劉 幫，王 西，張亞東，甘浪飛，曾夢(mèng)圓

（1.四川郎酒股份有限公司，四川古藺 646523；2.四川省醬香型白酒生態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川古藺 646523）

四甲基吡嗪（2,3,5,6-Tetramethylpyrazine,TTMP），化學(xué)名為2,3,5,6-四甲基吡嗪，又名川芎嗪，存在于白酒、大豆制品、咖啡、乳制品等產(chǎn)品中，有類似于爆米花、堅(jiān)果和水果的特別香味，具有擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)及抑制血小板積聚的作用。經(jīng)研究，以四甲基吡嗪等為原料合成的衍生物，對(duì)人神經(jīng)母瘤細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的增殖起著抑制作用[1]。四甲基吡嗪還可通過調(diào)控NF-κB 和MAPK 等信號(hào)通路降低人體內(nèi)幽門螺桿菌代謝物，對(duì)引起的炎癥有抑制作用，具有一定的抗炎活性，是白酒中重要的健康功能因子[2]。

四甲基吡嗪在白酒中產(chǎn)生的主要途徑是微生物的代謝反應(yīng)[3]，生產(chǎn)工藝的差異導(dǎo)致各香型白酒中四甲基吡嗪含量存在差異。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，四甲基吡嗪含量在醬香型白酒中最高，芝麻香、濃香型白酒次之，清香型白酒中最低[4-5]，獨(dú)特的堆積糖化工藝是醬香型白酒和芝麻香型白酒中四甲基吡嗪含量較高的主要原因。

1 四甲基吡嗪的性質(zhì)與檢測(cè)

1.1 四甲基吡嗪性質(zhì)

四甲基吡嗪分子式為C8H12N2，密度1.08×103kg/m3，熔點(diǎn)82～86 ℃，沸點(diǎn)190 ℃，純物質(zhì)狀態(tài)下呈白色晶體或粉末狀，其結(jié)構(gòu)是（見圖1）含兩個(gè)氮雜原子的六元雜環(huán)化合物，因此具有與吡啶類似的氣味、芳香性。從雜化軌道理論角度而言，四甲基吡嗪雜氮原子上未共用電子對(duì)不參與大π 體系的形成，同時(shí)由于氮的電負(fù)性比碳大，造成雜環(huán)上電子云密度較低，最終導(dǎo)致四甲基吡嗪極不容易發(fā)生親電取代反應(yīng)。

圖1 四甲基吡嗪化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1.2 四甲基吡嗪檢測(cè)技術(shù)

利用氣相色譜技術(shù)、液相色譜技術(shù)及氣質(zhì)聯(lián)用等先進(jìn)技術(shù)和設(shè)備分析白酒風(fēng)味組成已然成為科研熱點(diǎn)，四甲基吡嗪的定性、定量檢測(cè)建立在氣相色譜、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀的基礎(chǔ)上，結(jié)合不同的樣品前處理方式進(jìn)行測(cè)定[6-10]。

隨著檢測(cè)技術(shù)及設(shè)備的迭代，白酒中四甲基吡嗪檢測(cè)和預(yù)處理先進(jìn)技術(shù)逐漸被建立，見表1。

表1 白酒中四甲基吡嗪檢測(cè)方法研究進(jìn)展

1.3 四甲基吡嗪生物合成

江南大學(xué)通過對(duì)四甲基吡嗪發(fā)酵過程進(jìn)行跟蹤，揭示了其在微生物體內(nèi)的代謝機(jī)理，證實(shí)了乙偶姻和氨是微生物發(fā)酵產(chǎn)TTMP 的前體物質(zhì)。同時(shí)，對(duì)乙偶姻的生物合成途徑進(jìn)行解析：糖酵解產(chǎn)生丙酮酸，兩分子丙酮酸縮合形成一分子a-乙酰乳酸，在a-乙酰乳酸脫羧酶的作用下a-乙酰乳酸脫羧形成乙偶姻，2,3-丁二醇、2,3-丁二酮等物質(zhì)與乙偶姻進(jìn)行互相轉(zhuǎn)化合成[3]。

2 酒曲中四甲基吡嗪

2.1 酒曲的重要性

中國(guó)白酒與白蘭地、伏特加、朗姆酒、金酒、威士忌并稱世界六大蒸餾酒，白酒與世界多數(shù)蒸餾酒采用的液態(tài)發(fā)酵方式不同，中國(guó)白酒傳承古法釀造技藝，采用固態(tài)發(fā)酵方式，其釀造核心為“酒曲”。“曲乃酒之魂”，中國(guó)白酒中的香味及多種風(fēng)味，多來自于酒曲。酒曲，是以大米、小麥、大麥、豌豆等為原料，在一定溫度、濕度環(huán)境下，經(jīng)培養(yǎng)富集多種微生物而成[19]，在釀酒過程中促進(jìn)酒糟正常發(fā)酵，為發(fā)酵過程提供必要的酶系、功能菌系和風(fēng)味前體物質(zhì)，其質(zhì)量直接影響白酒的風(fēng)味和品質(zhì)。根據(jù)類型可將酒曲分為大曲、小曲、麩曲，不同香型白酒所用的酒曲原料和制作工藝不同，故其四甲基吡嗪等風(fēng)味物質(zhì)的含量不同。

2.2 不同香型酒曲四甲基吡嗪研究

2.2.1 醬香型

醬香型大曲以小麥為原料制成，屬高溫大曲。醬香型高溫大曲在生產(chǎn)過程中，因倉(cāng)內(nèi)溫度、曲坯水分的差異，導(dǎo)致大曲外觀呈現(xiàn)不同顏色，根據(jù)外觀特征一般分為白曲、黃曲和黑曲3種，對(duì)3種顏色的曲塊進(jìn)行微生物結(jié)構(gòu)及代謝產(chǎn)物分析，發(fā)現(xiàn)白曲中高產(chǎn)四甲基吡嗪的芽孢桿菌最多[20]。隨著“醬酒熱”的興起，醬香型高溫大曲的風(fēng)味機(jī)理研究近年來備受研究學(xué)者關(guān)注，從不同廠家所生產(chǎn)的醬香型高溫大曲中分離出高產(chǎn)四甲基吡嗪菌株，篩選分離及四甲基吡嗪產(chǎn)量見表2。

表2 醬香大曲高產(chǎn)四甲基吡嗪菌種分離研究進(jìn)展

不同酒企因生產(chǎn)工藝、環(huán)境微生物圈不同，最終生產(chǎn)的高溫大曲中四甲基吡嗪的含量不同。通過對(duì)高溫大曲中高產(chǎn)四甲基吡嗪的微生物進(jìn)行篩選、分離和產(chǎn)四甲基吡嗪測(cè)定，為醬香風(fēng)味形成機(jī)制解析和強(qiáng)化大曲的應(yīng)用提供了借鑒作用。

2.2.2 濃香型

濃香型大曲主要以小麥為原料，有的配料大麥、豌豆等谷物，在一定的溫度、濕度環(huán)境下，在曲坯上自然接種環(huán)境中的各種微生物制成，屬于中溫和中偏高溫大曲。濃香大曲作為濃香型白酒生產(chǎn)的糖化劑、發(fā)酵劑和生香劑，通過三系（酶系、物系、菌系）作用于糟醅發(fā)酵，最終形成白酒中的復(fù)合香味。

濃香大曲中富含豐富的微生物群系，不同地區(qū)、不同廠家生產(chǎn)出的濃香白酒，因微生物種類、數(shù)量不同，造成了不同品牌濃香型白酒香味風(fēng)格的差異。鐘桂芳等[25]從舍得大曲中分離出10 株產(chǎn)四甲基吡嗪的菌株，通過篩選、分離確定2 株高產(chǎn)四甲基吡嗪菌株A7 和A18，經(jīng)鑒定為甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）和蛋白水解芽孢桿菌（Bacillus proteolyticus），其四甲基吡嗪的含量分別為350.98 mg/L、163.49 mg/L；郭春生等[26]從內(nèi)蒙古某酒廠的濃香高溫大曲中分離篩選出一株高產(chǎn)四甲基吡嗪菌株1-13，經(jīng)鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），測(cè)定其四甲基吡嗪產(chǎn)量為112.26 mg/L。上述兩種濃香大曲分離出的高產(chǎn)四甲基吡嗪菌株表明，不同廠家濃香大曲中的功能菌系不同，可能是造成南北地區(qū)濃香白酒在風(fēng)味物質(zhì)上的差異性所在。

2.2.3 其他香型

在“醬酒熱”和濃香大市場(chǎng)的背景下，關(guān)于兩者大曲中高產(chǎn)四甲基吡嗪功能菌的研究逐漸增多，但是針對(duì)其他香型的研究較少，尤其是兼香型、米香型、豉香型等香型還鮮有報(bào)道，僅在清香型、特香型、芝麻香型等香型白酒中有少量研究。馬美榮等[27]從紅星二鍋頭大曲（清香型）中分離到11 株芽孢桿菌，經(jīng)篩選得到4株高產(chǎn)四甲基吡嗪的芽孢桿菌，四甲基吡嗪產(chǎn)量為12.5～21.39 mg/L；游勇等[28]從四特酒大曲（特香型）中分離篩選出1 株地衣芽孢桿菌（ZRF-1），四甲基吡嗪相對(duì)含量3.45 %；張溫清等[29]從宣酒（芝麻香型）中篩選到1株高產(chǎn)四甲基吡嗪的解淀粉芽孢桿菌（XJB-104），四甲基吡嗪產(chǎn)量達(dá)202.54 mg/kg。

3 中國(guó)白酒中四甲基吡嗪

3.1 釀酒過程四甲基吡嗪研究

現(xiàn)階段對(duì)于中國(guó)白酒中四甲基吡嗪的研究，各香型白酒釀酒過程中四甲基吡嗪功能菌的研究較少，多為在酒曲中分離、篩選的研究。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，戴奕杰等[30]在醬香白酒第七輪次糟醅中進(jìn)行功能菌篩選分離研究，得到1 株產(chǎn)香功能較優(yōu)的菌種，命名為DAI bj-1，經(jīng)鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），該菌種的發(fā)現(xiàn)，使淀粉芽孢桿菌與白酒風(fēng)味物質(zhì)間的聯(lián)系得以建立。

醬香型白酒采用“12987”的傳統(tǒng)釀造工藝，有著“四高兩長(zhǎng)”的工藝特點(diǎn)，“高溫堆積”是醬香白酒區(qū)別于其他香型白酒的特點(diǎn)之一，此過程網(wǎng)羅大量空氣中的微生物于糟醅上，如酵母菌、芽孢桿菌等，這些微生物（主要是酵母菌）在大量繁殖后消亡、自溶，為糟醅增加了動(dòng)物性蛋白源，提供了氨基礎(chǔ)。糖與氨基酸在高溫釀造過程中發(fā)生美拉德反應(yīng)生成四甲基吡嗪，同時(shí)在芽孢桿菌、乳酸菌等微生物作用下，乙偶姻逐漸轉(zhuǎn)化生成四甲基吡嗪，并大量累積在醬香型白酒酒體中[5]，也許這是在醬香型白酒釀酒環(huán)節(jié)中研究四甲基吡嗪功能菌的意義所在。

3.2 四甲基吡嗪菌株強(qiáng)化及在白酒中應(yīng)用

白酒生產(chǎn)過程中，大量釀酒微生物參與其中，主要為細(xì)菌、霉菌和酵母菌，參與糖化、發(fā)酵和生香過程。芽孢桿菌作為細(xì)菌的一科，在四甲基吡嗪的生物合成中具有重要作用。提高四甲基吡嗪的含量主要通過分離出高產(chǎn)菌株應(yīng)用于生產(chǎn)，或?qū)μ囟ň赀M(jìn)行強(qiáng)化。周榆林[31]在65 ℃的溫度下對(duì)目標(biāo)菌株加熱5 h，發(fā)現(xiàn)四甲基吡嗪含量提升了0.13 mg/100 mL；在發(fā)酵過程中，盧君[32]通過菌種強(qiáng)化和工藝優(yōu)化的措施，將基酒中四甲基吡嗪的含量提高160.71 %；陳詩(shī)佳[33]以釀酒酵母AY 為出發(fā)菌株，通過基因改變優(yōu)化培養(yǎng)，應(yīng)用于清香型麩曲白酒的生產(chǎn)中，酒醅中乙偶姻含量提高320.38 %，四甲基吡嗪含量提高74.66%。

除單菌種強(qiáng)化外，還可通過多菌種共同作用提高白酒中四甲基吡嗪含量。韓興林[34]將兩株基礎(chǔ)細(xì)菌和酵母菌進(jìn)行混合培養(yǎng)，酒醅中四甲基吡嗪含量提高4%；吳錢弟[35]發(fā)現(xiàn)先接種酵母菌和根霉曲，再接種芽孢桿菌，四甲基吡嗪含量較純種芽孢桿菌發(fā)酵組提高591.5 μg/g，該試驗(yàn)的成功為多菌株發(fā)酵提高四甲基吡嗪含量奠定了基礎(chǔ)。

提高白酒中四甲基吡嗪含量，除了菌種的強(qiáng)化外，也有研究[36-38]在釀酒生產(chǎn)中直接添加最佳比例的產(chǎn)四甲基吡嗪功能菌菌株或者強(qiáng)化曲于酒醅中，實(shí)現(xiàn)白酒中四甲基吡嗪含量的提高。

4 展望

隨著白酒中健康因子研究方向的不斷前進(jìn)，四甲基吡嗪在白酒中的檢測(cè)、代謝機(jī)理和合成受到了越來越廣泛的關(guān)注，利用芽孢桿菌及其與其它菌株混合制作菌種強(qiáng)化液用于白酒生產(chǎn)，以提高白酒中四甲基吡嗪含量是白酒行業(yè)中廣泛開展和應(yīng)用的生物合成方法。

隨著“健康中國(guó)2030”規(guī)劃綱要的實(shí)施，營(yíng)養(yǎng)、美味和健康成為社會(huì)廣泛關(guān)注的話題。中國(guó)白酒作為中國(guó)人餐桌上常見的消費(fèi)品，對(duì)人體健康的影響受到社會(huì)各界的關(guān)注。四甲基吡嗪作為具有改善微血循環(huán)，抑制幽門螺桿菌代謝物誘發(fā)的炎癥等作用的健康因子，其“量效關(guān)系”，即四甲基吡嗪在白酒中含量很低，攝入量難達(dá)到發(fā)揮功效的劑量的問題還亟待解決。市場(chǎng)上不同區(qū)域[39]、不同品牌白酒中四甲基吡嗪含量仍存在較大差異，如何進(jìn)一步提高中國(guó)白酒中四甲基吡嗪含量和全面解析各香型白酒生產(chǎn)過程中四甲基吡嗪的生成是發(fā)酵行業(yè)需要解決的問題。