周 濤， 王佐林

（上海牙組織修復(fù)與再生工程技術(shù)研究中心，同濟(jì)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔種植科，上海 200072）

Hemicentin1（Hmcn1）基因編碼的同名蛋白是Hemicentin蛋白家族中的一員。Hemicentin家族所編碼的是免疫球蛋白超家族的一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，在幾乎所有的后生動(dòng)物中都具有同源結(jié)構(gòu)[1]。Hmcn1在組織所需的細(xì)胞間的短暫接觸中發(fā)揮重要作用，對于細(xì)胞的組織、遷移、基底膜的侵襲及在細(xì)胞和細(xì)胞間形成穩(wěn)定的接觸方面，其具有重要意義[2]。研究[3]發(fā)現(xiàn)，Hmcn1可以引導(dǎo)成纖維細(xì)胞的分化，并在分化過程中調(diào)節(jié)應(yīng)激纖維的形成，并且可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor，TGF-β）介導(dǎo)的效應(yīng)。且Hmcn1可以介導(dǎo)TGF-β誘導(dǎo)足細(xì)胞細(xì)胞骨架的重排[4]。由于TGF-β在成骨細(xì)胞增殖分化及成骨調(diào)控中發(fā)揮了重要作用[5-8]，且又有研究[9]發(fā)現(xiàn)Hmcn1基因在附著于脫礦骨表面的成骨細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，所以Hmcn1是否對成骨細(xì)胞的生理活動(dòng)發(fā)揮作用則成為疑問。

目前并無文獻(xiàn)報(bào)道Hmcn1對成骨細(xì)胞增殖、遷移及成骨功能影響的相關(guān)研究。本實(shí)驗(yàn)旨在通過體外培養(yǎng)MC3T3-E1小鼠前成骨細(xì)胞系，觀察Hmcn1在成骨誘導(dǎo)后的表達(dá)變化，再通過小干擾RNA（siRNA)敲降技術(shù)觀察敲降Hmcn1對MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化、遷移及增殖能力的影響，并探究Hmcn1對MC3T3-E1細(xì)胞功能影響可能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要材料、試劑和儀器

MC3T3-E1細(xì)胞（武漢普諾賽公司，中國），α-MEM 培養(yǎng)液（Gibico公司，美國），Opti-MEM減血清培養(yǎng)液（Gibico公司，美國），青鏈霉素雙抗（Hyclone公司，美國），血清（BI公司，以色列），胰蛋白酶（Gibico公司，美國），TRIzol 試劑（TaKaRa公司， 日本），結(jié)晶紫染色劑（上海碧云天公司，中國），成骨誘導(dǎo)液（賽業(yè)公司，中國），siRNA質(zhì)粒（北京擎科公司，中國），PCR引物（北京擎科公司，中國），實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）試劑盒（TaKaRa公司，日本），細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8）（同仁公司，日本），堿性磷酸酶（ALP）顯色試劑盒（上海碧云天公司，中國），CO2培養(yǎng)箱（Thermo公司，美國），微量移液器（Thermo公司，美國），冷凍高速離心機(jī)（Dragonlab公司，中國），超微量紫外-可見光分光光度計(jì)（Thermo公司，美國），熒光定量PCR儀（Roche公司，瑞士），熒光顯微鏡（蔡司公司，德國）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MC3T3-E1細(xì)胞的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)及通過RT-qPCR觀察Hmcn1的表達(dá)量 將MC3T3-E1細(xì)胞體外培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度達(dá)90%左右時(shí)，換用成品成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)培養(yǎng)。分別在誘導(dǎo)培養(yǎng)的第0、3、7、14天時(shí)收集細(xì)胞樣品，提取RNA，用RT-qPCR檢測Hmcn1表達(dá)水平的變化。

1.2.2 使用siRNA敲降MC3T3-E1細(xì)胞 采用設(shè)計(jì)合成的siRNA轉(zhuǎn)染MC3T3-E1細(xì)胞，敲降Hmcn1，作為實(shí)驗(yàn)組（敲降組），并同時(shí)構(gòu)建空轉(zhuǎn)的對照組。以2×105個(gè)/cm2的密度將MC3T3-E1細(xì)胞接種于12孔板中，待12孔板內(nèi)的細(xì)胞匯合度達(dá)80%左右時(shí)開始轉(zhuǎn)染。準(zhǔn)備2只1.5 mL的埃彭道夫管（Eppendorf pipette，EP），分別稱為A管和B管，A管加入150 μL Opti-MEM減血清培養(yǎng)液和9 μL 20 μmol/L的siRNA存儲(chǔ)液，B管加入 150 μL Opti-MEM減血清培養(yǎng)液和9 μL Lipo3000轉(zhuǎn)染試劑。然后混勻A管和B管，室溫孵育10 min，形成siRNA/Lipo3000混合液，將以上混合液加入含有細(xì)胞的12孔板中，每孔加入100 mL混合液，緩慢勻速滴加。細(xì)胞在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后通過RT-qPCR法檢測其敲降效率。

1.2.3 檢測敲降后成骨標(biāo)志物表達(dá)量的變化 將MC3T3-E1細(xì)胞接種于12孔板中，按照1.2.2實(shí)驗(yàn)步驟中的轉(zhuǎn)染步驟轉(zhuǎn)染MC3T3-E1細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后每隔3天用成骨誘導(dǎo)液換液，并每隔3天在換液的同時(shí)進(jìn)行1次siRNA的追加轉(zhuǎn)染。分別取轉(zhuǎn)染且成骨誘導(dǎo)后0、3、7、14 d的細(xì)胞樣本，提取總RNA，通過RT-qPCR檢測Hmcn1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）、成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子（OSX）、骨鈣素（OCN）、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子 2（Runx2）、ALP 表達(dá)量的變化。

1.2.4 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測 將處于對數(shù)生長期的MC3T3-E1細(xì)胞用胰蛋白酶消化，制作成細(xì)胞懸液，將其接種至96孔板中，每孔控制細(xì)胞數(shù)為1 000個(gè)左右，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。于37 ℃、5%CO2條件下孵育培養(yǎng)5 d。每孔加入10 μL的CCK-8溶液，輕輕敲擊培養(yǎng)板使其混勻，37 ℃下孵育2 h，分別測量450 nm處每孔的光密度（optical density，OD）值。根據(jù)OD值繪制增殖曲線。

1.2.5 ALP染色 MC3T3-E1細(xì)胞成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后，于第7天將其取出孔板，用4%多聚甲醛溶液固定30 min，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）漂洗3次，用ALP孵育液孵育2～6 h，再次用PBS漂洗，風(fēng)干后觀察染色狀況。

1.2.6 茜素紅S（ARS）染色 MC3T3-E1細(xì)胞成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后，于第21天將其取出孔板，用4%多聚甲醛溶液固定30 min，用PBS漂洗3次，每孔加入ARS孵育液孵育24 h，觀察染色狀況。

1.2.7 劃痕實(shí)驗(yàn) 在12孔板背面用記號(hào)筆和直尺畫均勻橫線，大約每隔0.5 cm畫一道，橫穿過孔，每孔至少穿過2條線。在孔中接種MC3T3-E1細(xì)胞，待細(xì)胞完全長滿孔板后，用200 mL槍頭比著直尺，盡量垂直于背后的橫線劃痕。劃痕后用PBS洗細(xì)胞，換液，繼續(xù)放入37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，在培養(yǎng)后的0、24、48 h 時(shí)取樣，拍照。

1.2.8 Transwell遷移實(shí)驗(yàn) 在6孔或12孔板內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞長滿孔板后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，離心后用無血清培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至5×105個(gè)/mL。取細(xì)胞懸液100 μL加入Transwell小室。于Transwell孔板下室加入600 μL含20%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的培養(yǎng)液。常規(guī)培養(yǎng)24 h后取出Transwell小室，棄去孔中培養(yǎng)液，用PBS洗2遍，用甲醇溶液固定30 min后風(fēng)干Transwell小室。用0.1%結(jié)晶紫試劑染色20 min，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移的細(xì)胞，用PBS洗3遍。顯微鏡下隨機(jī)選5個(gè)視野觀察細(xì)胞，并計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)完成后，用3%醋酸脫色，將結(jié)晶紫完全洗脫下來，取洗脫液，用酶標(biāo)儀測OD值（570 nm），以間接反映細(xì)胞數(shù)目。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hmcn1在MC3T3-E1細(xì)胞成骨誘導(dǎo)后出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)

在對 MC3T3-E1細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo) 0、3、7、14 d時(shí)分別收集細(xì)胞樣品，并進(jìn)行檢測，觀察到Hmcn1基因的表達(dá)水平在成骨誘導(dǎo)后持續(xù)上調(diào)，到第7天時(shí)達(dá)到最高，至第14天時(shí)略有回落（P＜0.05，圖1）。

圖1 RT-qPCR檢測成骨誘導(dǎo)后Hmcn1表達(dá)的變化Figure 1 RT-qPCR analysis of Hmcn1 expression after osteogenic stimulation

2.2 siRNA敲降Hmcn1效率的檢測

分別提取siRNA轉(zhuǎn)染48 h的實(shí)驗(yàn)組和空轉(zhuǎn)的對照組RNA，通過RT-qPCR檢測敲降效率，多次實(shí)驗(yàn)確定其敲降效率為75%左右（P＜0.01，圖2A）。

2.3 Hmcn1敲降后，成骨標(biāo)志物表達(dá)量的變化

用siRNA敲降成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)的MC3T3-E1細(xì)胞，分別在成骨誘導(dǎo)第 0、3、7、14 天時(shí)提取細(xì)胞 RNA。通過RT-qPCR檢測到成骨誘導(dǎo)3 d時(shí)，敲降效率為 75%， ALP、BMP-2、OSX 的表達(dá)量下調(diào)（P＜0.05，圖2B）；成骨誘導(dǎo)7 d時(shí)，敲降效率為81%，觀察到BMP表達(dá)下調(diào)明顯（P＜0.01，圖2C）；成骨誘導(dǎo)14 d時(shí)，敲降效率為75%，觀察到OSX、BMP-2、OCN表達(dá)下調(diào)明顯（P＜0.05，圖 2D）。

圖2 siRNA敲降效率及敲降后成骨標(biāo)志物表達(dá)量的變化Figure 2 siRNA knockdowm efficiency and the expression of osteogenic markers changes after knockdown

2.4 敲降Hmcn1對MC3T3-E1細(xì)胞增殖能力的影響

2.4.1 CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果 CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，敲降組增殖能力有所提升，在實(shí)驗(yàn)第7天時(shí)，2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖3）。

圖3 siRNA敲降后細(xì)胞增殖能力的變化Figure 3 Changes of cell proliferation capacity after siRNA knockdown

2.4.2 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果 通過劃痕實(shí)驗(yàn)觀察敲降Hmcn1對MC3T3-E1細(xì)胞遷移能力的影響。結(jié)果顯示，與對照組相比，敲降組遷移能力顯著下降（P＜0.05，圖 4A、B）。

2.4.3 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果 通過Transwell實(shí)驗(yàn)檢測敲降Hmcn1對MC3T3-E1細(xì)胞遷移能力的影響。結(jié)果顯示，與對照組相比，敲降組遷移能力顯著下降（P＜0.05，圖 4C、D）。

圖4 siRNA敲降對MC3T3-E1細(xì)胞遷移能力的影響Figure 4 Effect of siRNA knockdown on migration of MC3T3-E1 cells

2.5 敲降Hmcn1對MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化的影響

結(jié)果2.3中，敲降Hmcn1后，BMP-2的mRNA表達(dá)水平低于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。誘導(dǎo)至第7天時(shí)， ALP染色結(jié)果（圖5A）顯示，2組細(xì)胞著色均符合MC3T3-E1細(xì)胞的特性，對比發(fā)現(xiàn)，敲降組染色較對照組略淺且著色細(xì)胞較對照組少。誘導(dǎo)至第21天時(shí)，ARS染色結(jié)果（圖5B）顯示，2組均成功觀察到鈣結(jié)節(jié)，說明Hmcn1對MC3T3-E1細(xì)胞成骨向分化有一定影響。

圖5 siRNA敲降對MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化的影響Figure 5 Effect of siRNA knockdown on osteogenesis of MC3T3-E1 cells

3 討論

Hmcn1是Hemicentin家族中的一員，是編碼免疫球蛋白超家族的一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，該蛋白由von Willebrand A結(jié)構(gòu)域、串聯(lián)免疫球蛋白模塊、多個(gè)串聯(lián)的表皮生長因子和一個(gè)蛋白羧基末端模塊組成[1]。Hemicentin家族成員在多種細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞質(zhì)連接中發(fā)揮重要作用。Hmcn1參與了細(xì)胞動(dòng)態(tài)基礎(chǔ)的形成，對細(xì)胞的組織、遷移、基底膜的侵襲及在細(xì)胞和細(xì)胞間形成穩(wěn)定的接觸方面，具有重要意義[2]。

研究[3]發(fā)現(xiàn)，Hmcn1可以引導(dǎo)成纖維細(xì)胞的分化，能在分化過程中調(diào)節(jié)應(yīng)激纖維的形成，并且可以誘導(dǎo)TGF-β介導(dǎo)的效應(yīng)。Hmcn1還可以介導(dǎo)TGF-β誘導(dǎo)足細(xì)胞細(xì)胞骨架的重排[4]。而據(jù)文獻(xiàn)[5-8]報(bào)道，TGF-β對誘導(dǎo)骨組織再生、促進(jìn)成骨分化有顯著影響。另外，Hmcn1基因在附著于脫礦骨表面的成骨細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，考慮其可能作為成骨細(xì)胞附著和遷移的向?qū)?，對成骨?xì)胞的功能具有一定意義[9]。

本研究中，首先在體外對MC3T3-E1細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，觀察到Hmcn1表達(dá)水平在細(xì)胞成骨分化過程中出現(xiàn)明顯上調(diào)。然后，通過siRNA改變Hmcn1在MC3T3-E1細(xì)胞中的表達(dá)水平，從而觀察Hmcn1對MC3T3-E1細(xì)胞增殖、遷移及成骨分化能力的影響。我們選取了BMP-2、OSX、OCN、Runx2、ALP這些已經(jīng)被證實(shí)的重要成骨標(biāo)志物作為檢測標(biāo)志[10]。我們在敲降實(shí)驗(yàn)中觀察到，在成骨分化的第3、7、14 天時(shí)，隨著Hmcn1表達(dá)量的下調(diào)，BMP-2 的表達(dá)量持續(xù)下調(diào)（P＜0.05），而 ALP、OSX、OCN等成骨標(biāo)志物在不同時(shí)間點(diǎn)都有明顯的下調(diào)（P＜0.05）。Lauzon等[11]研究發(fā)現(xiàn)，BMP-2可以通過與PI3K/Akt信號(hào)通路的相互作用，促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的成骨分化。Aquino-Martinez等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，BMP-2可以通過與Smad信號(hào)通路的互相作用對成骨進(jìn)行調(diào)控。此外，Yang等[13]研究發(fā)現(xiàn)，BMP-2可以通過磷酸化應(yīng)激活化蛋白激酶，增強(qiáng)成骨細(xì)胞分化。趙璇等[14]認(rèn)為，OCN的血清含量能反映成骨細(xì)胞的活性。ALP也是重要的成骨標(biāo)志物，其濃度水平對成骨細(xì)胞活性有重要的提示作用[15]。因此，我們認(rèn)為Hmcn1很可能主要是通過BMP-2信號(hào)通路對MC3T3-E1細(xì)胞的多種功能進(jìn)行調(diào)控的。在ALP染色中，Hmcn1敲降組的染色比對照組著色細(xì)胞少。在ARS染色實(shí)驗(yàn)中，2組均成功觀察到鈣結(jié)節(jié)，此時(shí)2組染色無明顯差異。根據(jù)染色結(jié)果，考慮為Hmcn1對MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化的影響。在隨后的CCK8實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到Hmcn1敲降組的細(xì)胞增殖能力有提升，這也與敲降后細(xì)胞成骨分化能力下降互為印證。接下來，我們在細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)中觀察到Hmcn1敲降后，細(xì)胞遷移能力顯著下降。

綜上所述，本研究探討了Hmcn1基因?qū)C3T3-E1細(xì)胞體外成骨分化、遷移及增殖的影響，初步證實(shí)了Hmcn1基因正向調(diào)控MC3T3-E1細(xì)胞的遷移能力，并對MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化能力有一定影響。本研究為Hmcn1基因?qū)Τ晒堑挠绊懱峁┝诵碌囊娊?，而其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步挖掘。