賈國棟， 汪 軼， 徐 震

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔綜合科，上海交通大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，國家口腔醫(yī)學(xué)中心，國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，上海市口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市口腔醫(yī)學(xué)研究所，上海 200011）

口腔癌是全球第九種常見的癌癥，組織學(xué)上，90%的口腔癌起源于鱗狀細(xì)胞[1]。盡管現(xiàn)階段口腔鱗狀細(xì)胞癌（OSCC）的診斷和治療技術(shù)有了很大的進(jìn)展[2]，但OSCC的死亡率仍較高，總體預(yù)后較差，生存率約為55%～65%[3]。近年來，罹患口腔癌的患者日趨年輕化，早期診斷是降低口腔癌死亡率的關(guān)鍵，以利于提高總體生存率和預(yù)后[2]。因此，闡明OSCC的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)機(jī)制，提高患者生存率是重要的研究方向。本研究采用免疫組織化學(xué)鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)（SP）法檢測酪氨酸蛋白激酶7（PTK7）在OSCC組織中的表達(dá)，探討PTK7的表達(dá)水平與OSCC分化程度、生存率等臨床相關(guān)因素的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 標(biāo)本

本研究中的113例OSCC組織樣本來自2006年1月—2008年12月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院的住院患者，所有樣本均有完整的病史，均經(jīng)病理檢查確診為OSCC（圖1），由2位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理學(xué)專家進(jìn)行閱片。同時(shí)，行全身檢查無其他惡性腫瘤，并且排除患者有局部手術(shù)、放療和化療史。本研究獲得上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院倫理道德委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：2018-86-T77），所有程序均按照上海交通大學(xué)批準(zhǔn)的指導(dǎo)方針執(zhí)行，參與本研究的所有患者均提供書面知情同意書。

圖1 OSCC組織HE染色圖Figure 1 HE staining of OSCC tissues

1.2 方法

1.2.1 樣本處理 首先將組織樣本切片置入恒溫箱（60 ℃）中進(jìn)行烘烤，時(shí)長60 min；然后將其置于二甲苯中進(jìn)行脫蠟，取出樣本后進(jìn)行水化，滴加3%過氧化氫溶液于組織樣本上（目的為阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性）。

1.2.2 抗原修復(fù) 一抗孵育：組織切片樣本上滴加兔多克隆PTK7抗體（Proteintech公司 ， 美國；工作濃度為1∶300），4 ℃下孵育過夜；二抗孵育：組織樣本滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（碧云天公司，中國；工作濃度為1∶50），室溫孵育60 min；DAB顯色：顯微鏡下觀察組織樣本出現(xiàn)棕色或棕黃色顆粒，清水浸泡，以終止反應(yīng)；使用蘇木精復(fù)染，清水浸泡10 min返藍(lán)；將組織切片樣本（按照脫蠟的逆向順序）進(jìn)行逐級(jí)乙醇脫水干燥，用二甲苯對(duì)組織進(jìn)行透明、封片。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 PTK7染色結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞膜出現(xiàn)黃色或棕黃色的細(xì)小顆粒為陽性，胞質(zhì)表達(dá)而胞膜不表達(dá)為陰性，根據(jù)陽性細(xì)胞所占的比例判斷。染色強(qiáng)度：無色0分，黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分； 陽性細(xì)胞率1%～10% 為1分，11%～50%為2分，51%～80%為3分，81%以上為4分。染色程度：基本不染色為0分；淡黃色為1分；黃色為2分，棕黃色為3分。將染色強(qiáng)度評(píng)分與染色程度評(píng)分相乘的積作為綜合評(píng)分，＞4分為陽性表達(dá)，≤4分為陰性表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有測量數(shù)據(jù)均采用 SPSS20.0軟件進(jìn)行分析。PTK7與OSCC病理因素的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)及非參數(shù)檢驗(yàn)分析。PTK7蛋白表達(dá)水平的高低和與臨床組織樣本預(yù)后的關(guān)系采用 Kaplan-Meier法及Long-Rank檢驗(yàn)，Cox回歸模型多因素分析PTK7蛋白表達(dá)與各種臨床病理參數(shù)的關(guān)系，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OSCC及正常組織中PTK7蛋白的表達(dá)

113例OSCC組織中有70例（61.9%）PTK7蛋白表達(dá)陽性，65例癌旁正常組織均無PTK7蛋白的表達(dá)。在OSSC組織中，PTK7蛋白陽性表達(dá)與陰性表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

表1 PTK7 蛋白在OSCC及正常組織中的表達(dá)（n）Table 1 Relationship between PTK7 expression in OSCC and normal tissue (n)

2.2 PTK7在OSCC中的表達(dá)及其與臨床病理特征的相關(guān)性

在OSCC組織中，PTK7的染色強(qiáng)度相比正常組織明顯增強(qiáng)，PTK7染色主要位于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜中（圖2）。PTK7蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系如表2所示，經(jīng)卡方檢驗(yàn)， PTK7蛋白的表達(dá)與OSCC的臨床病理參數(shù)（年齡、性別、分化程度、臨床分期、腫瘤大小、局部浸潤范圍及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）相比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P≥0.05，表2）。

表2 OSCC中PTK7蛋白的表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系Table 2 Relationship between the expression of PTK7 and the clinicopathologic features of OSCC specimens

2.3 OSCC組織中PTK7蛋白表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

Cox回歸模型分析結(jié)果顯示，113例OSCC樣本中，PTK7陽性表達(dá)組為70例，陰性表達(dá)組為43 例，2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表3）。Kaplan-Meier法分析結(jié)果顯示， PTK7陰性組總生存率顯著高于陽性組（P＜0.05，圖 3）。

圖3 Kaplan-Meier法分析PTK7蛋白表達(dá)對(duì)OSCC患者預(yù)后的影響Figure 3 Kaplan-Meier survival analysis of PTK7 protein expression on the prognosis of patients with OSCC

表3 OSCC患者生存相關(guān)因素的Cox回歸模型分析Table 3 Cox regression analysis of factors associated with survival in OSCC patients

3 討論

本研究通過PTK7在OSCC組織中的表達(dá)及其與OSCC發(fā)展、預(yù)后的關(guān)系，分析PTK7在OSCC中的作用，結(jié)果提示，PTK7高表達(dá)表示OSCC患者有更差的預(yù)后。OSCC的發(fā)展是一個(gè)多因素、分階段的復(fù)雜過程，伴隨多種功能基因參與，選擇性頸淋巴結(jié)清掃術(shù)能提高早期OSCC患者的生存率[4]。因此，闡明OSCC的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)機(jī)制是提高患者生存率的重要研究方向。有學(xué)者[5]以O(shè)SCC臨床樣本組織作為研究模型，采用膜蛋白質(zhì)譜技術(shù)鑒定腫瘤干細(xì)胞表面蛋白分子與其生物學(xué)特性的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，多種細(xì)胞黏附相關(guān)分子在腫瘤干細(xì)胞表面異常表達(dá)，其中PTK7的表達(dá)水平與腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)行為密切相關(guān)。在許多人惡性腫瘤組織中，PTK7呈現(xiàn)高表達(dá)，其中包括食管鱗癌、甲狀腺癌、乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌、胃癌、肝癌及急性髓細(xì)胞白血病[6-10]。本研究中，113例OSCC組織中有70例PTK7蛋白表達(dá)陽性，陽性表達(dá)率為61.9%，OSCC癌旁非典型增生及正常鱗狀上皮中，PTK7蛋白表達(dá)均為陰性，這說明PTK7的表達(dá)與OSCC有明顯的相關(guān)性。本研究分析表明，PTK7的蛋白表達(dá)與OSCC臨床相關(guān)影響因素均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P≥0.05，表 1）； Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，PTK7陰性組總生存率顯著高于陽性組，在多因素分析中，PTK7 的表達(dá)增加與OSCC患者的總生存期呈負(fù)相關(guān)，說明PTK7在OSCC的發(fā)生、發(fā)展中可能起到輔助或促進(jìn)作用，從而縮短了患者的生存時(shí)間，提示其可以預(yù)測OSCC的預(yù)后。

研究[11-12]表明，一種抗體藥物靶向PTK7的偶聯(lián)物可有效治療乳腺癌、卵巢癌和非小細(xì)胞肺癌。PTK7在頭頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系微球細(xì)胞中的表達(dá)高于其在黏附細(xì)胞中，提示PTK7可作為頭頸腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志物[13]。已有研究[14]表明， PTK7在食管鱗狀細(xì)胞癌組織和腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞中顯著上調(diào)。干細(xì)胞樣細(xì)胞功能的研究[14]表明，抑制PTK7表達(dá)減少了干細(xì)胞樣細(xì)胞微球的形成，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡，并抑制了它們的遷移和侵襲能力。PTK7通過調(diào)節(jié)p53增強(qiáng)了食管鱗狀細(xì)胞癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的遷移和侵襲能力。因此，這項(xiàng)研究[15]表明， PTK7 是食管鱗狀細(xì)胞癌治療的潛在靶點(diǎn)。使用PTK7抑制劑會(huì)增加頭頸鱗狀細(xì)胞癌對(duì)厄洛替尼的敏感性，由此提示，PTK7與頭頸鱗狀細(xì)胞癌化療效果及預(yù)后有關(guān)聯(lián)[16]。本研究表明，PTK7 的表達(dá)增加與OSCC患者的總生存期呈負(fù)相關(guān)。據(jù)報(bào)道[17]，PTK7與Wnt信號(hào)通路相關(guān)，通過經(jīng)典的 Wnt/β連環(huán)蛋白通路、Wnt/Ca2+通路、平面細(xì)胞極性通路活化Wnt信號(hào)通路，PTK7在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。PTK7調(diào)節(jié)功能大多與Wnt/β連環(huán)蛋白通路相關(guān)聯(lián)，無論 PTK7 是作為啟動(dòng)子還是抑制劑，其在經(jīng)典的 Wnt/β-Catenin 通路中的作用仍然存在爭議[15，17]。

綜上所述，本研究顯示，PTK7的高表達(dá)提示患者預(yù)后不良，PTK7可作為OSCC的預(yù)后指標(biāo)，有繼續(xù)深入研究的價(jià)值。