薛彩紅，劉 睿，滕 明

（南寧市中醫(yī)醫(yī)院，廣西 南寧 530001）

復(fù)方紫草解毒軟膏是南寧市中醫(yī)醫(yī)院的特色院內(nèi)制劑，全方由紫草、黃連、大黃、雞血藤、白及、珍珠粉、冰片7味中藥組成[1]。方中紫草清熱涼血，解毒透疹[2]；黃連瀉火解毒[3]；白及消腫生肌[4]；大黃涼血止血，活血祛瘀[5]；雞血藤行血補(bǔ)血[6]；珍珠粉收斂生肌[7]；冰片清熱止痛[8]。全方共奏活血解毒、去腐生肌的功效，對(duì)臨床上常見的瘡瘍流膿、創(chuàng)面難愈、新肌難生具有良好的治療作用，在我院皮膚科和外科得到了較為廣泛的應(yīng)用。紫草清熱涼血，解毒透疹[9]，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有抗炎作用[10]。紫草的有效成分紫草素可通過抑制人體炎癥反應(yīng)、促進(jìn)細(xì)胞增殖及抑制瘢痕的形成，從而對(duì)皮膚創(chuàng)傷愈合有明顯的療效[11]。紫草體外對(duì)金黃色葡萄球菌、流感病毒、單純皰疹病毒、多種真菌均有抑制作用[12]。紫草素是從紫草根部提取的一種蒽醌衍生物[9，13]，適用于濕疹、水火燙傷等[14-16]。紫草油已被2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》一部收載，臨床上用于治療燒傷、燙傷等。

為了有效控制復(fù)方紫草解毒軟膏的質(zhì)量，本課題組采用薄層色譜（TLC）法對(duì)復(fù)方紫草解毒軟膏中紫草、黃連、大黃、雞血藤進(jìn)行鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定復(fù)方紫草解毒軟膏中芒柄花素、左旋紫草素、大黃酸、大黃素、大黃素甲醚的含量，為復(fù)方紫草解毒軟膏的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供定性和定量的檢測(cè)方法，以期為控制與評(píng)價(jià)復(fù)方紫草解毒軟膏的質(zhì)量提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1儀器與試藥

1.1 主要儀器 Agilent1260高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；ME155DU型電子天平（北京中恒日鑫科技有限公司梅特勒）；PHG-9206A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；MP511型PH計(jì)（上海三信儀表廠）；AR-300Y型密度測(cè)試儀（廣東宏拓儀器科技有限公司）；Simplicity超純水系統(tǒng)（密理博中國(guó)有限公司）。

1.2 試藥與試劑 復(fù)方紫草解毒軟膏（批號(hào)：20210501，20210502，20210503）均由南寧市中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供；紫草（批號(hào)：20210801）、黃連（批號(hào)：20211102）、大黃（批號(hào)：20210701）、雞血藤（批號(hào)：20201201）、白及（批號(hào)：20210902）、珍珠粉（批號(hào)：20210501）、冰片（批號(hào)：20210901）均購(gòu)于廣西仙茱中藥科技有限公司，經(jīng)南寧市中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部薛彩紅副主任中藥師鑒定均為正品；左旋紫草素對(duì)照品（批號(hào)：110769-200506，含量：98.5%）、芒柄花素對(duì)照品（批號(hào)：111703-201504，含量：99.2%）、大黃素對(duì)照品（批號(hào)：110756-201913，含量：97.8%）、大黃酸對(duì)照品（批號(hào)：110757-201607，含量：98.2%）、大黃素甲醚對(duì)照品（批號(hào)：110758-202218，含量：97.3%）鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)：110713-202015）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；硅膠G板（批號(hào)：20200912）購(gòu)于青島海洋化工廠；甲醇（色譜純）（批號(hào)：208502）購(gòu)于瀘天化（集團(tuán)）有限責(zé)任公司；磷酸（分析純）（批號(hào)：T200110324）購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈（色譜純）（批號(hào)：190060）購(gòu)于賽默飛世爾科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜（TLC）鑒別

2.1.1 紫草的薄層色譜（TLC）鑒別 取復(fù)方紫草解毒軟膏樣品10 g，加甲醇60 mL，60 ℃超聲處理30 min，濾過，濾液濃縮至2 mL，加硅膠10 g，研勻，裝柱，用300 mL甲醇洗脫，洗脫液濃縮至1 mL，作為供試品溶液。取紫草對(duì)照藥材1 g，加石油醚（60～90 ℃）30 mL，超聲25 min，濾紙過濾，濾液濃縮到1 mL，作為紫草對(duì)照藥材溶液。按照制備供試品溶液的方法，制得缺紫草藥材的陰性對(duì)照品溶液。按照2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》一部薄層色譜法，吸取供試品溶液和陰性對(duì)照品溶液各4 μL、紫草對(duì)照藥材溶液3 μL，分別點(diǎn)于硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90 ℃）-乙醚-甲酸（6∶7∶0.5）為展開劑，展開，取出，自然晾干。結(jié)果供試品在與紫草對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照品無干擾。（見圖1）

2.1.2 黃連的薄層色譜（TLC）鑒別 取復(fù)方紫草解毒軟膏樣品10 g，加20 g硅膠，混勻，裝柱，用300 mL甲醇沖柱洗脫，洗脫液置于蒸發(fā)皿內(nèi)在水浴鍋上濃縮到2 mL，作為供試品溶液。取適量的鹽酸小檗堿對(duì)照品，加甲醇制成質(zhì)量濃度為每毫升含0.80 mg的溶液，作為鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液。按照制備供試品溶液的方法，制成缺黃連的陰性對(duì)照品溶液。按照2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》一部薄層色譜法，吸取供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各4 μL、鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液3 μL，分別點(diǎn)于硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水（6∶5∶1∶2∶0.5）為展開劑，置氨蒸氣飽和的展開缸內(nèi)展開，小心取出，自然晾干，置紫外光燈（360 nm）下檢視。結(jié)果供試品在與鹽酸小檗堿對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照品無干擾。（見圖2）

圖1紫草的薄層色譜圖

圖2 黃連的薄層色譜圖

2.1.3 大黃的薄層色譜（TLC）鑒別 取復(fù)方紫草解毒軟膏樣品10 g，加20 g硅膠，研均勻，上柱，用300 mL甲醇沖洗，收集洗脫液蒸干；然后加60 mL純水12 000 r/min離心10 min，取上清液濾過后加10 mL稀鹽酸，超聲30 min，再使用乙醚萃取2次，每次40 mL，合并乙醚液，水浴蒸干；加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取1g的大黃對(duì)照藥材，加30mL甲醇，超聲30min，過濾，濾液蒸干；殘?jiān)铀?0 mL使溶解，再加稀鹽酸2 mL，回流提取30 min，冷卻室溫；用乙醚萃取2次，每次30 mL，合并乙醚液，蒸干，殘?jiān)? mL的三氯甲烷使溶解，作為大黃對(duì)照藥材溶液。分別取適量的大黃酸、大黃素對(duì)照品，分別加甲醇制成質(zhì)量濃度為每1 mL含大黃酸0.70 mg、大黃素0.80 mg的對(duì)照品溶液。按照制備供試品溶液的方法，制備缺大黃的陰性對(duì)照品溶液。按照2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》一部薄層色譜法，吸取供試品溶液和陰性對(duì)照品溶液各5 μL、大黃酸和大黃素對(duì)照品溶液各3 μL、大黃對(duì)照藥材溶液4 μL，分別點(diǎn)于硅膠G薄層板上，以苯-乙酸乙酯-甲酸（8∶3∶0.5）為展開劑，展開到合適位置，小心取出，自然晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果供試品與大黃素對(duì)照品、大黃酸對(duì)照品和大黃對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上顯相同的斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照品無干擾。（見圖3）

圖3 大黃的薄層色譜圖

2.1.4 雞血藤的薄層色譜（TLC）鑒別 取復(fù)方紫草解毒軟膏樣品10 g，加甲醇60 mL，水浴加熱25 min，邊加熱邊攪拌，趁熱濾過，濾液濃縮至2 mL；加入硅膠5 g拌勻，揮干溶劑，置硅膠柱（內(nèi)徑為1.0 cm，干法裝柱）上，依次用60 mL石油醚（60～90 ℃）、200 mL三氯甲烷-甲醇（10:1）洗脫，收集三氯甲烷-甲醇（10∶1）洗脫液，水浴蒸干；殘?jiān)尤燃淄? mL使溶解，作為供試品溶液。取2 g雞血藤對(duì)照藥材，加入60 mL甲醇，超聲30 min，然后過濾，濾液水浴蒸干，加2 mL甲醇使殘?jiān)芙猓尤? g硅膠拌勻，揮干溶劑，置硅膠柱（內(nèi)徑為1.0 cm，干法裝柱）上，依次用30 mL石油醚（60～90 ℃）、60 mL三氯甲烷-甲醇（10∶1）洗脫，收集三氯甲烷-甲醇（10∶1）洗脫液，水浴蒸干；加1 mL三氯甲烷使殘?jiān)芙?，作為雞血藤對(duì)照藥材溶液。另取適量的芒柄花素對(duì)照品，加甲醇配制成質(zhì)量濃度為每1 mL含1.00 mg的芒柄花素溶液，作為芒柄花素對(duì)照品溶液。按照2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》一部薄層色譜法，吸取供試品溶液和陰性樣品溶液各4 μL、芒柄花素對(duì)照品溶液3 μL、雞血藤對(duì)照藥材溶液3 μL，分別點(diǎn)于硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇（10∶1）為展開劑，展開缸展開，小心取出，自然晾干；置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果供試品與芒柄花素對(duì)照品和雞血藤對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照品無干擾。（見圖4）

圖4 雞血藤的薄層色譜圖

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱為GeminiR-C18110?（4.6mm×250mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫，洗脫程序見表1，流速為1 mL/min，柱溫為30 ℃，芒柄花素檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm[17]，左旋紫草素檢測(cè)波長(zhǎng)為516 nm[18]，大黃酸、大黃素和大黃素甲醚檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm[19]，進(jìn)樣量為10 μL。

表1 梯度洗脫程序表

2.2.2 溶液的制備

2.2.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取芒柄花素對(duì)照品、左旋紫草素對(duì)照品、大黃酸對(duì)照品、大黃素對(duì)照品、大黃素甲醚對(duì)照品適量，加甲醇制成每毫升含芒柄花素62.00 μg、左旋紫草素95.00 μg、大黃酸70.00 μg、大黃素51.00 μg、大黃素甲醚67.00 μg的溶液，即得混合對(duì)照品溶液。

2.2.2.2 供試品溶液的制備 取復(fù)方紫草解毒軟膏5 g，精密稱定，加入60 mL石油醚（60～90 ℃）超聲使溶解，加入30 mL 0.25 mol/L氫氧化鈉溶液，萃取3次，合并3次萃取液，加入稀鹽酸調(diào)節(jié)使其pH為2～3，用三氯甲烷萃取2次，每次50 mL，合并三氯甲烷液，水浴蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜?5 mL容量瓶中，搖勻，用微孔濾膜（孔徑0.22 μm）濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2.3 陰性對(duì)照品溶液的制備 按照復(fù)方紫草解毒軟膏處方及生產(chǎn)工藝分別制備缺紫草、大黃、雞血藤的陰性對(duì)照品，并按“2.2.2.2”項(xiàng)下方法制備各陰性對(duì)照品溶液。

2.2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取供試品溶液、混合對(duì)照品溶液和3種陰性樣品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，色譜圖見圖5。結(jié)果色譜峰分離度均達(dá)到1.5以上，且陰性對(duì)照無干擾；理論塔板數(shù)以芒柄花素峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000。復(fù)方紫草解毒軟膏樣品中的芒柄花素、左旋紫草素、大黃酸、大黃素和大黃素甲醚成分都能與其他成分明顯分離，樣品中其他成分對(duì)測(cè)定成分沒有影響。

圖5 HPLC 色譜圖

2.2.4 線性關(guān)系、定量限和檢測(cè)限考察 精密稱取芒柄花素對(duì)照品9.82 mg、左旋紫草素對(duì)照品10.16 mg、大黃酸對(duì)照品8.24 mg、大黃素對(duì)照品9.15 mg、大黃素甲醚對(duì)照品8.60 mg，置于50 mL容量瓶，加甲醇并稀釋至刻度，得混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5、1、2、4、8 mL，分別置25 mL容量瓶，用甲醇稀釋至刻度，配制成5個(gè)不同濃度的芒柄花素、左旋紫草素、大黃酸、大黃素、大黃素甲醚對(duì)照品溶液，搖勻，各吸取10 μL注入高效液相色譜儀，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得線性回歸方程和線性范圍；通過連續(xù)稀釋混合對(duì)照品溶液確定定量限和檢測(cè)限，當(dāng)信號(hào)和噪聲之間的比值為3時(shí)所對(duì)應(yīng)的濃度確定為檢測(cè)限，信號(hào)和噪聲之間的比值為10時(shí)所對(duì)應(yīng)的濃度確定為定量限。（見表2）

表2 5 種成分的線性關(guān)系、定量限和檢出限

2.2.5 精密度試驗(yàn) 取復(fù)方紫草解毒軟膏（批號(hào)：20210501），按照“2.2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果芒柄花素、左旋紫草素、大黃酸、大黃素、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為1.75%、1.21%、0.84%、1.32%、0.91%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性實(shí)試驗(yàn) 取復(fù)方紫草解毒軟膏（批號(hào)：20210501），按照“2.2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于供試品溶液制備后0、2、4、8、12、24 h按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果芒柄花素、左旋紫草素、大黃酸、大黃素、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為2.04%、1.81%、1.15%、1.17%、2.53%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取復(fù)方紫草解毒軟膏（批號(hào)：20210501），按照“2.2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果芒柄花素、左旋紫草素、大黃酸、大黃素、大黃素甲醚的平均含量分別為0.098、0.216、0.125、0.172、0.139 mg/g，RSD分別為2.53%、1.42%、2.75%、2.20%、2.81%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的復(fù)方紫草解毒軟膏樣品（批號(hào)：20210501）2.5 g，共6份，分別精密加入芒柄花素、左旋紫草素、大黃酸、大黃素、大黃素甲醚對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，按照“2.2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，取適量樣品溶液13 000 r/min離心10 min，取上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算樣品中的芒柄花素、左旋紫草素、大黃酸、大黃素和大黃素甲醚的含量，并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果芒柄花素、左旋紫草素、大黃酸、大黃素、大黃素甲醚的平均加樣回收率分別為99.71%、98.60%、99.84%、99.42%、98.92%，RSD分別為2.93%、2.57%、2.80%、2.97%、2.77%（n=6），表明方法準(zhǔn)確度良好。（見表3）

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 （n=6）

2.2.9 樣品含量測(cè)定 取不同批號(hào)復(fù)方紫草解毒軟膏，按照“2.2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定并計(jì)算復(fù)方紫草解毒軟膏中芒柄花素、左旋紫草素、大黃酸、大黃素、大黃素甲醚的含量。（見表4）

表4 復(fù)方紫草解毒軟膏樣品測(cè)定結(jié)果 （n=3，mg/g）

3 討 論

3.1 樣品處理分析 復(fù)方紫草解毒軟膏是一種軟膏劑，軟膏中的基質(zhì)對(duì)含量測(cè)定有一定的影響，所以采用石油醚溶解軟膏劑后再用酸液、堿液萃取制備供試品溶液，可有效減少基質(zhì)對(duì)含量測(cè)定的影響。同時(shí)在操作萃取時(shí)應(yīng)使其水相和有機(jī)相充分分層，使油性基質(zhì)去掉，可以避免其對(duì)色譜柱造成的損壞。

3.2 色譜條件的選擇 查閱相關(guān)文獻(xiàn)[20-22]發(fā)現(xiàn)，芒柄花素、左旋紫草素、大黃酸、大黃素、大黃素甲醚的色譜條件多采用乙腈-磷酸系統(tǒng)，使用的磷酸濃度有0.05%、0.1%、0.2%。預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)選用0.1%的磷酸濃度，峰形較好無拖尾現(xiàn)象。由于復(fù)方紫草解毒軟膏為復(fù)方軟膏制劑，成分較多，本研究通過多次反復(fù)調(diào)節(jié)流動(dòng)相比例，分析色譜峰最終選取乙腈-0.1%磷酸系統(tǒng)梯度洗脫。該方法可以使樣品中芒柄花素、左旋紫草素、大黃酸、大黃素、大黃素甲醚色譜峰與其他成分的色譜峰達(dá)到較好的分離。

3.3 待測(cè)成分的選擇及分析 紫草主要有效成分左旋紫草素為萘醌類化合物，具有酚羥基，呈酸性，因此能被堿性溶液提取并溶于溶液中。由此左旋紫草素與油性基質(zhì)實(shí)現(xiàn)初步分離，然后用酸性溶液酸化后又可使左旋紫草素析出。大黃的主要活性成分大黃酸、大黃素和大黃素甲醚是蒽醌類化合物，雞血藤的主要有效成分芒柄花素是一種異黃酮類成分[23]。4種成分均具有酚羥基，呈酸性，因此能被堿性溶液提取并溶于溶液中。其成分與油性基質(zhì)實(shí)現(xiàn)初步分離，酸性溶液酸化后又可使其成分析出。綜上所述，實(shí)驗(yàn)中軟膏劑樣品處理先用0.25 mol/L的氫氧化鈉溶液提取，再用稀鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH為2～3，然后再用三氯甲烷進(jìn)行萃取。

3.4 薄層鑒別分析 由于復(fù)方紫草解毒軟膏為乳膏制劑，紫草、黃連、大黃和雞血藤藥材的薄層鑒別在TLC鑒別分析過程中樣品的處理極其重要。為了達(dá)到干擾小、易檢出的目的，本研究首先取部分乳膏用硅膠研和并干燥，使乳膏均勻吸附在硅膠上，為進(jìn)一步的供試品制備提供前提物質(zhì)。復(fù)方紫草解毒軟膏使用石油醚（60～90 ℃）超聲使其溶解，然后加入0.25 mol/L氫氧化鈉溶液提取，用稀鹽酸調(diào)節(jié)樣品溶液的pH值為2～3，再用三氯甲烷提取，合并三氯甲烷液，水浴蒸干，殘?jiān)舆m量甲醇溶解即為供試品。