康獻(xiàn)剛， 牛軍強(qiáng)， 趙冬霞， 霍 霽

（1.邢臺(tái)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第二附屬醫(yī)院骨一科， 河北 邢臺(tái) 054000；2.邢臺(tái)市第一醫(yī)院骨科,河北 邢臺(tái) 054001；3.邢臺(tái)市第一醫(yī)院超聲室， 河北 邢臺(tái) 054001）

目前由外傷或者其他因素導(dǎo)致的骨缺損或骨折是臨床實(shí)踐中經(jīng)常遇到的骨損傷類型，盡管人體本身具有潛在的骨損傷修復(fù)能力，但受損嚴(yán)重的骨缺損很難被完全修復(fù)。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，自體骨移植生物材料由于具有生物相容性好、免疫排斥少、起效作用快等特點(diǎn)，近年來常被用于骨損傷修復(fù)。但該類材料也存在數(shù)量有限、容易發(fā)生早期吸收等問題[1]。因此，骨移植技術(shù)及引導(dǎo)骨再生技術(shù)成為了骨缺損修復(fù)的新途徑。近些年，利用骨生長(zhǎng)因子促進(jìn)骨愈合的方法越來越受到人們的關(guān)注。重組人源腫瘤壞死因子受體融合蛋白（rhTNFR:Fc）是競(jìng)爭(zhēng)性腫瘤壞死因子-α（TNF-α）抑制劑，既往研究[2]提示TNF-α能誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡，單次或者多次局部使用rhTNFR:FC均能有效緩解大鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎，但是該治療對(duì)下頜骨缺損大鼠骨修復(fù)的影響尚不清楚。因此，本研究將進(jìn)一步探討局部注射rhTNFR:FC對(duì)下頜骨缺損大鼠骨修復(fù)的影響。Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子（JAK-STAT）通路屬于機(jī)體內(nèi)一類至關(guān)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路家族，它的激活或抑制與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞損傷、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等密切相關(guān)[2]。已有研究[3]表明，JAK-STAT通路可以調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和骨組織再生，促進(jìn)血管生成。本實(shí)驗(yàn)利用rhTNFR:Fc治療大鼠下頜骨缺損模型，通過組織形態(tài)定量分析和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)探討該干預(yù)療法發(fā)揮作用的潛在機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、所用試劑和儀器

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為7～8周齡SPF級(jí)的健康SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量為200～220 g（中國科學(xué)院動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，中國）；rhTNFR:Fc（三生國健藥業(yè)有限公司，中國）；Bio-Oss骨和Bio-Gide可吸收雙層生物膠原膜（歐司海斯公司，美國）；抗Bcl-2抗體、抗Bax抗體、抗JAK2抗體、抗STAT3抗體、抗βactin抗體（Abcam公司，美國）；Western blotting電泳儀（Bio-Rad公司，美國）；高頻鉬靶X射線機(jī)（Planmed Sophie公司，芬蘭）；醫(yī)用凈化工作臺(tái)（蘇州金燕凈化設(shè)備有限公司，中國）；Image-Pro Plus（IPP）圖像處理分析軟件（Media Cybernetics公司，美國）。

1.2 模型制備、分組及給藥

選取SD大鼠70只，飼養(yǎng)1周，將大鼠隨機(jī)分為3組，空白組10只，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各30只。制備大鼠頜骨缺損模型[4]。首先對(duì)大鼠進(jìn)行常規(guī)麻醉（腹腔注射10%水合氯醛），將大鼠固定于試驗(yàn)臺(tái)，常規(guī)消毒。然后對(duì)大鼠的下頜骨進(jìn)行解剖處理，使用牙科電鉆切割大鼠下頜角骨板，形成一個(gè)直徑約4 mm的缺損區(qū)域。實(shí)驗(yàn)組：于大鼠下頜骨缺損處注入25 μL含rhTNFR:Fc的Bio-Oss骨顆粒，其上覆蓋Bio-Gide膠原膜；對(duì)照組：于大鼠下頜骨缺損處注入含25 μL 0.9%氯化鈉溶液的Bio-Oss骨顆粒，同樣覆蓋Bio-Gide膠原膜；最后再依次將切開的組織進(jìn)行縫合，其后保證大鼠正常飲食，縫合處任其自然脫落。用健康的SD大鼠作為空白組。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死及取材

術(shù)后定期觀察大鼠生活狀態(tài)，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)定，分別于術(shù)后3、6、9周時(shí)在3%戊巴比妥鈉（2 μL/g）作用下對(duì)大鼠行腹腔注射麻醉，將對(duì)照組（n=10）和實(shí)驗(yàn)組（n=10）的實(shí)驗(yàn)大鼠處死，然后分離獲得下頜骨，以用于計(jì)算下頜骨缺損面積。

1.4 鉬靶軟X線掃描檢查

各組下頜骨標(biāo)本拍攝軟X射線片（電壓28 kV，電流28 mA，曝光時(shí)間0.3 s），觀察并記錄。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）測(cè)定大鼠下頜骨組織中IL-6和TNF-α濃度

按照試劑盒說明書操作，利用ELISA檢測(cè)凍存的下頜骨組織中IL-6及TNF-α濃度水平。

1.6 大鼠組織Bcl-2、Bax及p-JAK2、p-STAT3蛋白水平的檢測(cè)

通過Western blotting檢測(cè)大鼠組織中Bcl-2、Bax、p-JAK2、p-STAT3 蛋 白 的 表 達(dá) 水 平。 用 等量的蛋白質(zhì)加樣，然后通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis， PAGE）將不同分子量大小的蛋白分開，并將分離開的蛋白轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，轉(zhuǎn)膜完成后用5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin， BSA）封閉蛋白，完成封閉后加入最佳稀釋濃度的一抗（按1∶1 000稀釋），將樣本置于4 ℃搖床上孵育過夜。用TBST緩沖液洗膜2次，然后加相對(duì)應(yīng)二抗進(jìn)行孵育，用TBST緩沖液再洗膜2次。最后使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）顯色液進(jìn)行顯色發(fā)光，將樣本置入曝光機(jī)器中觀察，記錄結(jié)果并導(dǎo)出所有圖像結(jié)果用于后續(xù)分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用IPP圖像處理軟件分析X射線圖片，并計(jì)算不同組別下頜骨的骨缺損面積值。利用R語言軟件包對(duì)不同組間骨缺損面積數(shù)據(jù)作組間方差分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用單因素方差分析比較多個(gè)組間的差異，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜆?gòu)建成功 手術(shù)及后期實(shí)驗(yàn)順利，大鼠缺損符合預(yù)定要求，術(shù)后大鼠行為正常。按照實(shí)驗(yàn)設(shè)定時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取材和收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2.1.2 鉬靶軟X射線機(jī)測(cè)量結(jié)果 用IPP軟件進(jìn)行測(cè)量，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組下頜骨缺損面積顯著小于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）。實(shí)驗(yàn)組在術(shù)后3周時(shí)，大鼠植骨區(qū)已出現(xiàn)新生骨板，并長(zhǎng)出了新的成骨細(xì)胞和毛細(xì)血管；術(shù)后6周時(shí)，新生骨板數(shù)量已明顯增多，而且出現(xiàn)骨互相連接現(xiàn)象（圖1）。

表1 不同組別大鼠的下頜骨缺損面積（mm2， ）Table 1 The mandibular defect area in different groups of rats（mm2， ）

表1 不同組別大鼠的下頜骨缺損面積（mm2， ）Table 1 The mandibular defect area in different groups of rats（mm2， ）

—表示未測(cè)量；①表示P＜0.05，與對(duì)照組比較。

測(cè)量時(shí)間空白組（n=10）對(duì)照組（n=10）實(shí)驗(yàn)組(n=10) t值 P值3周 — 62.25±2.36 55.54±1.83① 7.154 0.020 6周 — 52.91±3.26 40.43±2.56① 8.258 0.013 9周 — 46.74±4.02 35.52±3.71① 12.789 0.009

圖1 下頜骨缺損的CT圖像Figure 1 CT images of mandibular defects

2.2 各組大鼠組織中IL-6、TNF-α濃度的測(cè)定

治療9周后，檢測(cè)各組大鼠IL-6和TNF-α的濃度。與空白組比較，對(duì)照組IL-6和TNF-α的濃度顯著上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組IL-6和TNF-α的濃度明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表2。

表2 不同組別大鼠組織中IL-6和TNF-α濃度的比較（）Table 2 Comparison of IL-6 and TNF-α levels in different groups of rat tissues（）

表2 不同組別大鼠組織中IL-6和TNF-α濃度的比較（）Table 2 Comparison of IL-6 and TNF-α levels in different groups of rat tissues（）

①表示P＜0.05，與空白組比較；②表示P＜0.05，與對(duì)照組比較。

組別 空白組（n=10）對(duì)照組（n=30）實(shí)驗(yàn)組(n=30) F值 P值IL-6 /(pg·mg-1) 58.46±3.39153.30±10.17① 93.78±4.06② 17.7860.003 TNF-α/(pg·mg-1)52.44±2.78155.43±10.64① 112.69±5.37② 7.5940.016

2.3 各組大鼠組織中Bcl-2、Bax、p-JAK2及p-STAT3蛋白水平的檢測(cè)

相比空白組，對(duì)照組中Bax蛋白表達(dá)明顯上升，同時(shí)Bcl-2蛋白表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組Bax蛋白表達(dá)相比對(duì)照組明顯下降，而Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。相比空白組，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；相比對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組的p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見圖 2。

圖2 各組大鼠組織Bcl-2、Bax、p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)情況Figure 2 The protein expression of Bcl-2, Bax, p-JAK2 and p-STAT3 in three groups

3 討論

外傷、感染和腫瘤等各種因素導(dǎo)致的骨缺損是臨床上的常見疾病，而通過骨生長(zhǎng)因子以骨誘導(dǎo)的方式促進(jìn)骨愈合的方法越來越受到人們的關(guān)注[5]。研究報(bào)道，注射用rhTNFR:Fc主要用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[6]、銀屑病[7]和強(qiáng)直性脊柱炎[8]。TNF-α阻斷劑通過中和TNF-α表達(dá)發(fā)揮抗炎作用[9]，從而緩解多種炎癥性疾病，并顯著改善預(yù)后[10]。此外，在FcγRIIB-/-小鼠中，血清 TNF-α 水平升高，TNF-α阻斷劑改善了該模型的下頜骨損傷[11]。TNF-α阻斷劑是預(yù)防包括自身免疫性疾病相關(guān)下頜骨丟失的一種非常有前景的方法[12]。此外，局部注射減少了全身對(duì)TNF-α阻斷劑的吸收，也一定程度上降低了不良反應(yīng)的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[13]。目前，利用rhTNFR:Fc行局部注射的方法對(duì)大鼠下頜骨缺損修復(fù)的研究機(jī)制尚不清楚。本研究通過定量下頜骨缺損面積來評(píng)估SD大鼠缺損恢復(fù)情況，同時(shí)闡明rhTNFR:Fc給藥對(duì)下頜骨及軟骨組織炎癥及其調(diào)控信號(hào)通路的影響，最終發(fā)現(xiàn)局部注射rhTNFR:Fc能夠有效修復(fù)下頜骨的缺損，并降低組織部位炎癥因子IL-6、TNF-α的濃度。

本實(shí)驗(yàn)在給大鼠下頜骨缺損處注入內(nèi)源性骨顆粒的同時(shí)，加入外源性rhTNFR:Fc，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組在注入3周時(shí)，大鼠植骨區(qū)已出現(xiàn)新生骨板，并長(zhǎng)出新的成骨細(xì)胞和毛細(xì)血管；術(shù)后6周時(shí)，新生骨板數(shù)量已明顯增多，而且出現(xiàn)骨互相連接現(xiàn)象；9周時(shí)，骨顆粒附近已出現(xiàn)大量新生骨板，并已漸近成熟。然而對(duì)照組在手術(shù)后6周時(shí)偶見少量骨板，直到術(shù)后9周時(shí)，骨板才逐漸增多，意味著相互連接才剛剛出現(xiàn)，明顯滯后于實(shí)驗(yàn)組的修復(fù)。這個(gè)現(xiàn)象說明rhTNFR:Fc提高了下頜骨缺損后骨愈合的速度。已有研究[14-15]表明，JAK-STAT信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的功能和骨組織再生，促進(jìn)血管生成，同時(shí)在成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的增殖、分化和遷移中發(fā)揮重要作用。JAK-STAT信號(hào)通路介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)負(fù)責(zé)50多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和激素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并受到多個(gè)水平的調(diào)控[3]。一些細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和激素已被證明能通過JAK和/或STAT蛋白調(diào)節(jié)骨穩(wěn)態(tài)[16]。骨細(xì)胞和骨重塑過程經(jīng)常受到許多細(xì)胞因子的影響，這些細(xì)胞因子是骨形成和骨吸收的強(qiáng)刺激因子[17]。新的證據(jù)[3，18-19]表明，JAK-STAT 信號(hào)通路在骨發(fā)育、骨代謝和骨愈合中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組比較，對(duì)照組中Bax、p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)水平顯著上升，而Bcl-2蛋白的表達(dá)顯著下降，說明JAK2-STAT3信號(hào)通路與下頜骨缺損存在顯著正相關(guān)。更為重要的是，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組Bax蛋白的表達(dá)出現(xiàn)明顯下降，炎癥因子IL-6及TNF-α濃度顯著降低，而Bcl-2表達(dá)顯著上調(diào)，說明實(shí)驗(yàn)組很可能是通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡來修復(fù)下頜骨缺損后的損傷。進(jìn)一步的研究表明，經(jīng)過局部注射rhTNFR:Fc處理的大鼠與對(duì)照組相比，骨組織中p-JAK2和p-STAT3的表達(dá)明顯下降，說明該治療潛在地通過抑制JAK2-STAT3信號(hào)通路來修復(fù)和再生受損骨組織。

綜上所述，本研究通過多次皮下局部注射rhTNFR:Fc干預(yù)大鼠下頜骨缺損模型，發(fā)現(xiàn)該治療對(duì)骨缺損具有一定修復(fù)和促進(jìn)愈合的作用，能夠抑制細(xì)胞發(fā)生凋亡。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該修復(fù)作用是通過抑制JAK2-STAT3信號(hào)來完成的。同時(shí)，本研究只發(fā)現(xiàn)局部注射rhTNFR:Fc能夠修復(fù)受損大鼠下頜骨，促進(jìn)骨的再生，但還缺少進(jìn)一步深入機(jī)制的研究，具體如何作用JAK2-STAT3信號(hào)通路還有待進(jìn)一步深入探究。