翟子惠， 蘇儉生

（上海牙組織修復(fù)與再生工程技術(shù)研究中心，同濟(jì)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔修復(fù)科，上海 200072）

齲病是口腔常見的慢性感染性疾病，人們普遍認(rèn)為牙菌斑相關(guān)菌群是該病的始動(dòng)因子[1]。其中，變形鏈球菌（S.mutans）是主要病原菌之一[1]。S.mutans從蔗糖中合成大量葡聚糖和其他胞外聚合物（extracellular polysaccharides, EPS）的能力和將多種碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝為有機(jī)酸的能力使其具有較強(qiáng)的抵抗力。而研究[2]表明，表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）具有在體外抑制S.mutans的活性、產(chǎn)酸及耐酸性的作用，葡聚糖水解酶消化EPS基質(zhì)中的糖基鍵會(huì)改變生物膜的硬度，促使去除成熟生物膜[3]。但二者均受劑量和作用時(shí)間的限制，目前應(yīng)用的收效甚微[4]。

近年來，研究人員利用納米囊泡充當(dāng)載體，負(fù)載抗菌藥物以促進(jìn)抗生素的生物利用度[5]。由苯硼酸與聚乙烯亞胺合成的聚合物納米囊泡在酸性條件下可以達(dá)到觸發(fā)機(jī)制，并具有定點(diǎn)釋放等功能。因此，本研究旨在構(gòu)建包裹EGCG和葡聚糖水解酶形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的納米囊泡，同時(shí)探究其對(duì)S.mutans生長(zhǎng)的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要試劑與儀器 4-（溴甲基）苯硼酸（phenylboronic acid，PBA）、葡聚糖水解酶、EGCG和 D-（+）-葡萄糖（Sigma公司，美國），聚乙烯亞胺（polyethyleneimine，PEI）和三乙胺（阿拉丁公司，中國），噻唑藍(lán)溴化四唑（thiazolyl blue，MTT）試劑盒（生工生物工程公司，中國），二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）試劑（Solarbio公司，中國），腦心浸液肉湯（brain-heart infusion，BHI）培養(yǎng)液（康潤公司，中國）。

磁力攪拌器（Isotemp公司，中國），超微量紫外分光光度計(jì)（Thermo公司，美國），Zetasizer Nano ZS粒度分析儀（Malvern公司，美國）。

1.1.2 菌株與培養(yǎng)條件S.mutans菌株（ATCC25175）于美國模式培養(yǎng)物集存庫（American Type Culture Collection，ATCC）購入。細(xì)菌在 37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。各實(shí)驗(yàn)均設(shè)3個(gè)平行樣本，重復(fù)3次。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 納米囊泡的合成 將摩爾比為90∶1的PBA與PEI溶于二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）中，另加入敷酸劑三乙胺，油浴溫度70 ℃，攪拌24 h。反應(yīng)結(jié)束后，將產(chǎn)物分別在DMSO和去離子水中充分透析，得到PBA-PEI復(fù)合物。將EGCG溶解于去離子水中，與葡聚糖水解酶在室溫下旋轉(zhuǎn)攪拌反應(yīng)2 h，將得到的多酚蛋白復(fù)合物與PBA-PEI按照固定質(zhì)量比[6]進(jìn)行投放，用去離子水稀釋，控制pH值為7.0，以500 r/min的轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)1 h得到淡白色澄清液體，過濾后得到目標(biāo)產(chǎn)物，命名為P1。

1.2.2 納米囊泡粒徑及形貌表征 將10 μL適量濃度的樣本滴于銅網(wǎng)靜置，吸去上層溶液。再取10 μL 2%乙酸雙氧鈾點(diǎn)在銅網(wǎng)，靜置后吸去，在透射電子顯微鏡（TEM）下分析觀察。使用動(dòng)態(tài)光散射儀（dynamic light scattering，DLS）評(píng)估 P1的粒徑分布、Zeta電勢(shì)（Zeta potential）和多分散指數(shù)（polydispersity index，PDI）。

1.2.3 載藥、包封及酶活性研究 取梯度濃度EGCG液體于紫外分光光度計(jì)下測(cè)定紫外吸光度，繪制EGCG濃度-吸光度值標(biāo)準(zhǔn)曲線。取200 μL P1于300 kDa超濾管中超濾。取2 μL超濾后的溶液，加入稀鹽酸至pH值為5，靜置24 h后取2 μL溶液，于紫外分光光度計(jì)下測(cè)定274 nm處的吸光度值，計(jì)算溶液藥物含量，用公式計(jì)算P1的EGCG載藥率（loading content，LC）及釋放率（release rate，RR）。

LC（%）=納米囊泡中裝載的藥物總量/載藥納米囊泡總質(zhì)量×100%

RR（%）=納米囊泡釋放的藥物總量/納米囊泡裝載的藥物總量×100%

取葡萄糖配制成不同標(biāo)準(zhǔn)濃度，另取40 kDa的葡聚糖20 μL（10 mg/mL），加入不同濃度的葡聚糖水解酶反應(yīng)2 h，同時(shí)加入DNS試劑沸水浴煮沸5 min，冷卻后檢測(cè)540 nm處的吸光度值，繪制葡萄糖-吸光度值標(biāo)準(zhǔn)曲線及水解酶-吸光度值標(biāo)準(zhǔn)曲線。取超濾后pH值為5的5 μL溶液加入至20 μL葡聚糖水解酶，同樣方法測(cè)吸光度值，計(jì)算活性酶含量。根據(jù)EGCG與水解酶的摩爾比計(jì)算出酶釋放含量，用公式計(jì)算P1的酶活性（enzyme activity，EA）。

EA（%）=納米囊泡中釋放的有活力酶含量/納米囊泡中釋放的酶總量×100%

1.2.4 最小抑菌濃度和最小殺菌濃度 最小抑菌濃度（MIC）是指完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的藥物濃度。MTT是測(cè)定細(xì)菌活性的有力試劑，利用其可測(cè)定MIC[7]。最小殺菌濃度（MBC）是指能夠完全殺滅細(xì)菌的最小抗菌劑濃度。將1×109cfu/mL的細(xì)菌培養(yǎng)物（10 μL）接種到含有 P1（4～40 μg/mL）的1 mL BHI培養(yǎng)液中；設(shè)立對(duì)照組（control）：未添加P1溶液；設(shè)立空白組（0）：僅有BHI培養(yǎng)液。將培養(yǎng)12、24 h的100 μL溶液離心后重懸于96孔板中，加入MTT（各10 μL），孵育4 h后于酶標(biāo)儀下測(cè)量吸光度值，判定S.mutans的生長(zhǎng)抑制情況。挑選合適組別進(jìn)行菌液連續(xù)稀釋，用平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算S.mutans的 MBC。

1.2.5 pH值的檢測(cè) 將1×109cfu/mL的細(xì)菌培養(yǎng)物（10 μL）接種到含有 P1（4～40 μg/mL）的 1 mL BHI培養(yǎng)液中。在37 ℃下生長(zhǎng)24 h及72 h，搖勻后各吸取10 μL，滴定于pH試紙上，觀察pH值。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 采用Graphpad Prism 9 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，2組間比較使用t檢驗(yàn)，多組間比較使用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 納米囊泡的大小和形態(tài)

TEM結(jié)果顯示，P1為均勻規(guī)則的球形（圖1A）。為了獲得納米囊泡最佳的粒徑和分散度，實(shí)驗(yàn)中考察了原材料不同投料比下形成的P1表征差異，綜合考慮后在分散度最?。?.202）時(shí)，選擇PBA-PEI∶葡聚糖水解酶∶EGCG=30 mg∶28.08 mg∶2.07 mg的投料比，此時(shí)EGCG與葡聚糖水解酶的摩爾比約為10∶1，Zeta電勢(shì)為 34.2 mV（圖 1B），納米囊泡粒徑平均為100.4 nm（圖1C），分散度為0.202。不同投料比下形成的P1表征差異結(jié)果（表1）顯示，在其他條件不變的情況下，隨著EGCG和葡聚糖水解酶含量的增加，分散度先增加后降低然后再增加，而粒徑則逐漸增加。

圖1 P1的納米表征Figure 1 Nano-characterization of P1

表1 不同投藥量對(duì)納米囊泡特征的影響Table 1 Effects of different dosages of P1 on the characteristics of nanovesicles

2.2 包封率、釋放率和釋放前后的酶活力

經(jīng)測(cè)定，2 mL（2 mg/mL）的P1內(nèi)含有102.95 μg的EGCG，LC=74.06%。在pH值為5時(shí)，EGCG的24 h釋放量為38.67 μg，RR=37.56%。此時(shí)根據(jù)比例計(jì)算，酶含量為563.7 μg，而測(cè)得活性酶含量為144 μg，24 h EA=25.54%。

2.3 MIC和MBC分析

通過MTT法測(cè)定合成的P1納米囊泡對(duì)培養(yǎng)24 h和72 h后S.mutans代謝活性的抑制作用。由圖2A所示，培養(yǎng)24 h后，與control組相比，12 μg/mL P1溶液里的S.mutans明顯被抑制（P＜0.001）；32 μg/mL 時(shí)的吸光度值與空白組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。圖2B示，培養(yǎng) 72 h后，12～20 μg/mL P1溶液里的S.mutans仍有活力，能繼續(xù)生長(zhǎng)，24 μg/mL時(shí)的吸光度值開始與 control組有差異（P＜0.01），而32 μg/mL時(shí)仍能保持與空白組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。該結(jié)果說明，納米囊泡P1溶液濃度達(dá)到24 μg/mL時(shí)，其對(duì)S.mutans的增殖有一定的抑制作用，視為 MIC=24 μg/mL。

圖2 MTT法測(cè)定不同濃度P1溶液的吸光度值Figure 2 The MTT method determined the absorbance value of different concentrations of P1 solution

經(jīng)MTT法分析，選取4組進(jìn)行平板涂布，分別為 12、24、32 μg/mL 的 P1 溶液組和 control組，如圖 3所示。當(dāng)P1濃度為32 μg/mL時(shí)，平板無S.mutans，視為 MBC=32 μg/mL。

圖3 不同濃度P1溶液中平板菌落分布Figure 3 Plate colony distribution of different concentrations of P1 solution

2.4 共培養(yǎng)導(dǎo)致的pH值的變化

在24 h和72 h的培養(yǎng)時(shí)間下，不同濃度的P1溶液會(huì)導(dǎo)致S.mutans的培養(yǎng)環(huán)境差異很大。如圖4所示，control組pH值保持在5.0～6.0，為酸性環(huán)境，表明S.mutans可以產(chǎn)酸并且耐酸。而P1溶液濃度超過 28 μg/mL（24 h）和 8 μg/mL（72 h）時(shí)，pH 值為7.0，轉(zhuǎn)為中性溶液，說明在此環(huán)境下，S.mutans失去產(chǎn)酸能力。

圖4 培養(yǎng)液在0～32 μg/mL P1濃度下pH值的變化Figure 4 Changes of pH value of the medium at concentrations of 0-32 μg/mL P1

3 討論

S.mutans是齲病的主要致病菌之一。S.mutans產(chǎn)生和分泌大量的乳酸，酸性環(huán)境下牙本質(zhì)脫礦，最終使得齲病發(fā)生和發(fā)展[1]。S.mutans形成生物膜的能力很重要，特別是水不溶性葡聚糖，介導(dǎo)的黏附S.mutans和其他口腔細(xì)菌定殖于牙齒表面，進(jìn)而形成牙齒表面生物膜[1，8]。所以，想要通過抗菌藥物來抑制S.mutans的活性，需要具有瓦解葡聚糖的能力。長(zhǎng)期使用抗生素可能會(huì)導(dǎo)致多重耐藥菌株的出現(xiàn)，而新型抗生素的開發(fā)進(jìn)展緩慢[9-10]。因此，尋找替代的方法變得至關(guān)重要。

近年來，納米囊泡逐漸被運(yùn)用于抑制或殺滅細(xì)菌。它因高表面積/體積比的特性，可以充當(dāng)抗菌劑或負(fù)載抗菌藥物的載體，以促進(jìn)抗生素的生物利用度和有效性。在特定條件下納米囊泡機(jī)制被觸發(fā)，釋放抗菌藥物，達(dá)到靶向治療、定點(diǎn)釋放的功能[11-13]。葡聚糖水解酶蛋白質(zhì)表面的鄰苯二酚基團(tuán)可以和修飾了苯硼酸的陽離子高分子載體結(jié)合，通過形成動(dòng)態(tài)化學(xué)鍵形成納米囊泡（P1），化學(xué)鍵在酸性條件下斷裂，將內(nèi)容物釋放出來作用于靶向細(xì)胞并保持蛋白質(zhì)的活性[6]。本實(shí)驗(yàn)通過篩選合成了最優(yōu)投料比的納米囊泡復(fù)合物（P1），通過TEM可以看出納米囊泡呈規(guī)則球形囊泡，包裹著EGCG和水解酶復(fù)合物。DLS測(cè)量的粒徑均值為100.4 nm，此時(shí)的粒徑比S.mutans的生物膜孔隙小得多，因此具有良好的穿透效果[14]。Zeta電勢(shì)可以用來表示聚合物的分散穩(wěn)定性[15-16]。本研究的Zeta電勢(shì)結(jié)果證明，實(shí)驗(yàn)合成的納米囊泡P1電勢(shì)穩(wěn)定、不易解離。此外，帶正電荷的P1在生物膜內(nèi)積累，可以與釋放的藥物一起殺死更多的細(xì)菌[17]。P1材料包封率可達(dá)74.06%，具有良好的包封效果。當(dāng)pH值調(diào)節(jié)至5后，24 h內(nèi)P1內(nèi)負(fù)載的藥物僅緩慢釋放了37.56%，這表明合成的納米囊泡中仍保留較多的藥物復(fù)合物[18]。

S.mutans能產(chǎn)生大量乳酸，致使局部環(huán)境的pH值降低。P1穩(wěn)定的化學(xué)鍵可在低pH值環(huán)境下斷裂，將內(nèi)容物釋放。體外實(shí)驗(yàn)中，P1在濃度為24 μg/mL時(shí)即有顯著的抗菌作用；持續(xù)72 h后，P1在32 μg/mL濃度時(shí)，仍對(duì)S.mutans的活性有抑制作用，說明P1在低pH值條件下，其有效釋放時(shí)間超過72 h。EGCG的抗菌機(jī)制為對(duì)微生物細(xì)胞質(zhì)膜的不可逆破壞，同時(shí)破壞了整個(gè)細(xì)胞膜的pH值[19]，進(jìn)而可能觸發(fā)了細(xì)胞的一系列生理效應(yīng)。S.mutansEPS基質(zhì)中，在葡糖基轉(zhuǎn)移酶（glucosyltransferase，GTF）作用下生成的葡聚糖是其重要的支架機(jī)構(gòu)。葡聚糖水解酶的作用大大改變了生物膜的硬度，極大地促進(jìn)了成熟生物膜的去除[20]。同時(shí)，葡聚糖水解酶致使S.mutans局部環(huán)境pH值的升高，加大了S.mutans的存活難度，也防止其他后繼細(xì)菌的定殖和形成復(fù)雜的生物膜。EGCG與葡聚糖水解酶的同時(shí)應(yīng)用既能夠抑制細(xì)菌活性，又能解決單獨(dú)使用天然抗菌藥物水解酶低吸收、活性不穩(wěn)定的問題。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了一種同時(shí)包裹EGCG和葡聚糖水解酶復(fù)合物的納米囊泡，其能形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。在細(xì)菌生物膜微環(huán)境pH值降低時(shí)，納米囊泡內(nèi)負(fù)載的酶和藥物被緩慢釋放，產(chǎn)生的抗菌作用能改變局部環(huán)境的pH值，達(dá)到更好的抑菌作用。本研究所用的納米囊泡可用于漱口液、牙膏和其他口腔衛(wèi)生產(chǎn)品中。在后續(xù)研究中，可尋找抗唾液沖刷作用的載體，搭載本研究的納米囊泡，進(jìn)行下一步實(shí)際運(yùn)用的研究。