佘朋桂,譚小雯,郭紅玲

失代償期肝硬化是進行肝臟移植術的常見病因,而腹腔積液是腹部游離液體的蓄積在腹膜腔內(nèi),是肝臟失代償?shù)囊粋€典型特征,約20%的肝硬化患者伴有腹腔積液,每年1%～4%的肝硬化患者出現(xiàn)腹腔積液[1]。腹腔積液可導致預后不良及高病死率[2],因此,肝硬化腹腔積液的預防與治療是臨床診療的重難點。中醫(yī)學認為,肝硬化腹腔積液屬于“臌脹”范疇,以腹部脹大、脈絡暴露、皮膚蒼黃為主要特征,是“風勞臌膈”四類疑難雜癥之一[3-4]。有研究表明,杠板歸具有緩解肝病病理癥狀的功效,其提取物杠板歸總黃酮(TFP)可通過抑制炎癥應激和細胞凋亡,以改善肝臟損傷[5]。水通道蛋白(AQPs)是近年臨床研究的新熱點,其是主要分布在肝臟內(nèi)調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外水滲透性及轉運的重要蛋白,與細胞水液代謝密切相關。因此,本研究制備了肝硬化腹腔積液大鼠模型,以探討TFP對肝硬化腹腔積液大鼠肝功能及AQPs的影響,以期為臨床治療提供實驗依據(jù),現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源 于2021年12月選取60只SD大鼠(購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,43004700038932),周齡6～8周,體質(zhì)量(220±20)g。隨機選取10只作為空白對照組,另50只采用以四氯化碳—乙醇綜合法制備肝硬化腹腔積液大鼠模型,并隨機將建模大鼠分為模型對照組、陽性對照組及TFP高、中、低劑量組,各10只。

1.2 實驗藥品、試劑及儀器 杠板歸(飲片,湖南三湘中藥飲片有限公司生產(chǎn)),TFP制備方法參照文獻[6];四氯化碳(南京化學試劑股份有限公司生產(chǎn)),白酒(乙醇體積分數(shù)為50%,山西德道酒業(yè)有限責任公司生產(chǎn)),橄欖油(山東玉膳房食品有限公司生產(chǎn)),甘草酸二銨膠囊(正大天晴集團生產(chǎn)),一抗、二抗(上海澤葉生物科技有限公司生產(chǎn)),全自動生化分析儀(深圳市藍韻實業(yè)有限公司),多功能彩色細胞圖像分析管理系統(tǒng)(美國Media Cybernetics生產(chǎn))。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型制備:將大鼠放在飼養(yǎng)箱內(nèi),每個飼養(yǎng)箱3只,飼養(yǎng)溫度為22～24 ℃,相對濕度為40%～60%,每日明暗交替各12 h,常規(guī)飲用水及飼料喂養(yǎng)。適應性喂養(yǎng)1周,隨機選取10只作為空白對照組,標準飲食喂養(yǎng)24周,處死,留取標本。

剩余50只大鼠采用四氯化碳—乙醇法進行肝硬化腹腔積液模型構建:采用40%的四氯化碳—橄欖油溶液灌胃,每次灌胃前測量體質(zhì)量,每4 d一次,首次劑量為0.5 ml/100 g,第2次開始將灌胃液劑量改為0.3 ml/100 g,并以15%乙醇作為大鼠飲料,飼料喂養(yǎng)同空白對照組,連續(xù)喂養(yǎng)10周。若大鼠腹部明顯膨隆、皮下有波動感,經(jīng)腹腔穿刺后發(fā)現(xiàn)有清亮但略顯黃色液體流出,經(jīng)檢測白蛋白(Alb)<34.1 g/L,大鼠血漿膠體滲透壓<17.4 mmHg,即可判斷為造模成功[7]。

1.3.2 治療方法:確定大鼠造模成功后,針對模型對照組大鼠予以0.9%氯化鈉溶液進行灌胃;陽性對照組以0.9%氯化鈉溶液溶解的甘草酸二銨膠囊(含甘草酸二銨0.005 2 g/kg)進行灌胃,1次/d,共14周;TFP低、中、高劑量組大鼠分別予以150、300、600 mg/kg的TFP進行灌胃,1次/d,共14周。治療期間,陽性對照組與TFP低、中、高劑量組大鼠仍以0.3 ml/100 g的40%四氯化碳—橄欖油溶液灌胃至14周實驗結束,處死,留取標本。

1.4 觀察指標與方法 (1)腹腔積液量:處死大鼠后,沿腹中線剪開約為3 cm的創(chuàng)口,用無菌注射器抽取大鼠腹腔液體,記錄并比較各組大鼠腹腔積液量。(2)實驗室相關指標:各組大鼠均禁食12 h以上,稱重,麻醉下腹主動脈取血5 ml至試管中,3 200 r/min離心10 min,取上層血清,置于-40 ℃冷凍箱內(nèi)保存待測;采用全自動生化儀檢測肝功能指標,主要包括天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)和Alb水平;采用放射免疫發(fā)測定肝纖維化指標,主要包括Ⅳ型膠原(Ⅳ-C)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、層粘連蛋白(LN)、透明質(zhì)酸酶(HA)水平。(3)水通道蛋白8(AQP8)水平:處死大鼠,取肝臟組織,取一部分肝臟組織采用免疫組化法[8]檢測肝AQP8,采用細胞圖像分析管理系統(tǒng)分析細胞照片,檢測陽性反應為積分光密度(IOD)值。(4)肝組織變化情況:處死大鼠,取肝臟組織,觀察肝臟形態(tài)特征,取一部分肝臟組織進行HE染色切片,觀察各組大鼠肝組織變化情況。

2 結 果

2.1 腹腔積液量及AQP8 IOD值比較 與空白對照組相比,模型對照組、陽性對照組及TFP低、中、高劑量組腹腔積液量較多,AQP8 IOD值較低(P<0.01);與模型對照組相比,陽性對照組及TFP低、中、高劑量組腹腔積液量較少,陽性對照組、TFP高劑量組AQP8 IOD值較高(P<0.01);與陽性對照組相比,TFP高劑量組腹腔積液量較多,AQP8 IOD值較低(P<0.01),見表1。

表1 6組大鼠腹腔積液量及AQP8 IOD值比較

2.2 肝功能指標比較 與空白對照組相比,模型對照組、陽性對照組及TFP低、中、高劑量組AST、ALT水平較高,Alb水平較低(P<0.01);與模型對照組相比,陽性對照組、TFP高劑量組AST與ALT水平較低,Alb水平較高(P<0.01);與陽性對照組相比,TFP高劑量組AST和ALT水平較高,Alb水平較低(P<0.01),見表2。

表2 6組大鼠肝功能指標比較

2.3 肝纖維指標比較 與空白對照組相比,模型對照組、陽性對照組及TFP低、中、高劑量組Ⅳ-C、PCⅢ、LN、HA水平均較高(P<0.01);與模型對照組比較,陽性對照組、TFP高劑量組上述指標均較低(P<0.01);與TFP高劑量組相比,陽性對照組上述指標均較低(P<0.01),見表3。

表3 6組大鼠肝纖維指標比較

2.4 大鼠肝組織病理學 光鏡下觀察各組大鼠組織病理學結果顯示:空白對照組大鼠可見肝小葉結構清晰、細胞形態(tài)正常、靜脈圍繞中央呈放射狀排列整齊,無炎癥、變性或壞死等病理變化;模型對照組大鼠可見肝小葉明顯破壞,出現(xiàn)變性、出血、炎癥等病理改變,形成典型的假小葉;TFP低劑量大鼠可見肝小葉結構破壞,明顯形成了假小葉,有大量炎性細胞浸潤,出現(xiàn)變性、出血等病理改變;TFP中劑量組大鼠可見肝細胞纖維間隔形成有所減少,假小葉少量形成,炎性細胞浸潤、變性現(xiàn)象基本消失;TFP高劑量組大鼠可見肝纖維組織增生但未見假小葉,肝小葉結構存在輕度破壞,肝細胞輕微腫脹及炎性細胞減少;陽性對照組大鼠可見纖維組織增生但未見假小葉,肝小葉結構破壞更輕,炎性細胞浸潤及腫脹更輕微。

3 討 論

肝硬化腹腔積液是由于肝細胞變性、壞死、再生,促使纖維組織增生和瘢痕收縮,使肝臟質(zhì)地變硬,形成肝硬化,引起門靜脈高壓,肝功能損傷,進而導致腹腔積液形成。腹腔積液是肝硬化較常見的并發(fā)癥之一,提示肝硬化的程度比較嚴重,并可能造成其他并發(fā)癥與急性癥狀的發(fā)生,甚至死亡[9]。研究表明,肝硬化代償期患者10年內(nèi)并發(fā)腹腔積液的概率為50%,合并腹腔積液患者的病死率明顯增高,其中肝硬化腹腔積液患者1年內(nèi)病死率為15%、2年內(nèi)病死率為44%[10]。目前,臨床對于肝硬化腹腔積液的治療,西醫(yī)以利尿為主,并根據(jù)患者的實際病情酌情補充Alb、血漿等,必要時行穿刺放液或腹腔積液超濾濃縮回輸治療。然而當肝硬化患者腹腔積液反復發(fā)作,長期使用利尿劑較易產(chǎn)生耐藥性,形成頑固性腹腔積液,因此尋求更加有效的治療方法成為臨床治療腹腔積液的迫切需求。

中醫(yī)藥是中華民族的瑰寶,根據(jù)診斷對癥下藥可起到標本兼治的效果,且合理的藥物治療,其不良反應較少。在中醫(yī)理論中,肝硬化腹腔積液的成因復雜,主要因患者嗜酒、食肥甘厚味、怒郁傷肝、蟲毒傷及肝脾、日久痞塊積聚或黃疸等可致脾失水運、三焦不暢,導致水停腹中[11]。中醫(yī)對人體內(nèi)水運及代謝早已有描述,認為肺、脾、腎等臟腑與水運及代謝關系密切,其中肺為華蓋、為水之上源,通過肺的宣發(fā)肅降可通調(diào)水道[12]。杠板歸性寒,味酸,歸肺經(jīng)與膀胱經(jīng),具有消腫利尿、清熱解毒等多重功效,可用于治療水腫、痢疾、濕熱黃疸等,是一種具有多重病理作用及較高臨床價值的傳統(tǒng)中草藥材[13]。黃酮類化學物為杠板歸的主要活性成分,具有降低炎性、抗肝纖維化、抗氧化應激反應及細胞凋亡以改善肝損傷的作用[14-15]?；诖?本研究建立肝硬化腹腔積液大鼠模型,以探討杠板歸總黃酮提取物對肝硬化腹腔積液大鼠肝功能及AQPs的影響。

AQPs參與液體運輸、細胞信號和生殖[16],AQP8在肝臟AQPs中呈高表達,可促進氨的攝取及代謝,AQP8水平異常,可減少毛細血管質(zhì)膜的水液轉運,導致肝細胞膜通透性降低[17-18]。AQP8水平下調(diào),會導致肝細胞的轉運能力減低,引起腹腔積液,而TFP能有效改善肝硬化腹腔積液大鼠肝組織細胞AQP8水平。本研究結果顯示,與空白對照組相比,模型對照組、陽性對照組及TFP低、中、高劑量組腹腔積液量較高,AQP8 IOD值較低,且AST、ALT及Ⅳ-C、PCⅢ、LN、HA水平均較高,Alb水平較低,表明建模成功。此外,與模型對照組相比,陽性對照組及TFP低、中、高劑量組腹腔積液量較少,陽性對照組、TFP高劑量組AQP8 IOD值較高,可見TFP能有效改善肝硬化腹腔積液大鼠的腹腔積液癥狀及肝功能,上調(diào)AQP8水平。雖甘草酸二銨與高劑量TFP的療效有差異。可通過合理的中藥配伍組方遣藥,進行下一步研究驗證。

綜上所述,TFP可有效改善肝硬化腹腔積液大鼠的肝功能,減少腹腔積液,上調(diào)AQP8的表達水平,這可能是TFP利水的作用機制,但甘草酸二銨與高劑量TFP的療效差異仍需進一步研究證實。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突。