朱宇琪，宋秀祖

（浙江中醫(yī)藥大學附屬杭州第三醫(yī)院，浙江 杭州 310009）

固有免疫是機體固有的、抵御病原體入侵的第一道屏障，巨噬細胞和中性粒細胞等參與其中，Toll樣受體（TLR）在固有免疫中扮演重要角色。當致病因子如脂多糖（LPS）、脂磷壁酸（Lta）等刺激細胞TLR 時，會誘導產(chǎn)生炎性細胞因子和趨化因子，包括腫瘤壞死因子（TNF）、白細胞介素-6（IL-6）、IL-1β和巨噬細胞炎性蛋白2（MIP2）等，以激活炎性反應抵御病原體入侵[1]。近年來研究表明，TLR 在黑色素細胞中功能性表達，參與黑色素合成和黑素小體轉運，并在黃褐斑和白癜風的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。本文圍繞TLR 在黑色素細胞中異常表達對色素性皮膚病發(fā)病的影響進行綜述。

1 TLR 的結構和功能

TLR 是一類參與固有免疫的跨膜蛋白。哺乳動物TLR 家族包括13 名成員，其中人類由TLR1～TLR10等10 名成員組成[2]。人類的固有免疫系統(tǒng)高度保守，可通過TLR 識別病原體相關分子模式（PAMP）對入侵機體的病原體做出即時反應。在獲得性免疫中，樹突狀細胞中的TLR 信號也參與了初始T 細胞的激活過程[3]。TLR 在免疫細胞以外的細胞中也有表達，包括：角質形成細胞、黑色素細胞和朗格漢斯細胞等。Yu 等[4]用特異性引物對體外擴增的正常人黑色素細胞進行mRNA 檢測：發(fā)現(xiàn)人黑色素細胞構成性表達TLR1、2、3、4、6、7 和9，但不表達TLR 5、8和10。用抗人TLR 蛋白的特異性抗體進行流式細胞術和免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)人黑色素細胞表達TLR蛋白，證實了TLR 在皮膚黑色素細胞中的表達。

TLR 識別的配體主要有：微生物天然成分、天然物質的合成類似物、小分子化合物，以及無菌炎性反應期間宿主細胞釋放的內(nèi)源性成分等[5]。細胞表面TLR 主要識別微生物膜成分，如脂質、脂蛋白和蛋白質。單個TLR 可識別多種配體來觸發(fā)免疫反應[6]。TLR 可通過其細胞外結構域與多種微生物PAMP 相互作用。在TLR 刺激下，核轉錄因子-κB（NF-κB）的激活和干擾素（IFN）-調(diào)節(jié)因子3 途徑分別啟動了促炎細胞因子（如IL-1 和TNF-α）的產(chǎn)生和Ⅰ型IFN（IFN-α 和IFN-β）的產(chǎn)生。因此TLR在早期宿主抵御入侵病原體的防御中起著至關重要的作用[5]。TLR 信號的激活需要TLR 的同源二聚化或異源二聚化，或與核心受體形成“m”形二聚體，夾在配體分子結構之間，以促進細胞內(nèi)Toll/IL-1 受體（TIR）結構域的二聚化，并觸發(fā)下游信號級聯(lián)反應。TLR 的細胞內(nèi)TIR 結構域二聚化的同時招募含有TIR 結構域的適配蛋白，如髓樣分化初級應答基因88 （MyD88）、含TIR 結構域的適配蛋白（TIRAP）、誘導IFN-β 的含有TIR 結構域的銜接子（TRIF）和TRIF 相關適配分子（TRAM）。根據(jù)適配蛋白的使用情況，TLR 信號又分為MyD88 依賴通路和TRIF 依賴通路。除了TLR3，所有的TLR 都使用MyD88 依賴的途徑來啟動信號傳遞，而TLR4 則利用MyD88 和TRIF 途徑[7]。

當刺激人黑色素細胞TLR 時，促炎細胞因子（IL-8、IL-6）和趨化因子[CC 趨化因子配體2（CCL2）、CCL3、CCL5]的釋放顯著增加。而觸發(fā)TLR 2、3、4、7和9 則導致NF-κB 抑制蛋白α（IκBα）的磷酸化和NF-κB 亞基p65 的核移位，表明培養(yǎng)的人黑色素細胞表達功能性TLR2、3、4、7 和9，且NF-κB 通路參與TLR2、3、4、7 和9 的信號轉導反應，這也解釋了眾多促炎基因被激活的原因：TLRs 使人黑色素細胞成為皮膚固有免疫的活躍分子，參與了色素性皮膚病的發(fā)病[4]。

2 TLR 與黃褐斑

2.1 TLR2 與黃褐斑 TLR2 在健康皮膚中不表達或弱陽性表達，但在黃褐斑皮損處呈陽性表達，且表達明顯上調(diào)，表明黃褐斑發(fā)病中的炎性反應可能與TLR2 介導的免疫反應相關[8]。Koike 等[9]研究表明，TLR2 激動劑單核細胞增生李斯特氏菌熱滅活制劑（HKLM）通過促進人黑色素細胞的黑色素生成基因的表達，包括增加酪氨酸酶（TYR）的活性和表達，上調(diào)小眼畸形相關轉錄因子（MITF）、TYR、多巴色素互變異構酶（DCT）的mRNA 表達，導致細胞外黑色素和原本數(shù)量穩(wěn)定的細胞內(nèi)黑色素增加，證明TLR2 通過促進黑色素細胞黑色素生成來參與固有免疫系統(tǒng)的反應。黑素小體成熟和運輸?shù)幕A是膜運輸和囊泡轉化。人表皮包括微生物群在內(nèi)的微環(huán)境表達TLR 以感知外界信號，從而誘導細胞因子和抗菌肽保護人體。其中TLR2 促進了人表皮黑色素細胞Rab11A 的表達，并利用與Rab11a 相關的黑素小體轉運，來將黑素小體從黑色素細胞向鄰近角質形成細胞轉移，從而影響皮膚色素沉著及闡明炎性反應后色素沉著的過程[10]。

2.2 TLR3 與黃褐斑 TLR3 激動劑聚肌胞苷酸[Poly（I：C）]通過TRIF 和線粒體抗病毒信號蛋白（MAVS）信號通路誘導Rab27A 的表達，增加了黑素小體向膜周區(qū)域的轉運和向角質形成細胞的轉移，證明TLR3 信號通過促進黑素小體轉移到角質形成細胞來響應固有免疫系統(tǒng)的激活[9，11]。Koike 等[12]研究表明TLR3 刺激激活Ras 同源基因家族成員A（RHOA）和細胞分裂周期因子42（CDC42）的表達，肌動蛋白應力纖維和絲狀偽足的形成分別發(fā)生改變，來誘導細胞內(nèi)吞作用，從而促進黑素小體進入角質形成細胞引起色素沉著。

2.3 TLR4 與黃褐斑 TLR4 在健康皮膚中不表達，但在黃褐斑皮損處表達明顯上調(diào)。表明黃褐斑發(fā)病機制中的炎性反應除了TLR2 外，可能也與TLR4介導的免疫反應相關[8]。人黑色素細胞在生理條件下表達TLR4 及其接頭分子CD14 和MyD88，而TLR4 和MyD88 的表達又受到LPS 的調(diào)節(jié)。其中CD14 作為接頭分子通過TLR4 增強LPS 的信號敏感性，而MyD88 又是TLR4 細胞內(nèi)信號轉導所必需的。LPS 可誘導人黑色素細胞黑色素合成但卻以濃度依賴的方式抑制黑色素細胞增殖，表明LPS 誘導的TLR4 表達可能在微生物誘導的黑色素合成中發(fā)揮作用[13]。Tam 等[14]研究表明在深膚色的黑色素細胞中TLR4 mRNA 水平高于淺膚色的黑色素細胞。而黑色素細胞TLR4mRNA 的表達受LPS 參與的NF-κB 通路調(diào)控，通路激活可增加黑色素細胞TLR4mRNA 的表達，并增強NF-κB p50 和p65 的DNA 結合活性，表明黑色素生成參與正常表皮黑色素細胞的免疫調(diào)節(jié)作用。Song 等[15]研究表明，靜息狀態(tài)的新生兒黑色素細胞（NHMs）不表達TLR4，但LPS 刺激可誘導TLR4 表達，從而增加細胞色素沉著，并誘導局部炎性反應。而反復紫外線照射，特別是戶外紫外線（UVB）治療后，NHMs TLR4 的mRNA和蛋白表達均顯著高于經(jīng)LPS 治療后。表明黑色素細胞中的TLR4 信號通路與UVB 誘導的免疫調(diào)節(jié)之間可能存在關聯(lián)。Takabe 等[16]研究表明黑色素細胞周圍完整的透明質酸涂層可以保護細胞免受紫外線輻射（UVR）等各種因素的傷害，當透明質酸涂層破裂時則通過NF-κB 激活增加UVB 誘導的TLR-4 受體信號和促炎介質IL-6、IL-8、CXC 趨化因子配體1（CXCL1）和CXCL10 的表達，透明質酸涂層的反復損傷參與激活UVB 誘導的持續(xù)反應導致炎性發(fā)生。

2.4 TLR9 與黃褐斑 TLR9 激動劑ODN2006 刺激以劑量依賴性方式降低正常人皮膚黑色素復蘇細胞（PIG1）的活力，并提高促炎細胞因子TNF-α、IL-6 和IL-8 的產(chǎn)生。ODN2006 可不同程度地調(diào)節(jié)PIG1 黑色素細胞中PMEL、TYR 和TLR9 的表達，并以時間依賴性方式增加TLR9 表達，UVB 照射對這一過程具有疊加效應。經(jīng)ODN2006 刺激的TLR9可進一步激活NF-κB 促進黑色素細胞的黑色素合成，提示在微生物誘導的黑色素合成中TLR9 可能發(fā)揮作用[17]。

3 TLR 與白癜風

3.1 TLR3 與白癜風 Zhang 等[18]采用流式細胞術檢測黑色素細胞細胞間黏附分子-1（ICAM-1）的表達，發(fā)現(xiàn)壞死的角質形成細胞釋放的RNA 可刺激黑色素細胞ICAM-1 的表達，并誘導黑色素細胞的促炎基因表達。而TLR3 可作為受體與受損細胞中釋放出來RNA 相互作用。這表明TLR3 可能通過誘導人黑色素細胞ICAM-1 等促炎基因表達，直接調(diào)節(jié)黑色素細胞功能及與免疫細胞間的相互作用，并參與皮膚物理創(chuàng)傷后白癜風的發(fā)病機制。Yu 等[19]用免疫熒光法檢測體外擴增的人表皮黑色素細胞TLR3 后發(fā)現(xiàn)，人黑色素細胞表達構成性和誘導性TLR3，這表明人黑色素細胞可能通過TLR3 來識別病毒來源的致病基序。進一步研究表明，黑色素細胞對雙鏈核糖核酸（dsRNA）的反應性誘導凋亡作用依賴于TLR3[20]。TLR3 介導的黑色素細胞凋亡需要自分泌IFN-β。病毒感染曾被認為是白癜風中黑色素細胞破壞的誘因，推測病毒dsRNA 通過激活人黑色素細胞中的TLR3 并自分泌IFN-β 來誘導黑色素細胞的凋亡。

3.2 TLR7 與白癜風 Yu 等[3]研究表明，與正常黑色素細胞比較，白癜風皮損周圍皮膚的黑色素細胞凋亡率顯著升高，白癜風黑色素細胞分泌的IL-6、IL-8 和可溶性ICAM-1（sICAM-1）也明顯增多，但白癜風黑色素細胞的酪氨酸酶活性及黑色素含量均顯著低于正常黑色素細胞。白癜風黑色素細胞TLR7 表達明顯高于正常黑色素細胞，表明TLR7 可能與白癜風黑色素細胞的功能紊亂相關[3]。Traks 等[21]研究表明，TLR7 單核苷酸多態(tài)性（SNP）與白癜風易感性存在關聯(lián)，表明除了部分炎癥性皮膚病以外，TLR 還影響白癜風的疾病發(fā)展。TLR7 激動劑咪喹莫特的局部使用可能引起局限性白癜風或白癜風樣色素減退[22]。Kang 等[23]研究表明，咪喹莫特對人黑色素細胞有直接作用，降低了小眼癥相關轉錄因子（MITF）和酪氨酸酶蛋白的表達，從而導致色素的減少。同時，經(jīng)咪喹莫特刺激的黑色素細胞生長受到抑制。因此，外用咪喹莫特引起的白癜風的發(fā)病機制可能與咪喹莫特通過TLR7 依賴性機制抑制人黑色素細胞增殖和黑色素生成相關。

3.3 TLR9 與白癜風 Yu 等[3]研究表明，TLR9 在白癜風黑色素細胞中表達增加，可能與白癜風的發(fā)病機制有關。TLR7 和TLR9 有相似的結構和功能，并分別通過識別自身RNA 參與自身免疫，但在自身免疫性疾病中的作用可能有所不同。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）的小鼠模型中，TLR9 基因缺陷小鼠的自身免疫性疾病加重，而TLR7 基因缺陷小鼠的病情則有所改善，二者起著相反的炎性反應和調(diào)節(jié)作用[24]。SLE患者B 細胞中TLR9 的低反應性可能代表某種保護機制的喪失，從而導致自身免疫的啟動或增強[25]。TLR 交易伴隨基因UNC93B1 通過招募syntenin-1以抑制TLR7 信號并防止自身免疫，但不限制TLR9的信號轉導[25]。因此推測在白癜風患者對黑色素細胞的自身免疫作用下，這2 種TLR 的表達增加可能是由于皮損內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的競爭所致[26]。

綜上，本文對TLR 在黑色素細胞中異常表達與色素性皮膚病發(fā)病的相關性進行了綜述與討論。TLR 可通過誘導相關基因的表達來調(diào)節(jié)黑色素細胞黑色素生成和炎性因子釋放，并參與免疫反應。黑色素細胞及黑色素生成過程的異常與色素性皮膚病緊密相關，黃褐斑的發(fā)病一般認為與黑色素細胞黑色素生成增加有關，而白癜風則存在功能性黑色素細胞的缺失。TLR 也被證明在色素性皮膚病中的表達發(fā)生改變，其中TLR2 和TLR4 在黃褐斑發(fā)病中發(fā)揮作用，TLR3、7 和9 均參與白癜風的發(fā)病，但TLR 在其中參與的具體環(huán)節(jié)尚未完全闡明，對TLR 及其對黑色素細胞影響的進一步深入研究，對色素性皮膚病的發(fā)病機制的闡明有重要意義。