候師師 梁考云 高程海 蔣翠萍 唐倩倩 劉永宏 易湘茜

摘 要：紅樹生境中微生物菌群豐富，其次生代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)新穎，是挖掘新型藥物的重要來(lái)源。該研究利用純培養(yǎng)技術(shù)和16S rRNA分子生物學(xué)技術(shù)確定細(xì)菌種屬，并進(jìn)行物種多樣性分析；以HepG2.2.15細(xì)胞株為模型，通過(guò)MTT和PCR技術(shù)測(cè)試細(xì)菌代謝產(chǎn)物的抗乙肝病毒活性；使用LC－HRMS技術(shù)對(duì)活性菌株代謝產(chǎn)物進(jìn)行初步分析，初步評(píng)價(jià)木欖沉積物、根、葉以及胚軸的可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性以及細(xì)菌代謝物生物活性，尋找抗乙肝病毒的藥源菌株。結(jié)果表明：（1）共獲得細(xì)菌59種，分屬于4門5綱14目23科36屬，其中芽孢桿菌為優(yōu)勢(shì)菌屬；菌株GXIMD07402、GXIMD07665、GXIMD07384分別為Pseudooceanicola屬、Thioclava屬和Aestuariibaculum屬的潛在新種。（2）抗乙肝病毒活性結(jié)果顯示GXIMD07366、GXIMD07616、GXIMD07384 、GXIMD07550、GXIMD07445X提取物能顯著降低HepG2.2.15細(xì)胞上清液中HBV DNA水平（P<0.05），抑制率分別為51%、47%、63%、52%、47%。（3）初步鑒定強(qiáng)活性菌株GXIMD07384的4個(gè)主要代謝產(chǎn)物有adenosine、cyclo（L－Pro－L－OMet）、acremine G和7，8－dimethylbenzo［g］pteridine－2，4（1H，3H）－dione。綜上認(rèn)為，木欖生境中可培養(yǎng)細(xì)菌物種多樣性豐富且含有能產(chǎn)生抗乙肝病毒活性化合物的菌株。該研究結(jié)果為后續(xù)海洋微生物資源的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 木欖， 可培養(yǎng)細(xì)菌， 物種多樣性， 代謝產(chǎn)物， 抗乙肝病毒活性

中圖分類號(hào)：Q939.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000－3142（2023）04－0616－10

Abstract：Mangrove habitat is rich in microbial flora and its secondary metabolites have novel structure， which is an important source for mining new drugs. This study preliminarily evaluated the culturable bacterial diversity of sediments， roots， leaves and hypocotyls of Bruguiera gymnorhiza and the biological activity of bacterial metabolites， and looked for anti－HBV drug source strains. Pure culture technique and 16S rRNA molecular biology technique were employed to determine the species of bacteria and analyze the species diversity. Using HepG2.2.15 cell line as a model， the anti－HBV activity of bacterial metabolites was tested by MTT and PCR techniques. The secondary metabolites of active bacteria were preliminary analyzed by LC－HRMS technique. The results were as follows： （1） A total of 59 species of bacteria were obtained， belonging to 4 phyla， 5 classes， 14 orders， 23 families， and 36 genera， among which Bacillus was the dominant genus. Strains GXIMD07402， GXIMD07665 and GXIMD07384 were potential new species of Pseudooceanicola， Thioclava and Aestuariibaculum， respectively. （2） The results of anti－HBV activity showed that GXIMD07366， GXIMD07616， GXIMD07384， GXIMD07550 and GXIMD07445X could significantly reduce the level of HBV DNA in the supernatant of HepG2.2.15 cells （P<0.05）， and the inhibition rates were 51%， 47%， 63%， 52% and 47%. （3） Four main secondary metabolites of the highly active strain GXIMD07384 were preliminarily identified as Adenosine， Cyclo（L－Pro－L－OMet）， Acremine G and 7，8－dimethylbenzo［g］pteridine －2，4（1H，3H）－dione. The results of the study confirm that the species diversity of culturable bacteria in the habitat of Bruguiera gymnorhiza is rich， and it contains strains that can produce anti－HBV active compounds， which provide a basis for the subsequent application of marine microbial resources.

Key words： Bruguiera gymnorhiza， culturable bacteria， species diversity， metabolites， anti－HBV activity

紅樹林是獨(dú)特的沿海生態(tài)系統(tǒng)，物質(zhì)流、能量流密集，表現(xiàn)出較高的生產(chǎn)力，孕育著龐大的微生物群落，是新物種和多種生物活性化合物的來(lái)源（Lin et al.， 2019）。細(xì)菌作為微生物的最大類群，在工業(yè)、醫(yī)藥等方面有著重要價(jià)值。Jiang等（2018）從廣西北侖口5種紅樹植物中分離得到101株內(nèi)生放線菌，包括7株潛在新種，抑菌試驗(yàn)中31株菌顯示陽(yáng)性，其中21株菌對(duì)抗性病原體表現(xiàn)出抑制活性。李菲等（2021）從海芒果根際和組織中分離出可培養(yǎng)細(xì)菌71株，其中15株菌株具有抗農(nóng)用真菌活性，其基因組DNA均擴(kuò)增出至少1種次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因。李蜜等（2018）從海南西海岸紅樹植物中分離得到32株細(xì)菌，其中1株為新物種、3株能延緩線蟲衰老的活性菌株。紅樹生境細(xì)菌資源豐富，是發(fā)現(xiàn)活性天然產(chǎn)物的重要來(lái)源，值得我們進(jìn)一步探索。

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus， HBV）是一種嗜肝型DNA病毒，長(zhǎng)期感染會(huì)引發(fā)肝硬化、肝癌，嚴(yán)重危害人類健康（Sarin， 2016）。全球乙肝表面抗原（HBV surface antigen，HBsAg）陽(yáng)性率為3.9%，約2.92億患者，每年有100多萬(wàn)人死于HBV感染所致的終末期疾病（Razavi－Shearer et al.， 2018）。中國(guó)普通人群的HBV感染率為6.89％，乙肝病毒患者有8 300萬(wàn)人，每年有30萬(wàn)人因慢性乙型肝炎致死（Wang et al.， 2019）。目前，公認(rèn)治療乙型肝炎有效的藥物主要是干擾素和核苷類藥物，但它們?cè)谂R床應(yīng)用中存在副作用大、價(jià)格昂貴、易耐藥以及治愈率低等諸多不足（Zhang et al.， 2015；Shi et al.， 2017）。因此，尋找新型高效的抗乙肝病毒藥物仍為我國(guó)亟待解決的難題。木欖（Bruguiera gymnorhiza）為紅樹科木欖屬植物，具有清熱解毒功效，京族醫(yī)書有用其主治乙型肝炎的記錄（張帥等， 2016）。本課題組前期從木欖胚軸中分離得到7個(gè)有抑制乙肝病毒復(fù)制活性的氰苷類化合物，其IC50值范圍為（5.1±0.2）～（87.7±5.8）μg·mL－1（Yi et al.， 2015）。然而，由于紅樹資源的生態(tài)價(jià)值突出，加之難再生性，使得大規(guī)模采集木欖胚軸用于抗乙肝病毒的研究受到制約。而微生物具有菌種易保存、生長(zhǎng)周期短、代謝可調(diào)控等優(yōu)點(diǎn)，因此可大規(guī)模發(fā)酵成為藥物開發(fā)的戰(zhàn)略資源。目前，有關(guān)木欖生境中可培養(yǎng)細(xì)菌的研究報(bào)道較少且多集中于抑菌活性。Ding等（2011） 從木欖莖部?jī)?nèi)生鏈霉菌Streptomyces sp.中分離得到4個(gè)新的安莎霉素類大環(huán)內(nèi)酯化合物divergolides A～D，對(duì)Bacillus subtilis、Mycobacterium vaccae、MRSA和VRE多種細(xì)菌有較強(qiáng)的抑制活性。Yan等（2010） 從木欖葉中分離得到1株鏈霉菌Streptomyces albidoflavus，從中分離得到第一個(gè)天然的8－乙酰氧基的抗霉素antimycin A18，對(duì)植物病原菌有良好的殺菌活性，而抗乙肝病毒活性未見報(bào)道。因此，本研究開展木欖生境中可培養(yǎng)細(xì)菌物種多樣性探索，并測(cè)試其代謝產(chǎn)物抗乙肝病毒活性，以期為藥用紅樹資源充分挖掘利用和抗乙肝藥物開發(fā)提供藥源菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 2019年5月在廣西北侖河口紅樹林自然保護(hù)區(qū)（108°14′11″ E、19°36′55″ N）采集木欖的生境沉積物、根、葉、胚軸樣品。對(duì)木欖沉積物用滅菌鏟挖取深度為5 cm的土壤，對(duì)木欖的根、葉、胚軸直接采取后用無(wú)菌水沖洗表面，將各樣品分裝在密封袋內(nèi)，保存于采樣冰盒中，帶回實(shí)驗(yàn)室處理。

1.1.2 培養(yǎng)基 分離培養(yǎng)基：共10種，包括燕麥培養(yǎng)基（P3）、酪氨酸－天冬酰胺培養(yǎng)基（P7）、海藻糖－脯氨酸培養(yǎng)基（M5）、改良ISP5培養(yǎng)基（M7）、精氨酸－天冬酰胺培養(yǎng)基（M9）、改良淀粉－水解酪素培養(yǎng)基（M10）、棉籽糖－組氨酸培養(yǎng)基（M11）、改良的高氏培養(yǎng)基（AGG）、R2A、2216E，培養(yǎng)基詳細(xì)配方參考李蜜等（2020）的方法。純化培養(yǎng)基：改良 ISP2 固體培養(yǎng)基（酵母提取物2.0 g、麥芽提取物2.0 g、葡萄糖2.0 g、瓊脂20.0 g和海水1 000 mL）。 發(fā)酵培養(yǎng)基：改良ISP2液體培養(yǎng)基、含0.1%小球藻的改良ISP2液體培養(yǎng)基。細(xì)胞完全培養(yǎng)基：90% DMEM培養(yǎng)基、10%胎牛血清、100 U·mL－1青鏈霉素。

1.1.3 細(xì)胞 HepG2.2.15細(xì)胞株：廣西艾滋病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室葉力教授惠贈(zèng)。

1.1.4 試劑 Chelex－100樹脂、2×Easy Taq Supermix購(gòu)于美國(guó)BioRad公司；16S rRNA基因擴(kuò)增引物對(duì)27F和1492R購(gòu)于全式金生物技術(shù)有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素、生物級(jí)二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；噻唑藍(lán)（MTT）購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；拉米夫定（3TC）購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司；DNA病毒基因組提取試劑盒購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司（中國(guó)，北京）；HBV DNA定量測(cè)定試劑盒購(gòu)于湖南圣湘生物科技有限公司；其他分離培養(yǎng)基用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.5 主要儀器 SW－CJ－2F超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；TAdvanced 96PCR擴(kuò)增儀（Biometra，德國(guó)）；ZWYP－2102恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）；HR1500－ⅡB2生物安全柜（青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司）；MCO－170AICDL－PC全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀（Tecan，瑞士）；Light Cycler480Ⅱ高通量實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)（Roche，瑞士）。

1.2 方法

1.2.1 樣品的預(yù)處理 樣品處理參考李菲等（2018）的方法。首先將木欖的根、葉、胚軸先用無(wú)菌水清洗，然后用75%酒精浸泡2 min，最后用無(wú)菌水沖洗除去酒精。取大約2.0 g沉積物樣品和木欖各組織樣品，分別置于無(wú)菌研缽中，加2 mL海水充分研磨，作為樣品原液。用無(wú)菌海水依次稀釋成1×10－3、1×10－4 g·mL－1樣液。

1.2.2 木欖生境中可培養(yǎng)細(xì)菌的分離純化 取1×10－3、1×10－4 g·mL－1的樣液100 μL均勻涂布于10種分離培養(yǎng)基中，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2～6周，不同形態(tài)的單菌落被挑取后，接種于ISP2培養(yǎng)基，利用三區(qū)劃線純化菌株。將生長(zhǎng)良好且無(wú)污染的菌體保藏于20%（V/V）甘油管中，置于4 ℃冰箱中短期存放，于-80 ℃冰箱中長(zhǎng)期保存。

1.2.3 細(xì)菌的分子生物學(xué)鑒定 提取目標(biāo)菌株的基因組DNA采用Chelex－100 Resin法（周雙清等，2010）并參照Walsh等（1991）的方法進(jìn)行PCR梯度擴(kuò)增。通用引物27F和1492R用于16S rRNA基因片段的擴(kuò)增。用1%瓊脂糖（m/V）凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物后，委托上海美吉生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司廣州分公司完成16S rRNA基因測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)SeqMan軟件整理，利用EzBioCloud（https：//www.ezbiocloud.net/）服務(wù)器進(jìn)行在線分析（Kim et al.， 2012）獲取同源性最高的典型菌株序列，通過(guò)比對(duì)進(jìn)行物種多樣性分析，序列相似度<98.65%視為潛在新物種（Kim et al.，2014）。利用Venny在線分析網(wǎng)站，在屬級(jí)水平上對(duì)木欖不同來(lái)源細(xì)菌類群分布進(jìn)行韋恩圖分析。

1.2.4 菌株代謝產(chǎn)物的制備及代謝產(chǎn)物多樣性的篩選 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌株分別接種到兩種液體發(fā)酵培養(yǎng)基后，于28 ℃、180 r·min－1搖床發(fā)酵培養(yǎng)7 d。發(fā)酵液用等體積乙酸乙酯萃取，萃取相經(jīng)減壓濃縮后置于干燥器中低溫保存?zhèn)溆?。利用HPLC－DAD技術(shù)分析菌株代謝產(chǎn)物，初步篩選出代謝產(chǎn)物較為豐富的菌。分別將ISP2液體培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物命名為“細(xì)菌編號(hào)”，含0.1%小球藻的改良ISP2液體培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物命名為“細(xì)菌編號(hào)X”，兩份空白培養(yǎng)基對(duì)照命名為“GXIMD00000”和“GXIMD00000X”。

1.2.5 菌株代謝產(chǎn)物對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞增殖的影響 對(duì)代謝產(chǎn)物較為豐富的菌株進(jìn)行抗乙肝病毒實(shí)驗(yàn)，加生物級(jí)DMSO完全溶解后用完全培養(yǎng)基稀釋至濃度為500、250、125 μg·mL－1。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)·mL－1，接種于96孔板上，每孔100 μL，貼壁培養(yǎng)24 h后，換入含藥培養(yǎng)液，同時(shí)設(shè)空白組和陽(yáng)性對(duì)照組（100 μg·mL－1 3TC）。培養(yǎng)72 h后吸取上清液，加入5 mg·mL－1 MTT溶液50 μL，37 ℃孵育4 h，棄去孔內(nèi)MTT溶液，加入DMSO 100 μL，震蕩10 min。在490 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定各孔光吸收值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（％）=（實(shí)驗(yàn)組A490值/陰性對(duì)照孔A490值）×100％。

1.2.6 檢測(cè)菌株代謝產(chǎn)物對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞上清液中HBV DNA的影響 選取對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)抑制作用的菌株代謝產(chǎn)物進(jìn)行后續(xù)抗乙肝病毒活性實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2.2.15細(xì)胞制成5×105個(gè)·mL－1細(xì)胞懸浮液，接種于24 孔板上，每孔1 mL，24 h貼壁培養(yǎng)，換入含藥培養(yǎng)液。第6天收集細(xì)胞上清液，按照病毒DNA制備試劑盒的步驟操作獲得高純度的HBV DNA，運(yùn)用乙型肝炎核酸定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清液中HBV DNA水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 木欖生境中可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性分布

2.1.1 木欖可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性分析 利用10種分離培養(yǎng)基，通過(guò)菌株形態(tài)學(xué)和16S rRNA基因測(cè)序技術(shù)進(jìn)行排重，共獲得可培養(yǎng)細(xì)菌59種（表1）。由表1可知，59種細(xì)菌歸屬于4門5綱14目23科36屬，分別為Actinobacteria（放線菌綱）10屬15種、Flavobacteria（黃桿菌綱）3屬3種、Bacillia（芽孢桿菌綱）6屬17種、Alphaproteobacteria（α－變形桿菌綱）10屬13種、Gammaproteobacteria（γ－變形菌綱）7屬11種。其中，Bacillus（芽孢桿菌屬）為本次研究的優(yōu)勢(shì)菌屬，分離得到菌株9株，占總菌株數(shù)的15.3%；Staphylococcus（球菌屬）為次優(yōu)勢(shì)菌屬，共分離得到菌株4株，占比為6.8%。

通過(guò)EzBioCloud服務(wù)器進(jìn)行16S rRNA基因序列比對(duì)分析，有3株菌株與有效描述的物種表現(xiàn)出低序列相似性（<98.65%），對(duì)潛在的新菌株進(jìn)行了16S rRNA基因的完整測(cè)序（>1 330 bp）后，發(fā)現(xiàn)GXIMD07402（GenBank登錄號(hào)：MT613339）與Pseudooceanicola aestuarii E2－1T的最高相似度為96.33%，GXIMD07665（GenBank登錄號(hào)：MW709434）與Thioclava pacifica DSM 10166T和Thioclava marina MPZS01000005T的最高相似度均為96.24%，GXIMD07384與Aestuarii－baculum suncheonense SC17T的最高相似度為98.52%，可能為新的物種。

2.1.2 木欖生境中可培養(yǎng)細(xì)菌在樣品中的分布 由圖1和圖2可知，從木欖沉積物分離得到的菌株種類最為豐富，共獲得菌株27屬40種；木欖不同組織部位中，根分離得到的菌種數(shù)目最多，共獲得12屬17種；木欖沉積物是放線菌綱的重要來(lái)源，其中10屬14種細(xì)菌均從木欖沉積物獲得，僅Brevibacterium casei分離自木欖胚軸；黃桿菌綱細(xì)菌均分離自沉積物和根，γ－變形菌綱細(xì)菌除Pseudomonas stutzeri外，其余10種均來(lái)源于木欖的沉積物和根部；從木欖的胚軸、葉分離得到的細(xì)菌豐富度較低，從木欖胚軸分離得到菌株7屬13種，從木欖葉分離得到最少菌株種類為7屬9種。

在屬級(jí)水平上對(duì)木欖生境來(lái)源的細(xì)菌進(jìn)行Venny分析，木欖沉積物和木欖各組織中僅存在1個(gè)共有菌屬Bacillus。沉積物和木欖根含有Demequina、Myroides、Bacillus、Staphylococcus、Pseudooceanicola、Microbulbifer、Vibrio 7個(gè)相同菌屬，共有菌屬豐富度明顯優(yōu)于沉積物和木欖其他組織部位。

2.1.3 不同培養(yǎng)基對(duì)木欖生境中可培養(yǎng)細(xì)菌的分離效果 由圖3可知，2216E培養(yǎng)基分離得到的菌種數(shù)目最多，為24株，菌屬分布最為廣泛，包括Aestuariibaculum、Bacillus、Demequina等11屬，2株新菌GXIMD07402和GXIMD07384均分離自該培養(yǎng)基。其次是M7（20種）、R2A（16種）和AGG（15種）培養(yǎng)基，菌屬豐富度較高，均分離得到Bacillus、Microbulbifer、Pantoea、Staphylococcus、Vibrio屬菌株。P3和P7得到菌株9屬14種和7屬10種，另1株新菌GXIMD B331分離自P7培養(yǎng)基。其余4種培養(yǎng)基M5（5種）、M9（8種）、M10（6種）和M11（6種）均分離得到Bacillus、Pantoea屬菌株。從菌種數(shù)量、菌屬豐富度和物種新穎性而言，2216E培養(yǎng)基均為此次分離的最優(yōu)介質(zhì)。

2.2 木欖可培養(yǎng)細(xì)菌的抗乙肝病毒活性分析

2.2.1木欖可培養(yǎng)細(xì)菌對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞增殖的影響 表2結(jié)果表明，在125 μg·mL－1濃度下，與空白組相比，2份空白培養(yǎng)基作用下的細(xì)胞存活率無(wú)明顯差異，即對(duì)細(xì)胞無(wú)毒副作用（P>0.05）。25份菌株發(fā)酵產(chǎn)物中，14份菌株代謝產(chǎn)物對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞無(wú)明顯的毒副作用，對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)明顯抑制作用，可以進(jìn)一步測(cè)試14份樣品對(duì)細(xì)胞分泌HBV DNA的抑制作用。

2.2.2 木欖可培養(yǎng)細(xì)菌對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBV DNA的抑制作用 由圖4可知，與空白組相比，2份空白培養(yǎng)基對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞上清液中HBV DNA水平無(wú)明顯降低作用（P>0.05）。GXIMD07366（Staphylococcus saprophyticus subsp. Saprophyticus）、GXIMD07616（Pararhodobacter aggregans）、GXIMD07384（Aestuariibaculum suncheonense）、GXIMD07550（Deme－quina salsinemoris）和GXIMD07445X（Erythrobacte citreus）能顯著降低HepG2.2.15細(xì)胞上清液中HBV DNA水平（P<0.05），抑制率分別為51%、47%、63%、52%、47%，GXIMD07384的抗乙肝病毒效果最為顯著，與100 μg·mL－1陽(yáng)性藥物3TC作用相比，細(xì)胞上清液中HBV DNA水平均有極顯著降低（P<0.01）。

2.3 GXIMD07384代謝產(chǎn)物的分析

GXIMD07384（Aestuariibaculum sp.）為潛在新物種，其代謝產(chǎn)物能顯著抑制HepG2.2.15中HBV DNA復(fù)制。利用LC－HRMS分析其主要代謝產(chǎn)物，初步鑒定了4個(gè)化合物，保留時(shí)間分別為3.8、11.7、14.5、26.1 min，分子離子峰依次為 ［M+H］+ 268.104 7、245.095 7、395.181 9和243.089 6，結(jié)合各色譜峰的二級(jí)質(zhì)譜圖碎片信息， 經(jīng)與文獻(xiàn)比對(duì)，初步推斷化合物為adenosine（Kuchkarova et al.，2020）、cyclo（L－Pro－L－OMet）（Yang et al.， 2013）、與空白對(duì)照組比較， 表示差異顯著（P<0.05）， 表示差異極顯著（P<0.01）。

indicates significant difference （P<0.05），indicates extremely significant difference （P<0.01）， compared with blank control group.

3 討論與結(jié)論

紅樹林蘊(yùn)藏著豐富而獨(dú)特的微生物資源，微生物物種多樣性的研究，是紅樹及微生物資源利用的重要內(nèi)容。然而，海洋中絕大多數(shù)微生物尚不能被現(xiàn)有的培養(yǎng)方法和技術(shù)進(jìn)行分離培養(yǎng)，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的一個(gè)重要原因是天然環(huán)境中很多微生物處于休眠狀態(tài)，該狀態(tài)是微生物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中逐漸形成的可逆的低代謝活力的生存模式（Mu et al.， 2018）。由于芽孢桿菌屬菌株產(chǎn)淀

粉酶、蛋白酶、葡聚糖、纖維素酶和幾丁質(zhì)酶等多種生物活性酶，與紅樹生態(tài)系統(tǒng)中高有機(jī)質(zhì)環(huán)境相適應(yīng)，因此其生長(zhǎng)狀態(tài)較為活躍，是紅樹可培養(yǎng)細(xì)菌中研究的優(yōu)勢(shì)菌屬（孫倩和林海鵬，2015；趙雅慧等，2018）。本研究對(duì)木欖生物樣品中可培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行分離鑒定，共獲得細(xì)菌59株，隸屬于36屬，其中芽孢桿菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬。此次實(shí)驗(yàn)得到了物種多樣性較為豐富的紅樹細(xì)菌，包括3株潛在新物種，隸屬于Pseudooceanicola、Thioclava和Aestuariibaculum屬，目前報(bào)道Aestuariibaculum屬細(xì)菌僅有3種（Jeong et al.， 2013; Lee et al.， 2013; Jiwon et al.， 2018），均分離自海洋生境，從而擴(kuò)充了紅樹微生物資源。隨著科技進(jìn)步，自然環(huán)境營(yíng)養(yǎng)成分的檢測(cè)以及宏基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和復(fù)蘇機(jī)制的探討，可為培養(yǎng)技術(shù)提供借鑒，從而發(fā)掘出更為豐富的微生物。

紅樹微生物具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化等多種生物活性，是活性天然產(chǎn)物的重要來(lái)源（洪葵，2013）。不同紅樹的微生物類群存在差異，微生物在與宿主植物的長(zhǎng)期互作過(guò)程中交換信息和遺傳物質(zhì)，從而有著類似或相同的代謝途徑，生成相同或相似的活性代謝產(chǎn)物（王景儀等，2020）。本課題組前期研究從木欖植物中分離得到抗乙肝病毒活性化合物，本研究以轉(zhuǎn)染HBV的HepG2.2.15細(xì)胞株為模型，發(fā)現(xiàn)5株細(xì)菌在藥物濃度為125 μg·mL－1時(shí)，能顯著降低細(xì)胞上清液中HBV DNA水平，5株活性菌株分別隸屬于Staphylococcus、Pararhodobacter、Aestuariibaculum、Demequina和Erythrobacter，Aestuariibaculum屬菌株抗乙肝病毒活性效果極為顯著，木欖植物和微生物均能產(chǎn)生抗乙肝病毒活性物質(zhì)。其中，Staphylococcus屬菌株被指出其基因簇ISK－1編碼產(chǎn)生的一種免疫蛋白NukH，在宿主免疫中具有協(xié)同作用（Sashihara et al.， 2013）。Aestuariibaculum屬菌株作為稀有菌屬的潛在新菌株，抗乙肝病毒活性效果顯著，說(shuō)明在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生了抑制乙肝病毒的強(qiáng)活性代謝產(chǎn)物，因此得到了更多關(guān)注。通過(guò)高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)初步鑒定了4個(gè)主要代謝產(chǎn)物為adenosine、cyclo （L－Pro－L－OMet）、acremine G和7，8－dimethylbenzo［g］pteridine－2，4（1H，3H）－dione。其中，adenosine作為核苷類化合物，已被證實(shí)在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中具有抗乙肝病毒活性，EC50值為1.5 μmol·L－1（董春紅和?？?biāo)，2005）?；钚跃隄舛葹?25 μg·mL－1，其抑制率達(dá)到63%，抗病毒效果強(qiáng)于adenosine，可能因?yàn)樵摼甏x產(chǎn)物中含有其他活性成分，二者協(xié)同發(fā)揮抗病毒作用。然而，其活性菌株的代謝產(chǎn)物和作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究，植物和微生物的生態(tài)學(xué)關(guān)系也有待進(jìn)一步探索。

木欖生境中可培養(yǎng)細(xì)菌及抗乙肝病毒活性研究?jī)?nèi)容的開展，為抗乙肝病毒活性藥物的發(fā)掘提供了新的藥用來(lái)源，進(jìn)一步完善了藥用紅樹木欖的微生物物種及其藥用價(jià)值。

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（責(zé)任編輯 蔣巧媛 鄧斯麗）