1.38 (2H,m,H-12),1.27 (4H,m,H-13,14),0.87 (3H,t,J=6.8 Hz,H-15);13C NMR (100 MHz,CDCl3)δ:135.6 (C-2),134.5 (C-10),127.5 (C-9),117.3 (C-1),79.74 (C-7),78.1 (C-4),70.2 (C-5),68.6 (C-6),63.3 (C-3),58.4 (C-8),31.3 (C-14),28.8 (C-12),27.5 (C-11),22.4 (C-13),13.9 (C-15)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]一致,故鑒定化合物5為araliadiol。

化合物6:黃色粉末,溶于甲醇;分子式為C15H10O6。1H NMR (400 MHz,MeOD)δ:8.07 (2H,d,J=9.0 Hz,H-2′,6′),6.89 (2H,d,J=8.9 Hz,H-3′,5′),6.37 (1H,d,J=2.1 Hz,H-8),6.16 (1H,d,J=2.1 Hz,H-6);13C NMR (100 MHz,MeOD)δ:177.2 (C-1),165.5 (C-7),162.4 (C-5),160.4 (C-4′),158.1 (C-9),147.9 (C-2),137.0 (C-3),130.6 (C-2′,C-6′),123.6 (C-1′),116.2 (C-3′,C-5′),104.5 (C-10),99.2 (C-6),94.4 (C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]一致,故鑒定化合物6為山柰酚。

化合物7:黃色粉末,溶于甲醇;分子式為C15H10O7。1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ:7.67 (1H,d,J=2.1 Hz,H-2′),7.54 (1H,dd,J=8.5,2.2 Hz,H-6′),6.88 (d,J=8.5 Hz,H-5′),6.40 (1H,d,J=2.0 Hz,H-8),6.18 (1H,d,J=2.0 Hz,H-6);13C NMR (100 MHz,DMSO-d6)δ:175.3 (C-4),163.4 (C-7),160.2 (C-5),155.6 (C-9),147.1 (C-2),146.2 (C-4′),144.5 (C-3′),135.2 (C-3),121.4 (C-1′),119.4 (C-6′),115.1 (C-5′),114.5 (C-2′),102.5 (C-10),97.6 (C-6),92.8 (C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]一致,故鑒定化合物7為槲皮素。

4 討論

新鮮積雪草總浸膏采用硅膠、Sephadex LH-20凝膠柱層析等方法進行分離純化,通過核磁共振波譜數(shù)據(jù)鑒定結(jié)構(gòu),得到7個化合物,分別是3-Hydroxy-8-acetoxy-pentadecadien-(1,9)-diin-(4,6)(1)、β-谷甾醇(2)、1,3-dihydroxylpropyl-(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienate (3)、咖啡酸甲酯(4)、araliadiol (5)、山柰酚(6)、槲皮素(7)。其中化合物1、5是聚炔類化合物。聚炔具有抗微生物、抗腫瘤、異株克生等活性[16]?;衔?的活性研究未見報道,化合物5具有抑制人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)生長[13]和保護神經(jīng)[17]等作用。雖然前人也從積雪草中得到多種聚炔成分,但是對這些成分的活性研究較少,有待深入。化合物6和7是黃酮類化合物,本實驗發(fā)現(xiàn)這兩個化合物在新鮮積雪草中含量較高。有文獻(xiàn)[18]報道積雪草中的山奈酚含量較低,與本實驗結(jié)果矛盾?;衔?具有抗腫瘤、治療糖尿病和骨質(zhì)疏松、保護損傷細(xì)胞等作用[19],化合物7具有抗糖尿病、抗高血壓、抗阿爾茨海默病、抗衰老及保護心血管等作用[20]。積雪草總黃酮在治療慢性肛裂的過程中能夠促進組織聚合、止血、減少疼痛[6],今后可以針對積雪草中的黃酮單體化合物展開相關(guān)研究。化合物1、3、4為首次從積雪草中分離得到,同時化合物6的含量與前人報道矛盾,表明干鮮積雪草的化合物種類和含量可能均有差異。后續(xù)還需要系統(tǒng)分析產(chǎn)地、采收期、加工過程等因素對積雪草的化學(xué)成分和功效的影響,為合理開發(fā)利用這一藥材提供依據(jù)。

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