楊甲甲 楊米連 胡彥如

摘 要：生物鐘（circadian clock）是激發(fā)植物生理特征節(jié)律性表達，并使之維持穩(wěn)定的保守內(nèi)源調(diào)節(jié)機制。PRR（PSEUDO－RESPONSE REGULATOR）蛋白家族是生物鐘中央振蕩器的重要組成部分，調(diào)控植物的種子萌發(fā)、下胚軸伸長和開花等多種生命過程?；ㄇ嗨兀╝nthocyanin）是植物次生代謝產(chǎn)物，對植物的繁衍、生長發(fā)育和抵抗逆境脅迫具有重要作用。該研究以擬南芥（Arabidopsis thaliana）為對象，探討生物鐘PRR蛋白對花青素生物合成的調(diào)控功能和分子機制。結(jié)果表明：（1）在PRR基因單突變體及多突變體幼苗中，花青素的積累明顯降低，某些花青素合成相關(guān)基因的表達也顯著降低。（2）相反，在PRR5過表達幼苗中，花青素的積累以及某些花青素合成相關(guān)基因的表達則顯著升高。（3）蛋白相互作用結(jié)果顯示，PRR5蛋白能與MYB75、TT8、MYB90及MYB113等花青素調(diào)控蛋白相互作用，并形成復(fù)合物。（4）遺傳學(xué)分析結(jié)果顯示，擬南芥PRR5誘導(dǎo)幼苗中花青素的合成依賴于MYB家族花青素調(diào)控蛋白。綜上認為，生物鐘PRR蛋白可能通過PRR5與MYB75、TT8等相互作用，促進擬南芥幼苗中花青素的合成和積累。該研究結(jié)果對發(fā)掘PRR蛋白新的生物學(xué)功能，以及深入理解生物鐘信號調(diào)控植物幼苗的環(huán)境適應(yīng)性具有重要意義。

關(guān)鍵詞： 擬南芥， 生物鐘， PRR蛋白， 花青素， MBW復(fù)合體

中圖分類號：Q943

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1000－3142（2023）04－0676－12

Abstract：The circadian clock is a conservative endogenous regulatory mechanism that stimulates and maintains the rhythmic expression of plant physiological characteristics. The PRR （PSEUDO－RESPONSE REGULATOR） protein family is acritical component of the circadian clock central oscillator and regulates a variety of life processes such as seed germination， hypocotyl elongation， and flowering. Anthocyanin is plant secondary metabolites， which plays an important role in plant reproduction， growth， development and stress responses. In this study， we took Arabidopsis thaliana as the research object and explored the function and mechanism of circadian clock PRR proteins in the control of anthocyanin biosynthesis. The results were as follows： （1） The accumulation of anthocyanin and the expression of some anthocyanin synthesis－related genes were significantly reduced in PRR genes single mutant and multiple mutant seedlings. （2） On the contrary， in the seedlings with overexpression of PRR5， the accumulation of anthocyanin and the expression of some anthocyanin synthesis－related genes were significantly increased. （3） The results of the protein－protein interaction experiment showed that PRR5 protein could interact with MYB75， MYB90， MYB113 and TT8 to form protein complexes. （4） Results of genetic analysis showed that PRR5 promoted anthocyanin synthesis in A. thaliana seedlings depended on the MYB family anthocyanin regulatory proteins. In conclusion， the circadian clock PRR protein may promote the synthesis and accumulation of anthocyanin in A. thaliana seedlings through the interaction of PRR5 protein with MYB75， TT8.

Key words：

Arabidopsis thaliana， circadian clock， PRR protein， anthocyanin， MBW complex

花青素又稱花色素苷，是植物次級代謝產(chǎn)物，在花、果實和葉片等植物器官中廣泛存在（Liang et al.， 2018; Song et al.， 2021）。植物體內(nèi)六類花青素即天竺葵素（pelargonidin）、矢車菊素（cyanidin）、芍藥素（peonidin）、矮牽牛素（petunidin）、飛燕草素（delphinidin）和錦葵素（malvidin）通過糖基化、甲基化和酰基化等修飾作用生成600余種花青素，從而賦予植物豐富的色彩（Li et al.， 2018; Wang et al.， 2018; Gardeli et al.， 2019; Sun et al.， 2021）?；ㄇ嗨乜梢蕴岣咧参飳Χ喾N逆境脅迫的抵抗能力，對植物適應(yīng)環(huán)境具有重要意義（Hatier et al.， 2013; Fan et al.， 2016; Li et al.， 2018）。此外，花青素具有豐富的觀賞價值、營養(yǎng)價值和醫(yī)藥價值（Davies et al.， 2012; Peiffer et al.， 2016; Nomi et al.， 2019）。編碼花青素生物合成通路中相關(guān)酶的結(jié)構(gòu)基因主要分為兩類：CHS、CHI和F3H等早期花青素生物合成基因；DFR、ANS和UFGT等晚期花青素生物合成基因（Deng & Lu， 2017; Chen et al.， 2020）。這些結(jié)構(gòu)基因受到多種轉(zhuǎn)錄因子的精密調(diào)控，其中被研究最多也是最重要的分別是MYB（Myeloblastosis）、bHLH（basic Helix－Loop－Helix）和WDR（又稱WD40）三類轉(zhuǎn)錄因子家族（Tanaka et al.， 2008）。MYB75/PAP1是擬南芥MYB蛋白家族中調(diào)控花青素合成的重要轉(zhuǎn)錄因子，過表達MYB75轉(zhuǎn)基因植物的根、莖、葉和花中積累了大量花青素（Rinaldo et al.， 2015; Shin et al.， 2015）。此外，MYB家族MYB90/PAP2、MYB113和MYB114還正調(diào)控擬南芥花青素的生物合成（Gonzalez et al.， 2008; Maier et al.， 2013; Shi & Xie， 2014）。bHLH蛋白家族TT8、GL3、EGL3和MYC1等通過激活CHS、DFR等結(jié)構(gòu)基因的表達，參與調(diào)控花青素的合成（Martinez－Garcia et al.， 2000）。WDR蛋白家族TTG1等是誘導(dǎo)花青素穩(wěn)定積累不可或缺的一類重要轉(zhuǎn)錄因子（Payne et al.， 2000）。MYB、bHLH和WDR三類轉(zhuǎn)錄因子除了可以各自發(fā)揮功能促進植物花青素的合成以外，三者還可以結(jié)合形成三元MBW復(fù)合體直接調(diào)控結(jié)構(gòu)基因的表達促進植物花青素的合成（Liang et al.， 2018）。越來越多的研究結(jié)果表明，microRNA直接或間接地參與調(diào)控植物體內(nèi)花青素的合成（Varsha et al.， 2019; He et al.， 2019; Maria et al.， 2019）?；诨ㄇ嗨氐纳飳W(xué)功能及其在育種、食品和醫(yī)藥等方面的應(yīng)用前景，深入研究花青素生物合成與調(diào)控信號具有重要的應(yīng)用價值和科學(xué)意義。

近年來，外源環(huán)境信號及內(nèi)源植物激素信號調(diào)控花青素生物合成與積累的研究取得了重要進展。例如，光強和光質(zhì)均對花青素的合成起關(guān)鍵作用（Guo et al.， 2008; Maier & Hoecker， 2015）；低溫促進花青素的生物合成（Mori et al.， 2007; Zhang et al.， 2011）；植物激素脫落酸、茉莉酸、生長素等通過調(diào)控花青素合成相關(guān)基因的表達來影響植物花青素的合成與積累（Ji et al.， 2015; Xie et al.， 2016; Chen et al.， 2019; Chen et al.， 2020）。植物生物鐘系統(tǒng)通過核心振蕩器接收外界環(huán)境中如光照、溫度和營養(yǎng)元素等環(huán)境因子動態(tài)變化的時間信息（輸入途徑），在植物體內(nèi)產(chǎn)生內(nèi)源性的晝夜節(jié)律（中央振蕩器），進而調(diào)控植物生長發(fā)育的眾多過程，如開花、生物和非生物脅迫響應(yīng)、激素代謝等多種生命過程（輸出途徑）（Wei et al.， 2018）。PRR家族中的PRR5、PRR7和PRR9是中央振蕩器早循環(huán)的關(guān)鍵組分，在調(diào)控植物生長發(fā)育和響應(yīng)逆境脅迫方面發(fā)揮了重要作用（Sanchez & Kay， 2016）。生物鐘與花青素均在植物響應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮重要功能（Wei et al.， 2018; Song et al.， 2021），但關(guān)于生物鐘信號調(diào)控花青素合成的研究尚未見報道。近期有研究表明，生物鐘PRR蛋白能夠促進ABA信號抑制種子萌發(fā)及萌發(fā)后生長（Yang et al.， 2021），而ABA信號可以誘導(dǎo)擬南芥幼苗中花青素的合成與積累（Chen et al.， 2020）。那么，生物鐘PRR蛋白是否與花青素合成直接相關(guān)呢？本研究以擬南芥為材料，通過分子生物學(xué)和遺傳學(xué)相關(guān)的方法，探究了生物鐘PRR蛋白促進擬南芥幼苗花青素合成的生物學(xué)功能及其分子機制。這對于發(fā)掘PRR蛋白新的生物學(xué)功能，深入理解生物鐘信號調(diào)控植物幼苗的環(huán)境適應(yīng)性具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 植物材料及生長條件

所使用的野生型（WT）、突變體和過表達擬南芥植物均屬于哥倫比亞（Col－0）遺傳背景，突變體種子prr5－1（SALK_006280）、prr5－2（SALK_135000C）、prr7－1（SALK_091569C）和prr7－2（SALK_030430C）來源于俄亥俄州立大學(xué)的擬南芥資源中心，prr5 prr7雙突變體是通過prr5－1和prr7－2采用遺傳雜交得到，prr5 prr9和prr5 prr7 prr9由中國科學(xué)院植物研究所王雷研究員提供，myb－RNAi由楊洪全教授提供。為了獲得35S：PRR5－FLAG轉(zhuǎn)基因植株，將2FLAG標(biāo)簽序列連接的PRR5全長cDNAs，使用SmaI和XbaI酶切位點克隆到由CaMV 35S啟動的pOCA30載體，經(jīng)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化野生型（Col－0）擬南芥獲得T3代純合PRR5過表達植物（Yang et al.， 2021）。根據(jù)需要選取適量擬南芥突變體種子、過表達種子和野生型種子，加入20%種子消毒液（立白白衣漂漬液）浸泡8 min，使用無菌水清洗3～5次，播種于含有1%（m/V）蔗糖的1/2 MS固體培養(yǎng)基上（pH 5.8）。4 ℃處理24 h后，轉(zhuǎn)移到光照培養(yǎng)間長日照條件下（全天22 ℃，白光光照16 h，黑暗8 h）培養(yǎng)8 d左右，移栽至濕潤土壤中。使用保鮮膜覆蓋幼苗，放置在培養(yǎng)間長日照條件下，2～3 d后揭膜繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2 花青素含量的測定

在長日照條件下生長6 d的擬南芥幼苗（包括Col－0、prr5－1、prr5－2、prr7－1、prr7－2、prr5 prr7、prr5 prr9、prr5 prr7 prr9和35S：PRR5－FLAG等），于當(dāng)天光照的第10個小時（ZT 10）進行取樣并稱重（g），加入1 mL花青素提取液（甲醇、鹽酸體積比為99∶1）。4 ℃黑暗條件下振蕩24 h，13 000 r·min－1離心10 min后吸取上清液。以花青素提取液作為空白對照，使用分光光度計測量上清液在530、657 nm波長處的吸光度（A530和A657）?；ㄇ嗨叵鄬坑霉剑ˋ530-0.25×A657）g －1 FW計算（Chen et al.， 2020）。實驗至少進行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.3 擬南芥RNA提取和RT－qPCR

在長日照條件下生長6 d的擬南芥幼苗，于當(dāng)天光照的第10個小時（ZT 10）進行取樣，使用Trizol試劑提取擬南芥幼苗總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進行RT－qPCR反應(yīng)（Han et al.， 2020）。用于RT－qPCR實驗的引物如表1所示，基因表達的內(nèi)參使用擬南芥ACTIN2基因。實驗至少進行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.4 酵母雙雜交實驗 （Y2H）

使用酵母雙雜交系統(tǒng)（Hu et al.， 2019）篩選可能與生物鐘PRR蛋白相互作用的花青素合成調(diào)控蛋白。將PRR5、PRR7與PRR9的全長編碼序列克隆到pGBKT7載體，構(gòu)建質(zhì)粒BD－PRR5、BD－PRR7和BD－PRR9，并構(gòu)建分段質(zhì)粒BD－PRR51-180、BD－PRR5172-558和BD－PRR5502-558（Yang et al.， 2021）。將花青素合成調(diào)控蛋白MYB75、MYB90、MYB113、MYB114和TT8的全長編碼序列克隆到pGADT7載體，構(gòu)建質(zhì)粒AD－MYB75、AD－MYB90、AD－MYB113、AD－MYB114和AD－TT8，并構(gòu)建分段質(zhì)粒AD－MYB75－N（第1至第122個氨基酸）、AD－MYB75－C（第123至第249個氨基酸）、AD－TT8－N（第1至第358個氨基酸）和AD－TT8－C（第359至第519個氨基酸）（Xie et al.， 2016; Chen et al.， 2020）。構(gòu)建酵母雙雜交實驗所需克隆的引物如表2所示。

1.5 雙分子熒光互補實驗（BiFC Assays）

將PRR5、PRR51-180、GUS的編碼序列融合于pFGC－cYFP（Kim et al.， 2008）中，構(gòu)建質(zhì)粒PRR5－cYFP、PRR51-180－cYFP和GUS－cYFP。將MYB75、MYB90、MYB113、TT8和GUS的編碼序列融合于pFGC－nYFP（Kim et al.， 2008）中，構(gòu)建質(zhì)粒MYB75－nYFP、MYB90－nYFP、MYB113－nYFP、TT8－nYFP和GUS－nYFP。將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌（菌株為GV3101）中，取不同菌液（OD值為1.0）按1∶1體積比混合均勻，注射到生長狀態(tài)良好的本氏煙草（Nicotiana benthamiana）葉片中，在避光、濕潤的環(huán)境中放置48 h后，使用激光共聚焦顯微鏡（Olympus， Tokyo， Japan）觀察YFP和DAPI熒光（Yang et al.， 2021）。構(gòu)建BiFC實驗所需克隆的引物如表2所示。

1.6 基因ID

所涉及的擬南芥基因的ID：PRR5、AT5G24470；PRR7、AT5G02810；PRR9、AT2G46790；MYB75、AT1G56650；MYB90、AT1G66390；MYB113、AT1G66370；MYB114、AT1G66380；TT8、AT4G09820；DFR、AT5G42800；LDOX、AT4G22880；UF3GT、AT5G54060。以上基因序列信息均可在The Arabidopsis Information Resource（TAIR）網(wǎng)站中獲取。

2 結(jié)果與分析

2.1 prr5與prr7突變體幼苗中花青素含量降低

為探究生物鐘蛋白PRR是否能參與調(diào)控植物花青素的合成，觀察在1/2 MS培養(yǎng)基上生長6 d的野生型（WT）、prr5－1、prr5－2、prr7－1和prr7－2突變體擬南芥幼苗。圖1結(jié)果顯示，與野生型相比，prr5－1、prr5－2、prr7－1和prr7－2突變體幼苗中花青素積累明顯降低，表現(xiàn)為突變體幼苗莖尖顏色更淺（圖1：A）。通過花青素含量測定，發(fā)現(xiàn)與觀察到的表型相一致，野生型幼苗的花青素含量最高，prr5－1、prr5－2、prr7－1和prr7－2突變體幼苗的花青素含量顯著低于野生型幼苗，且prr5－1和prr5－2突變體幼苗的花青素含量較prr7－1和prr7－2突變體幼苗更低（圖1：B）。這表明當(dāng)PRR5和PRR7突變后，幼苗中花青素含量降低，即PRR5和PRR7可能誘導(dǎo)植物幼苗花青素的積累。為進一步驗證該結(jié)果，檢測了相關(guān)結(jié)構(gòu)基因DFR、UF3GT和LDOX的表達情況。DFR、UF3GT和LDOX是編碼花青素合成通路中關(guān)鍵酶的結(jié)構(gòu)基因，這些基因的表達直接激活花青素的生物合成，從而促進擬南芥花青素的積累。提取WT、prr5－1、prr5－2、prr7－1和prr7－2突變體幼苗總RNA后逆轉(zhuǎn)錄cDNA，并進行RT－qPCR實驗，檢測DFR等結(jié)構(gòu)基因的相對表達量。prr5－1、prr5－2、prr7－1和prr7－2突變體幼苗中DFR、UF3GT和LDOX基因的表達量顯著降低（圖1：C-E）。這表明PRR5和PRR7能夠通過誘導(dǎo)擬南芥幼苗中DFR等結(jié)構(gòu)基因的表達促進花青素的積累。

2.2 PRR5、PRR7和PRR9協(xié)同促進幼苗花青素的積累

為確定PRR5、PRR7和PRR9蛋白是否協(xié)同調(diào)控花青素生物合成，觀察了prr5 prr7、prr5 prr9和prr5 prr7 prr9等多突變體幼苗的花青素積累表型。圖2結(jié)果顯示，與野生型相比，prr雙突變和三突變體幼苗的花青素積累明顯更低，其中prr5 prr7 prr9三突變體幼苗花青素積累最低，prr5 prr7雙突變體幼苗花青素積累低于prr5 prr9雙突變體（圖2：A），通過花青素含量測定，結(jié)果與觀察到的表型相一致（圖2：B）。與prr5－1、prr5－2、prr7－1和prr7－2等單突變體相比（圖1：A，B），prr5 prr7和prr5 prr7 prr9幼苗花青素含量顯著降低，其中prr5 prr9雙突變體幼苗花青素含量略低于prr5－1和prr5－2單突變體（圖2：A，B）。檢測相關(guān)結(jié)構(gòu)基因DFR、UF3GT和LDOX的表達，與野生型相比，prr雙突變和三突變體幼苗中相關(guān)基因的表達量明顯更低，其中在prr5 prr7 prr9三突變體幼苗中表達量最低，在prr5 prr7雙突變體幼苗中的表達量低于prr5 prr9雙突變體（圖2：C-E）。這表明PRR5、PRR7和PRR9協(xié)同促進幼苗花青素的積累，prr5 prr7 prr9三突變體幼苗花青素積累更低。

2.3 過表達PRR5使幼苗中花青素含量升高

為進一步確定PRR蛋白調(diào)控植物花青素合成的生物學(xué)功能，構(gòu)建了CaMV35S啟動子驅(qū)動的過表達PRR5轉(zhuǎn)基因植物35S：PRR5－FLAG（Yang et al. 2021），篩選出表達量較高的3個純合株系（35S：PRR5－FLAG－9、35S：PRR5－FLAG－10和35S：PRR5－FLAG－15）并檢測其幼苗花青素含量。如圖3：A，B所示，與野生型相比，35S：PRR5－FLAG－9、35S：PRR5－FLAG－10和35S：PRR5－FLAG－15幼苗中花青素的積累顯著升高，表現(xiàn)為莖尖的顏色加深，呈現(xiàn)出明顯的紫紅色。PRR5過表達轉(zhuǎn)基因植物幼苗中DFR、UF3GT和LDOX基因的相對表達量顯著高于野生型（圖3：C-E）。這進一步證實了生物鐘蛋白PRR確實能夠促進植物幼苗花青素的積累。

2.4 MYB75和TT8蛋白與PRR5蛋白相互作用

為探究生物鐘PRR蛋白調(diào)控擬南芥幼苗花青素合成的分子機理，使用酵母雙雜交系統(tǒng)（Y2H）篩選可能與PRR蛋白相互作用的花青素合成相關(guān)蛋白。將PRR5、PRR7和PRR9與誘餌載體Gal4 DNA結(jié)合域載體相融合（BD－PRR5等），MYB75、MYB90、MYB113、MYB114和TT8等花青素合成相關(guān)蛋白與獵物載體的Gal4 DNA激活域融合（AD－MYB75等）。通過酵母雙雜交實驗表明，MYB75和TT8蛋白與PRR5蛋白在酵母中發(fā)生強相互作用，而MYB90、MYB113蛋白與PRR5蛋白在酵母中相互作用則較弱（圖4）。

為進一步驗證MYB75、MYB90、MYB113和TT8蛋白與PRR5蛋白的相互作用，使用雙分子熒光互補實驗（BiFC）在植物體內(nèi)進行檢測分析。將PRR5與CaMV35S啟動子驅(qū)動的C端黃色熒光蛋白（c－YFP）片段融合形成PRR5－cYFP，并將MYB75、MYB90、MYB113和TT8與N端YFP片段融合獲得MYB75－nYFP、 MYB90－nYFP、 MYB113－分別表示與WT比較有顯著差異（P＜0.05）和極顯著差異（P＜0.01）。下同。

nYFP和TT8－nYFP。將PRR5－cYFP與MYB75－nYFP、MYB90－nYFP、MYB113－nYFP或TT8－nYFP共轉(zhuǎn)化到煙草葉片中，在煙草細胞核內(nèi)檢測到強烈的熒光信號，而在相關(guān)的對照組中卻未觀察到熒光信號（圖5）。這說明PRR5能與花青素合成相關(guān)的MYB75、MYB90、MYB113和TT8蛋白在植物細胞核內(nèi)相互作用形成復(fù)合物。

2.5 MYB75和TT8蛋白與PRR5蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)域

為確定PRR5蛋白與MYB75、MYB90、MYB113和TT8蛋白相互作用所必需的區(qū)域，將突變的PRR5序列融合到Gal4 DNA結(jié)合域載體作為誘餌，并進行了酵母雙雜交分析。如圖6：A所示，PRR5蛋白的PR結(jié)構(gòu)域（BD－PRR51-180）與CCT結(jié)構(gòu)域（BD－PRR5502-558）不與MYB75、MYB90、MYB113和TT8蛋白相互作用，而PRR5蛋白C端片段（BD－PRR5172-558）與MYB75、MYB90、MYB113和TT8蛋白相互作用。這表明PRR5的C端氨基酸結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)了PRR5蛋白與MYB75、MYB90、MYB113和TT8蛋白之間的相互作用。同時，將在酵母中與PRR5蛋白強相互作用的MYB75和TT8蛋白突變?yōu)镹端和C端，融合到Gal4 DNA激活域載體，并進行酵母雙雜交分析。如圖6：B-C所示，當(dāng)MYB75和TT8蛋白的N端缺失時，它們不能與PRR5蛋白相互作用。這表明MYB75和TT8蛋白的N端氨基酸結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)了它們與PRR5蛋白之間的相互作用。

2.6 PRR5促進花青素的合成依賴于MYB家族花青素調(diào)控蛋白

前期研究發(fā)現(xiàn)，PRR蛋白與花青素合成相關(guān)的MYB75、MYB90、MYB113和TT8蛋白相互作用誘導(dǎo)花青素合成，進一步通過遺傳學(xué)實驗分析了PRR5促進花青素的合成是否依賴于MYB家族花青素調(diào)控蛋白的功能。通過擬南芥遺傳雜交的方法，構(gòu)建了myb－RNAi 35S：PRR5－FLAG的雜交材料，獲得了F3代純合植物，并分析了花青素積累的表型。如圖7所示，與myb－RNAi突變體表型一致，myb－RNAi 35S：PRR5－FLAG雜交材料幼苗中花青素的積累顯著下降，表現(xiàn)為莖尖的顏色較淺（圖7：A），通過花青素含量測定，所得結(jié)果與觀察到的表型相一致（圖7：B）。這表明PRR5促進花青素的合成依賴于MYB家族花青素調(diào)控蛋白。

3 討論與結(jié)論

生物鐘系統(tǒng)使植物可以感知和預(yù)測環(huán)境因子的周期性變化，以協(xié)調(diào)體內(nèi)代謝穩(wěn)態(tài)、生長發(fā)育與防御反應(yīng)的動態(tài)平衡，使植物在合適的時間完成其關(guān)鍵生長發(fā)育過程（Greenham & McClung， 2015; Wei et al.， 2018）。生物鐘PRR蛋白家族在調(diào)控植物生長發(fā)育和響應(yīng)逆境脅迫方面發(fā)揮了重要作用，影響幼苗光形態(tài)建成，增強擬南芥對寒冷、 干旱和鹽的耐受性等 （Kreps et al.， 2002;

Kaczorowski & Quail， 2003; Keily et al.， 2013; Liu et al.， 2013）。Yang等（2021）研究表明，生物鐘PRR蛋白在種子萌發(fā)及萌發(fā)后生長過程中促進ABA信號，在白天抑制種子萌發(fā)及萌發(fā)后生長?；ㄇ嗨卦谥参锏挚苟喾N逆境脅迫中發(fā)揮重要作用，由MYB、bHLH和WDR三類轉(zhuǎn)錄因子形成的MBW復(fù)合體是其生物合成中最關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子（Liang et al.， 2018; Li et al.， 2018）。外源環(huán)境信號如光照、溫度及內(nèi)源植物激素信號脫落酸、茉莉酸等可以通過調(diào)控花青素合成相關(guān)基因的表達影響花青素生物合成與積累（Mori et al.， 2007; Guo et al.， 2008; Xie et al.， 2016; Chen et al.， 2020）。

本研究發(fā)現(xiàn)，生物鐘PRR基因突變后擬南芥幼苗中花青素含量降低。進一步分析PRR基因雙突變體和三突變體幼苗的表型，發(fā)現(xiàn)PRR5、PRR7和PRR9協(xié)同促進幼苗花青素的積累。對PRR基因相關(guān)突變體進行RT－qPCR實驗分析結(jié)果表明，花青素合成通路重要結(jié)構(gòu)基因DFR、UF3GT和LDOX的相對表達量顯著降低，并與花青素積累表型趨勢一致。通過構(gòu)建PRR5基因過表達轉(zhuǎn)基因植物且檢測其幼苗花青素含量發(fā)現(xiàn)，過表達PRR5轉(zhuǎn)基因植物幼苗的花青素含量顯著高于野生型。因此，本研究認為生物鐘PRR蛋白能夠通過調(diào)控某些花青素合成結(jié)構(gòu)基因的表達來促進幼苗中花青素的合成。通過酵母雙雜交與BiFC實驗表明，PRR5蛋白能與花青素合成調(diào)控蛋白MYB75、MYB90、MYB113和TT8相互作用。擬南芥中的PRR蛋白家族屬于CCT（CONSTANS/CONSTANSLIKE/TOC1）大家族，它們都具有N端的PRR/RLD（RECEIVER LIKE DOMAIN）結(jié)構(gòu)域和C端的CCT結(jié)構(gòu)域（Farre & Liu， 2013）。通過分段實驗發(fā)現(xiàn)，PRR5蛋白N端的PRR結(jié)構(gòu)域和C端的CCT結(jié)構(gòu)域均不能與MYB75等調(diào)控蛋白相互作用，而包含CCT結(jié)構(gòu)域的C端結(jié)構(gòu)域卻介導(dǎo)了PRR5與MYB75等調(diào)控蛋白的相互作用。本研究還確認了與PRR5強相互作用的MYB75、TT8蛋白的N端介導(dǎo)了它們與PRR5蛋白的互作。因此，本研究認為生物鐘PRR5蛋白能夠與花青素合成調(diào)控蛋白MYB75、MYB90、MYB113和TT8等互作形成復(fù)合物。進一步構(gòu)建myb－RNAi 35S：PRR5－FLAG雜交材料后發(fā)現(xiàn)，其幼苗的花青素含量與myb－RNAi突變體基本一致，表明PRR5促進花青素的合成依賴于MYB家族花青素調(diào)控蛋白。

本研究認為擬南芥生物鐘PRR蛋白能夠促進幼苗中花青素的積累，并且可能通過PRR5與MBW復(fù)合體相互作用調(diào)控花青素的合成。本研究發(fā)現(xiàn)了生物鐘信號與花青素合成的聯(lián)系，初步揭示了生物鐘PRR蛋白促進擬南芥幼苗花青素合成的調(diào)控機制，對于深入理解生物鐘信號調(diào)控植物環(huán)境適應(yīng)性具有重要意義。種子萌發(fā)直至幼苗形態(tài)建成是植物生命周期中關(guān)鍵的發(fā)育階段，也是植物適應(yīng)環(huán)境最敏感的階段之一，極易受到外界逆境環(huán)境的脅迫而死亡。擬南芥種子屬于需光型種子，只有在土壤表層才能萌發(fā)生長，幼苗在白天更易受到強光、干旱等環(huán)境的脅迫?；ㄇ嗨厥侵参锾烊坏墓獗Ｗo劑，同時能夠增強植物抗旱的能力（Guo et al.， 2008; Ahmed et al.， 2014）。本研究認為生物鐘PRR蛋白促進幼苗花青素的合成與積累，以保護植物抵御白天可能的強光、干旱等逆境脅迫；同時PRR在白天抑制種子萌發(fā)和幼苗下胚軸伸長（Li et al.， 2020; Yang et al.， 2021），以協(xié)調(diào)防御反應(yīng)和生長發(fā)育的動態(tài)平衡，使植物安全渡過關(guān)鍵生長發(fā)育過程。然而，PRR蛋白通過MBW復(fù)合體調(diào)控花青素合成的分子機制仍需進一步解析，生物鐘PRR蛋白促進幼苗花青素合成的生物學(xué)功能在不同物種中是否具有保守性還需深入研究，這對于培育優(yōu)良品種以及作物生產(chǎn)具有重要意義。生物鐘系統(tǒng)其他蛋白是否參與調(diào)控花青素合成也有待進一步探索。

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（責(zé)任編輯 蔣巧媛）